Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkung von Streptococcus pneumoniae mit der Oberfläche von Endothelzellen wird im Blutfluss über mechanosensitive Proteine wie den Von Willebrand Factor (VWF) vermittelt. Dieses Glykoprotein verändert seine molekulare Konformation als Reaktion auf Scherspannung und setzt so Bindungsstellen für ein breites Spektrum von Wirts-Ligand-Wechselwirkungen frei. Im Allgemeinen ist die Kultivierung von primären Endothelzellen unter einem definierten Scherfluss dafür bekannt, die spezifische zelluläre Differenzierung und die Bildung einer stabilen und eng verbundenen Endothelschicht zu fördern, die der Physiologie der inneren Auskleidung eines Blutgefäßes ähnelt. . Daher erfordert die funktionelle Analyse von Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und der Wirtsvaskulatur mit mechanosensitiven Proteinen die Etablierung von Pumpensystemen, die die physiologischen Strömungskräfte simulieren können, von denen bekannt ist, dass sie die Oberfläche Gefäßzellen.

Das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Gerät ermöglicht eine kontinuierliche und pulslose Rückführung von Flüssigkeiten mit einer definierten Durchflussrate. Das computergesteuerte Luftdruckpumpensystem wendet eine definierte Scherspannung auf endotheliale Zelloberflächen an, indem es einen kontinuierlichen, unidirektionalen und kontrollierten mittleren Durchfluss erzeugt. Morphologische Veränderungen der Zellen und bakterielle Anhaftung können im Fluss mikroskopisch überwacht und quantifiziert werden, indem spezielle Kanalschlitten verwendet werden, die für die mikroskopische Visualisierung entwickelt wurden. Im Gegensatz zur statischen Zellkulturinfektion, die im Allgemeinen eine Probenfixierung vor der Immunkennzeichnung und mikroskopischen Analysen erfordert, ermöglichen die mikrofluidischen Dias sowohl den fluoreszenzbasierten Nachweis von Proteinen, Bakterien und zellulären Komponenten. nach der Probenfixierung; serielle Immunfluoreszenzfärbung; und direkte fluoreszenzbasierte Detektion in Echtzeit. In Kombination mit fluoreszierenden Bakterien und spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern bietet dieses Infektionsverfahren ein effizientes Mehrkomponenten-Visualisierungssystem für ein riesiges Spektrum wissenschaftlicher Anwendungen im Zusammenhang mit gefäßbedingten Prozessen.

Einleitung

Die Pathogenese von Pneumokokken-Infektionen ist durch eine facettenreiche Wechselwirkung mit einer Vielzahl von extrazellulären Matrixverbindungen und Komponenten der menschlichen Hämostase, wie Plasminogen und VWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Das Multidomain-Glykoprotein VWF dient als Hauptregulator einer ausgewogenen Hämostase durch Vermittlung von Thrombozytenrekrutierung und Fibrin-Inkorporation am Standort der vaskulären Thrombusbildung⁹. Wie wichtig funktionelles, aktives VWF für die Blutungskontrolle und Wundheilung ist, zeigt die von Willebrand-Krankheit, eine häufige erbliche Blutungsstörung¹⁰.

Globular VWF zirkuliert im menschlichen Blutsystem in einer Konzentration von bis zu 14,0 g/ml^11,10. Als Reaktion auf Gefäßverletzungen ist die lokale Freisetzung von VWF durch endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) deutlich erhöht^11,12. Frühere Studien zeigen, dass die Pneumokokken-Bindung an menschliche Endothelzellen und seine Produktion des porenbildenden Toxins Pneumolysin die luminale VWF-Sekretion signifikant stimuliert¹³. Die hydrodynamischen Kräfte des Blutflusses induzieren eine strukturelle Öffnung der mechanoreagierenden VWF-Domänen. Bei Durchflussraten von 10 Dyn/cm² vermehrt sich der VWF zu langen Proteinsaiten von bis zu mehreren hundert Mikrometern Länge, die am Subendothel^10,12befestigt bleiben.

Um die Funktion von multimerisierten VWF-Strings zu verstehen, die unter Scherspannung im Zusammenspiel von Pneumokokken mit der endotheliaalen Oberfläche erzeugt werden, wurde ein mikrofluidischer Zellkulturinfektionsansatz etabliert. Es wurde ein mikrofluidisches Gerät mit einem softwaregesteuerten Luftdruckpumpensystem eingesetzt. Dies ermöglichte eine kontinuierliche, unidirektionale Rezirkulation des Zellkulturmediums mit einer definierten Durchflussrate. Dabei wendete das System eine definierte Scherspannung auf die Oberfläche von Endothelzellen an, die in speziellen Kanalschlitten befestigt blieben. Dieser Ansatz ermöglichte die Simulation der Scherkraft innerhalb des Blutstroms des menschlichen Gefäßsystems, bei der VWF-Strings auf differenzierten Endothelzellen unter definierten konstanten Strömungsbedingungen erzeugt werden. Zu diesem Zweck wurden die Endothelzellen in spezifischen Kanalgleitern (siehe Materialtabelle) kultiviert, die für mikroskopische Analysen während des Durchflusses angepasst wurden. Das mikrofluidische Pumpensystem lieferte die hochdefinierte und kontrollierte Scherspannungssituation, die für die Bildung von verlängerten VWF-Strings auf der konfluenten Endothelzellschicht erforderlich ist. Nach der Stimulation der VWF-Sekretion von konfluent gewachsenen menschlichen Nabelvenenenen-Endothelzellen (HUVEC) durch Histamin-Supplementierung wurde die Saitenbildung durch Anwendung einer Scherspannung von 10 Dyn/cm²induziert. Die Scherspannung ist definiert als die Kraft, die auf die Zellschicht einwirkt. Es wird ungefähr nach Cornish et berechnet. 14 mit Gleichung 1:

Wobei die Scherspannung in Dyn/cm², b = Viskosität in (dyn)/cm², h = die Hälfte der Kanalhöhe, w = die Hälfte der Kanalbreite und die Durchflussrate in mL/min.

Das Ergebnis von Gleichung 1 hängt von den verschiedenen Höhen und Breiten der verschiedenen verwendeten Folien ab (siehe Materialtabelle). In dieser Studie wurde ein Luer-Kanalschlitten von 0,4 m verwendet, was zu einem Kammerschieberfaktor von 131,6 führte (siehe Formel 2).

Viskosität des Mediums bei 37 °C beträgt 0,0072 Dyn/cm2 und es wurde eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 verwendet. Dies führte zu einem Durchfluss von 10,5 ml/min (siehe Formel 3).

Hier wird die Anpassung und Weiterentwicklung eines mikrofluidischen Zellkultivierungsverfahrens mit einem unidirektionalen laminaren Strömungssystem zur Untersuchung und Visualisierung bakterieller Infektionsmechanismen in der Wirtsvaskulatur ausführlich beschrieben. Die Erzeugung von VWF-Strings auf Endothelschichten kann auch durch andere Pumpensysteme angeregt werden, die eine kontinuierliche und stetige Scherspannung¹⁵auftragen können.

Nach der Kultivierung von primären Endothelzellen zur Zusammenflussung und Stimulation der VWF-Stringbildung wurden pneumokokken, die rotes Fluoreszenzprotein (RFP)¹⁶ exezieren, der Endothelzellschicht unter konstanter mikroskopischer Kontrolle zugesetzt. Die Befestigung von Bakterien an VWF-Saiten an der Oberfläche von Endothelzellen wurde mikroskopisch visualisiert und mit VWF-spezifischen fluoreszierenden Antikörpern bis zu drei Stunden in Echtzeit überwacht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle von VWF als Adhäsionskofaktor zur Förderung der bakteriellen Bindung an das vaskuläre Endothel bestimmt⁸.

Neben der mikroskopischen Visualisierung von Proteinsekretion und Konformationsveränderungen könnte diese Methode eingesetzt werden, um einzelne Schritte bakterieller Infektionsprozesse in Echtzeit zu überwachen und die Menge der angeschlossenen Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten von ansteckung. Das spezifische softwaregesteuerte Pumpensystem bietet zudem die Möglichkeit, die Endothelzellen in definierten konstanten Strömungsbedingungen bis zu mehreren Tagen zu kultitoren und ermöglicht eine definierte gepulste mittlere Strömungsinkubation. Darüber hinaus kann diese Methode mit verschiedenen Zelltypen angewendet werden. Die Anpassung des Färbeprotokolls ermöglicht auch die Detektion und Visualisierung von Bakterien, die in eukaryotische Zellen verinnerlicht sind.

Dieses Manuskript beschreibt dieses fortschrittliche experimentelle Protokoll, das als definierter, zuverlässiger und reproduzierbarer Ansatz für eine effiziente und vielseitige Charakterisierung pathophysiologischer Prozesse verwendet werden kann.

Protokoll

Die mikrofluidische Zellkultivierung wurde mit kommerziellen primären menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Das Unternehmen isolierte die Zellen mit informierter Zustimmung des Spenders. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer des Landes Baden-Württemberg mit der Referenznummer 219-04 genehmigt.

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Protokolllieferungen.

1. Präkultivierung der primären Endothelzellen

1. Eine gefrorene Glyzerin-Durchstechflasche mit 1 x 10⁵ primärer HUVEC von drei verschiedenen Spendern vorsichtig bei 37 °C auftauen und die Zellen in 7 ml vorgewärmten Endothelzellwachstumsmedium (ECGM, gebrauchsfertig mit Nahrungsergänzungsmitteln) in einem 25 cm^2-Zellkolben aussäen.
   HINWEIS: Die primären Endothelzellen verlieren nach mehr als 5 Proliferationszyklen ihre Differenzierungsfähigkeit. Daher können nur Zellen mit weniger als 5 Passagen verwendet werden, wenn hohe Zelldifferenzierungsgrade erforderlich sind.
2. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%_{CO2-Atmosphäre} für 60 min, um die Oberflächenbefestigung zu ermöglichen und das ECGM-Zellkulturmedium auszutauschen, um Rückstände aus der Kryokonservierung loszuwerden.
3. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%_{CO2-Atmosphäre,} bis sie eine subkonfluente Zellschicht bilden.
   HINWEIS: Der HUVEC darf nicht zu einer konfluenten Schicht heranwachsen, da die engen Zell-Zell-Kontakte die Bildung einer stabilen Zellschicht später im Fluss verhindern.

2. Präkultivierung von Streptococcus pneumoniae

VORSICHT: Streptococcus pneumoniae ist ein Biosicherheitsmittel der Stufe 2 und darf nur in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 kultiviert werden. Verwenden Sie eine saubere Bank für Sicherheitsstufe 2 für alle bakteriellen Behandlungen klassifiziert, streng vermeiden Aerosolbildung, und verwenden Sie eine Zentrifuge mit Aerosolschutz für die Sedimentation von Bakterien.

1. Impfen Sie eine columbiaische Blut-Agar-Platte mit Streptococcus pneumoniae klinischem Isolat ATCC11733, das aus einem Glyzerinbestand gewonnen wird, der ständig bei -80 °C gelagert wird, und kultivieren Sie die Agarplatte über Nacht bei 37 °C und 5%_CO2.
2. Bereiten Sie 40 ml Todd Hewitt flüssige Brühe mit 1% Hefeextrakt (THY) und 15 ml steriler Phosphat-gepufferter Kochchen (PBS) pH 7.4 für die bakterielle Kultivierung und Waschschritte vor.
3. Verwenden Sie eine sterile Röhre für die bakterielle Kultivierung und impfen Sie die flüssige Kulturbrühe mit Bakterienmasse. Kontrollieren Sie die Impfmenge durch photometrische Messung von 1 ml Aliquots bei 600 nm gegen nicht geimpfte flüssige Brühe als Referenz. Füllen Sie die bakterielle Masse in die flüssige Brühe ein, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,15 erreicht.
4. Inkubieren Sie die geimpfte flüssige Brühe ohne Schütteln bei 37 °C und 5%_CO2 und bestimmen Sie die OD₆₀₀ alle 30 min, indem Sie 1 ml Aliquots mit Kunststoffküvetten messen.
5. Sobald die Bakterienkultur eine OD₆₀₀ von 0,4 erreicht hat, was der exponentiellen Wachstumsphase entspricht, zentrifugiert die bakterielle Kultursuspension für 10 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur (RT).
   HINWEIS: Erlauben Sie nicht, dass eine Pneumokokkenkultur eine OD₆₀₀ von mehr als 1,0 erreicht, da eine hohe Pneumokokken-Kulturdichte bekanntermaßen eine bakterielle Autolyse auslöst, die die allgemeine bakterielle Fitness beeinträchtigen könnte.
6. Das bakterielle Sediment vorsichtig mit 10 ml PBS und Sediment wieder für 10 min bei 1.000 x g bei RT aussetzen.
7. Setzen Sie das gewaschene bakterielle Sediment vorsichtig in 1 ml PBS wieder auf und bestimmen Sie die OD₆₀₀ von 10 l der bakteriellen Suspension mit 1 ml PBS als Referenz.
8. Stellen Sie die Bakterienmenge in PBS auf eine OD₆₀₀ von 2,0 ein. Nach zuvor ermittelter bakterieller Zählung entspricht eine OD₆₀₀ von 2,0 2 x 10⁹ koloniebildenden Einheiten (CFU). Gehen Sie sofort mit dem Infektionsverfahren fort, um eine bakterielle Autolyse zu verhindern.

3. Endotheliale Zellkultivierung von HUVEC unter mikrofluidischen Bedingungen

1. Lösen Sie die primären Endothelzellen durch kontrollierte Proteolyse vom Zellkulturkolben. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank aus. Bereiten Sie ein Volumen von 15 ml sterilem PBS für die Waschschritte vor.
   1. Entfernen Sie die ECGM aus einer subkonfluent gewachsenen HUVEC-Schicht und waschen Sie die Zellschicht mit 10 ml PBS mit einer serologischen Pipette, um das Zellkulturmedium loszuwerden.
   2. Inkubieren Sie den gewaschenen HUVEC mit 3 ml 37 °C vorgewärmten Zelldissoziationslösung zur Zellablösung für 5 min bei 37 °C. Beobachten Sie die proteolytische Zellablösung durch mikroskopische Überwachung jede Minute.
   3. Pipette die abgelöste Zellsuspension in ein Rohr mit 7 ml ECGM ergänzt mit 2% fetalem Kalbsserum (FCS) zum Stoppen der Proteolyse und Sediment der Zellen für 3 min bei 220 x g bei RT.
   4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie den HUVEC in 250 l ECGM, ergänzt mit 5% FCS und 1 mM MgSO_4,wieder aus. Verwenden Sie 10 l der Zellsuspension für die Zellzählung mit einer Neubauer-Zellzählkammer und passen Sie die Zellzahl auf 4 x 10⁶ Zellen/ml ECGM an, ergänzt durch 5% FCS und 1 mM MgSO₄.
      HINWEIS: Für jedes Strömungsexperiment werden 30 ml ECGM-Medium mit 5% FCS und 1 mM MgSO₄ benötigt. Von nun an heißt diese mittlere Zusammensetzung ECGMS-medium. Die Erhöhung der FCS-Konzentration im Kulturmedium von 2% auf 5% unterstützt die Zellanhaftung und Zelllebensfähigkeit von HUVEC, das im Kanalschlitten gesät wird. Das Medium ergänzt FCS und MgSO₄ stabilisiert die Zellanhaftung von HUVEC unter Scherspannungsbedingungen wesentlich.
2. Säen und kultivieren Sie den HUVEC in einer Kanalrutsche. Arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank. Die Zellen werden unter Scherstress für 2 Tage kultiviert werden, gefolgt von einer Infektion mit Bakterien und mikroskopische Überwachung für weitere 2 h.
   1. Ausgleich eines Kanalschlittens, eines Perfusionssatzes von 1,6 mm Durchmesser und 50 cm Länge, eines Aliquots des ECGMS-Mediums und eines Luer-Kanalschlittens 0,4 m in der Höhe, für 24 h in einem Inkubator mit 5 %_{CO2-Atmosphäre} bei 37 °C, um die Anzahl der Luftblasen zu reduzieren.
      HINWEIS: Dieses Verfahren wird empfohlen, um die Kunststoffausrüstung zu entgasen und das Medium, die Perfusionsrohre und die Reservoirs vorzuwärmen. Wenn Materialien oder Flüssigkeiten bei RT oder im Kühlschrank gelagert wurden, werden im Kunststoff gelöste Gase und Flüssigkeiten freigesetzt, wenn sie während des Experiments im Inkubator erhitzt werden. Dann werden Gasblasen auftreten. Die Entgasung aller Kunststoffkomponenten vor dem Experiment wird diesen Effekt eliminieren. Jedes Mal, wenn das System aus dem Inkubator genommen wird, beginnt der Prozess der Gasaufnahme wieder. Arbeiten Sie daher schnell bei RT und lassen Sie die Fluideinheit nie für längere Zeiträume außerhalb des Inkubators.
   2. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 l einer 2% sterilgefilterten Schweinegelatinelösung in PBS-Lösung in eines der Reservoirs eines temperaturgleich geausgleichten Kanalschlittens zu injizieren. Inkubieren Sie die Gelatinelösung für 1 h bei 37 °C und spülen Sie den Kanal des Dias mit 1 ml PBS unter sterilen Bedingungen mit einer 1 ml Luer Spritze ab.
   3. Legen Sie den gelatinebeschichteten Kanalschlitten auf eine dünne Polystyrol- oder Styroporplatte, um einen Rückgang der Gleittemperatur zu verhindern. Fügen Sie 100 l der 4 x 10⁶/ml HUVEC Suspension mit einer 1 ml Luer Spritze in das Dia ein.
      HINWEIS: Das Platzieren des Kanalschlittens auf der kalten Metalloberfläche der sauberen Bank könnte die Temperatur des Gleitbodens verringern und dadurch kalte Belastung der Endothelzellen erzeugen. Halten Sie während der Zellpipettierung die Folie ein wenig nach oben, um Luftblasen aufsteigen zu lassen und aus dem Inneren des Dias verschwinden zu lassen.
   4. Inkubieren Sie den Kanalschlitten mit dem HUVEC für 60 min bei 37 °C und 5%_CO2 und füllen Sie die mittleren Reservoirs an beiden Enden des Kanalschlittens mit je 60 l ECGMS-Medium. 1 h bei 37 °C und 5%_CO2inkubieren.
3. Passen Sie die mikrofluidische Pumpe und die Softwareeinstellungen an.
   1. Schließen Sie den ausgeglichenen Perfusionssatz an die Pumpeneinheit an, füllen Sie ihn mit 13,6 ml ECGMS-Medium aus, und starten Sie die Pumpensteuerungssoftware. Wählen Sie den geeigneten Perfusionssatz und die Art der Kammerrutsche mithilfe der Scroll-Down-Fenster im Menü der eingerichteten Fluideinheit aus. Wählen Sie 0.007 (dyn/cm²) in der Software für mittlere Viskosität. (Siehe die Druckpumpen-Softwareeinstellungen, die in Der Zusätzlichen Abbildung 1mit roten Pfeilen markiert sind).
   2. Schließen Sie außerhalb des Inkubators eine mit trocknenden Kieselsäureperlen gefüllte Glasflasche an die Luftdruckschläuche an (siehe Abbildung 1, Inset 3). Die Luft der Druckpumpe zirkuliert zwischen den Perfusionsbehältern und der Pumpe und muss vor dem Wiedereintritt in das Pumpengerät trocken sein. Wählen Sie Im Softwaremenü Strömungsparameter aus, stellen Sie den Druck auf 40 mbar ein, und spülen Sie die Pumpenrohre mit dem flüssigen Medium, indem Sie den kontinuierlichen mittleren Durchfluss starten. (Diese Einstellungen werden auch durch rote Pfeile in Der Zusatzabbildung 1angezeigt).
   3. Programmieren Sie die gewünschten Scherspannungszyklen der Strömungskultivierung. Beginnen Sie mit 5dyn/cm2 , steuern Sie symmetrische Reservoir pumpinng und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Pumpensystem zirkulieren.
      HINWEIS: Die Wandscherspannung in einem Kanalschlitten hängt von der Durchflussrate und der Viskosität des Perfusionsmediums ab. Wenn Sie ein anderes Pumpensystem verwenden, lesen Sie bitte die in der Einleitung beschriebenen Gleichungen, um einen Durchfluss festzulegen, der den gewünschten Scherspannungspegel erzeugt. Die beschriebenen Einstellungen entsprechen einer Durchflussrate von 5,42 ml/min. (Ein beispielhafter Screenshot, der die entsprechenden Durchflussparametereinstellungen in der Druckpumpensoftware zeigt, ist in Der Zusatzabbildung 2dargestellt).
   4. Stoppen Sie die Durchflusszirkulation in der Pumpensteuerungssoftware und halten Sie den mittleren Durchfluss im Perfusionsschlauch, indem Sie die Rohre in der Nähe der Luer-Verbindungen spannen. Schließen Sie den Kanalschlitten an, wodurch Luftblasen vermieden werden, und legen Sie die Fluideinheit mit dem angeschlossenen Kanalschlitten in einen_{CO2-Inkubator} bei 37 °C und 5%_CO2. Beginnen Sie die Scherspannung bei 5 Dyn/cm² für 30 min, um die Zellen reibungslos an die durch die Scherspannung erzeugten Kräfte anzupassen, bevor Sie den Scherspannungspegel beschleunigen (siehe Ergänzende Abbildung 3).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen im Rohrsystem oder im Schlitten nach dem Anschluss an das Rohrsystem verbleiben, da die Bewegung von Luftblasen im Durchfluss zu einer Zellablösung führen kann.
   5. Beschleunigen Sie die Scherspannung auf 10 Dyn/cm² (die in dieser Strömungseinstellung 10,86 ml/min entsprechen) und inkubieren Sie den Kanalschlitten in kontinuierlicher Scherspannung für 48 h in einem kleinen_{CO2-Inkubator} bei 37 °C und 5%_CO2, um eine Zelldifferenzierung zu ermöglichen ( Die jeweiligen Software-Settinngs sind in Der Ergänzungsabbildung 4mit roten Pfeilen gekennzeichnet.
      HINWEIS: HUVEC-Zellen neigen dazu, sich von der Kanaloberfläche zu lösen, wenn die Strömungskultivierung direkt bei 10 dyn/cm²gestartet wird. Die Zellen bleiben an der Kammeroberfläche befestigt, wenn die Strömungskultivierung mit weniger Scherspannung mit 5 Dyn/cm2 für mindestens 30 min begonnen wird, gefolgt von einer langsamen Erhöhung der Scherspannung auf die gewünschten 10 dyn/cm². Eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 ist der Mindestwert in dieser Perfusionseinstellung, der für die VWF-Stringbildung erforderlich ist.
   6. Stoppen Sie nach 24 h mikrofluidischer Zellkultivierung den mittleren Durchfluss mit der Pumpensteuerungssoftware genau dann, wenn in beiden mittleren Reservoirs ein ausgeglichener mittlerer Pegel erreicht wird. Legen Sie die Fluideinheit in eine saubere Bank und entfernen Sie 10 ml des zirkulierenden Anbaumediums der Perfusionsreservoirs mit einer 10 ml serologischen Pipette. Fügen Sie 10 ml ECGMS-Medium in die Reservoirs, um das Medium zu erneuern, legen Sie die Fluideinheit wieder in den_{CO2-Inkubator} bei 37 °C und 5%_CO2, und starten Sie den flüssigen Anbau mit der Pumpensteuerungssoftware neu.
      HINWEIS: Die Funktion der Druckpumpe kann plötzlich durch Labormaschinen wie große Zentrifugen gestört werden, was zu einer starken Magnetfeldstörung führen kann. Diese plötzliche Störung kann zu einer Zellablösung führen. Achten Sie darauf, dass solche Maschinen während des Experiments nicht in der Nähe der Druckpumpe aktiv sind.
   7. Beginnen Sie die Vorwärmung der Temperaturinkubationskammer, die das Stadium des Fluoreszenzmikroskops auf 37 °C für temperaturausgleich 24 h abdeckt, bevor die mikroskopische Visualisierung. Nachdem das Mikroskop vorgewärmt ist, starten Sie die Steuerung der Mikroskopsoftware und passen Sie die Haupteinstellungen für die fluoreszenzmikroskopische Überwachung an, indem Sie die entsprechenden Filtereinstellungen (540 nm/590 nm für die Detektion der RFP-exemitten Bakterien und 470 nm/515 nm zum Nachweis der Fluorescein-Emission der FITC-konjugierten VWF-spezifischen Antikörper). Vorwärme neine zusätzliche Heizkammer zur Inkubation der Fluideinheit bei 37 °C.
      HINWEIS: Während der Infektionsanalysen und der mikroskopischen Überwachung sollte die Temperatur des Kanalschlittens und des zirkulierenden Mediums nicht wesentlich abnehmen, da dies kalte Belastung der Zellen erzeugen würde. Im Allgemeinen reicht die Größe der Temperaturkammern, die die Mikroskopstufe abdecken, nicht aus, um die gesamte Fluideinheit abzudecken. Daher wird die Verwendung einer zusätzlichen Heizkammer empfohlen, die auf 37 °C vorgewärmt ist.
   8. Zur mikroskopischen Visualisierung legen Sie die Fluideinheit in die 37 °C vorgewärmte Heizkammer und stellen Sie den Kanalschlitten auf eine Stufe des 37 °C vorgewärmten Mikroskops.
      HINWEIS: Für die mikroskopische Visualisierung mussten die Fluideinheit und der Kanalschlitten aufgrund der begrenzten Länge der Perfusionsschläuche aus dem CO2-Inkubator entfernt werden. Wenn Infektionszeiten und mikroskopische Überwachung enußerhalb der 5%_{CO2-Atmosphäre} für die pH-Pufferung erforderlich sind, sollte ein pH-gepuffertes Medium für den mikrofluidischen Anbau verwendet werden.
   9. Kontrollieren Sie die Zellmorphologie und die Integrität der HUVEC-Schicht vor der Injektion von Histamin und Bakterien in die Durchflusszirkulation während der gesamten Zeit des Strömungsexperiments und nach Abschluss des Strömungsexperiments mit dem Hellenfeldmodus des Mikroskops.

4. Induktion von VWF-Release und Visualisierung von Multimerized VWF Strings

1. Halten Sie die Strömungseinstellung aufrecht, da eine Scherspannung von 10 dyn/cm2 erforderlich ist, um die Multimerisierung von VWF auf lange Saiten von bis zu 200 MDa auszulösen. Induzieren Sie die Freisetzung von VWF aus endothelialem WPB, indem Sie 136 l einer 100 mM Histamin-Stammlösung in das ECGMS-Medium in jizieren, das in den Perfusionsschläuchen über einen Injektionsanschluss zirkuliert. Die endgültige Konzentration von Histamin im Strömungsmedium wird 1 mM betragen. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann das Histamin alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenbehälter hinzugefügt werden.
2. Zur Immunfluoreszenzdetektion von mehrfach verkörnten VWF-Strings den Fluss stoppen, wenn ein ausgeglichener mittlerer Pegel in den Reservoirs erreicht wird, und 20 g eines VWF-spezifischen FITC-konjugierten Antikörpers in einem Volumen von 200 l PBS (pH 7,4) in die zirkulierenden 13,6 ml ECGMS-Medium mit einem Injektionsanschluss. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann der Antikörper alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenbehälter hinzugefügt werden. Daraus ergibt sich eine endende Antikörperkonzentration von 1,3 g/ml.
3. Verwenden Sie für das mikroskopische Scannen mehrerer Sichtfelder in kurzer Zeit die Fluoreszenzeinheit des Mikroskops mit einem Xenon-Fluoreszenzgerät mit 30 % Leistung und einer Epifluoreszenzkamera. Überwachen Sie die Form und Morphologie der HUVEC-Schicht mit dem hellen Feldmodus, um repräsentative Zellen auszuwählen, die für die Visualisierung von VWF-Strings geeignet sind.
4. Zur Visualisierung von grünen fluoreszierenden VWF-Strings wählen Sie im Fluoreszenzeinheitsmenü der Mikroskopsoftware (LasX) ein 63x/1,40 Ölobjektiv und einen 470 nm Detektionsfilter aus. Erstellen Sie Snapshots von Z-Stacks mit mindestens 50 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten. Zur Quantifizierung der grünen fluoreszierenden VWF-Strings zu verschiedenen Zeitpunkten scannen Sie mehrere Sichtfelder.

5. Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Befestigung an VWF-Saiten in Flow in Echtzeit

1. Quantifizieren Sie die pneumokokkende Befestigung an den AUF HUVEC-Zelloberflächen erzeugten VWF-Strings durch Immunfluoreszenznachweis.
   1. Halten Sie den Durchfluss und injizieren Sie 1,35 x 10⁸ KKR/mL RFP-exezierende Pneumokokken in einem maximalen Volumen von 1 ml in das ECGMS-Medium mit dem Injektionsanschluss. Alternativ pipette die Bakterien in das Medium im Pumpenreservoir. Starten Sie die Scherspannung bei 10 Dyn/cm2 neu, um die Bakterien im Pumpensystem zirkulieren zu lassen.
   2. Wählen Sie ein 63-faches Öl-Immersion-Objektiv für die Mikroskopvergrößerung und passen Sie die Fluoreszenzfiltereinstellungen in der Mikroskopsoftware an den RFP-Kanal (540 nm Detektionsfilter) zur Detektion von RFP-exezierenden Pneumokokken an.
   3. Zur Quantifizierung der bakteriellen Befestigung an den VWF-Strings stoppen Sie den Fluss und erstellen Sie Momentaufnahmen von Z-Stacks von mindestens 30 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten, und zählen die Menge an Pneumokokken.
   4. Verwenden Sie den einfaktoriellen Statistikalgorithmus ANOVA, um die Daten auszuwerten, gefolgt von einem post hoc zweischwanzigen, nicht gepaarten Stichprobentest für einen detaillierten statistischen Vergleich. P-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

6. Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Befestigung an VWF-Saiten nach Probenfixierung

1. Probe der Fixierung vor der Immunfluoreszenzfärbung.
   1. Stoppen Sie den Durchfluss, entfernen Sie 10 ml ECGMS-Medium aus den Pumpenbehältern und fügen Sie 10 ml PBS hinzu, ergänzt durch 5% Paraformaldehyd (PFA). Lassen Sie die PFA-Lösung 10 min bei einer Scherspannung von 10 Dyn/cm²zirkulieren.
   2. Trennen Sie den Kanalschlitten von der Pumpeneinheit.
2. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche und führen Sie die Immundetektion von VWF-Strings und angehängten Bakterien durch.
   1. Bereiten Sie 4 ml einer Waschlösung mit 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) vor, ergänzt mit 4% Saccharose für alle Waschschritte. Bereiten Sie 1 ml einer Blockierlösung vor, die 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) enthält, ergänzt durch 4% Saccharose und 2% Rinderserumalbumin (BSA) zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen.
   2. Waschen Sie den PFA-inkubierten Kanalschlitten 3x mit einer 1 ml Luer-Spritze, um 200 l der Waschlösung zu injizieren und den Schlitten 120 min bei RT mit 200-L-Blockierlösung zu inkubieren.
   3. Bereiten Sie 4 ml einer anderen Blockierlösung vor, die 100 mM Na₂CO₃enthält (pH 9.2), ergänzt durch 4% Saccharose und 0,5% BSA zur Verdünnung der Antikörper. Verwenden Sie 200 l dieser Blockierlösung, um das Pneumokokken-spezifische Kaninchenantiserum 1:100 zu verdünnen. Verdünnen Sie den VWF-spezifischen Mausantikörper 1:50 mit 200 l dieser Blockierlösung, um eine VWF-spezifische Antikörperkonzentration von 4 g/ml zu erzielen. Verdünnen Sie den AlexaFluor488-konjugierten Sekundärantikörper aus einer 2 mg/ml-Stammlösung 1:100 in 200 l PBS (pH 7,4), um eine Endkonzentration von 20 g/ml zu erzeugen.
      HINWEIS: In den beschriebenen Immunfluoreszenzeinstellungen lieferte der Antikörpernachweis optimale Ergebnisse, wenn die Antikörper im oben genannten alkalischen Karbonatpuffer verdünnt wurden. Basierend auf den bisherigen Ergebnissen sind die empfohlenen Blockierlösungen und die Menge an Antikörpern für viele Anwendungen geeignet. Verschiedene Experimente erfordern jedoch möglicherweise eine individuelle Optimierung der Antikörperkombination, der Antikörperkonzentration, der Inkubationszeit und der Konstitution des Blockierpuffers. Alternativ könnte ein phosphatgepuffertes System mit neutralem pH-Bereich als Inkubationspuffer geeignet oder sogar bevorzugt sein. Bei schwachen Fluoreszenzsignalen sollte die Konzentration von Sekundärantikörpern erhöht werden. Wenn zu viel unspezifischefluoreszenz-Hintergrundgeräusche festgestellt werden, sollte die Menge der blockierenden Substanzen erhöht werden.
   4. Für die VWF-Immunfluoreszenzfärbung den Kanalschlitten mit einer 1 ml Luer-Spritze durch Injektion von 200 l der Waschlösung 3x waschen und den Schlitten mit dem 1:50 verdünnten VWF-spezifischen Antikörper 30 min bei RT inkubieren. Danach den Kanalschlitten wieder 3x mit 200 waschen L der Waschlösung und inkubieren Sie die Rutsche mit dem 1:100 verdünnten AlexaFluor488-konjugierten mausspezifischen Antikörper für 30 min bei RT. Waschen Sie schließlich die Kanalrutsche 3x mit 200 l der Waschlösung erneut.
      HINWEIS: Die AlexaFluor-Fluorophore sind empfindlich gegenüber Bleichen. Daher sollte die Rutsche geschützt werden, indem sie während der Inkubationsschritte mit den fluorophorkonjugierten Antikörpern in einer dunklen Kammer gehalten wird.
   5. Zur Immundetektion der Pneumokokken die Rutsche mit einem 1:100 verdünnten Pneumokokken-spezifischen Kaninchenantikörper 30 min bei RT inkubieren. Anschließend die Kanalrutsche 3x mit 200 l der Waschlösung waschen und die Rutsche mit 1:100 verdünnt inkubieren. AlexaFluor568-konjugierter kaninchenspezifischer Antikörper für 30 min bei RT. Waschen Sie den Kanalschlitten wieder 3x mit 200 l der Waschlösung.
   6. Um das zelluläre Aktin-Zytoskelett mit fluoreszierendem Phalloidin zu färben, durchpermeabilisieren Sie den HUVEC durch Inkubation mit 120 l von 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT. Waschen Sie den Kanalschlitten 3x mit 200 l der Waschlösung und inkubieren Sie die Rutsche mit 120 l von 1:1.000 verdünnt AlexaFluor350-konjugiertes Phalloidin. Dieser Inkubationsschritt wird das polymerisierte Aktin-Zytoskelett visualisieren und die Überwachung der Zellform und möglicher stressinduzierter morphologischer Veränderungen ermöglichen.
   7. Waschen Sie den Kanalschlitten 3x mit 200 l der Waschlösung. Waschen Sie schließlich den Schlitten 4x mit 200 l ddH₂O und visualisieren Sie die grünen fluoreszierenden VWF-Strings, die roten fluoreszierenden Bakterien und das blaue fluoreszierende Aktin-Zytoskelett mit den entsprechenden Filtereinstellungen am Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Die Kultivierung von primärer HUVEC in einem konstanten unidirektionalen Fluss führt zur Bildung einer konfluenten und dicht gepackten Zellschicht, die die Erzeugung von zellulären WPBs fördert, die mit dem mechanosensitiven VWF^13,14gefüllt sind. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines luftdruckpumpenbasierten, pulslosen Rezirkulationssystems für die Infektionsanalyse, das die Scherstresssituation im menschlichen Blutfluss nachahmt.

Diskussion

Die Simulation der bakteriellen Interaktion mit mechanosensitiven Wirtsproteinen wie VWF erfordert ein durchwegsnutzbares Zellkultursystem, das die Erzeugung eines definierten, unidirektionalen und kontinuierlichen Flüssigkeitsflusses ermöglicht und so eine zuverlässige Scherspannung erzeugt. . Mehrere mikrofluidische Pumpensysteme wurden bereits beschrieben. Ein ausführlicher Überblick von Bergmann et al. fasst die Wesentlichen Aspekte verschiedener zwei- und dreidimensionaler Zellkulturmodelle^zusammen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Luer-Spritze	Fisher Scientific	10303002	mit 1 mL Volumen für die Gelatine-Injektion unter Verwendung des Luer-Anschlusses der Objektträger
2 mL Luer-Spritze	Sarstedt	9077136	Zum Pippieren/Injizieren von Flüssigkeiten in die Luer-Anschlüsse der Kanalkammer-Objektträger
Accutase	eBioscience jetzt Thermo Fisher	00-4555-56	Proteasemischung zur schonenden Ablösung von Endothelzellen
AlexaFluor350-konjugiertes Phalloidin	Abcam	ab176751	keine Konzentration vom Hersteller verfügbar, Stammlösung reicht für 300 Tets, Unternehmen empfiehlt die Verwendung von 100 & Mikro; L einer Verdünnung im Verhältnis 1:1.000, blaue Fluoreszenz (DAPI-Filtereinstellungen)
AlexaFluor488-konjugierter Anti-Maus-Antikörper aus Ziege	Thermo Fisher Sientific	A11001	Stammkonzentration: 2 mg/ml für die Immunfärbung von humanem VWF in mikrofluidischen Objektträgern nach PFA-Fixierung, grüne Fluoreszenz
AlexaFluor568-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziege	Thermo Fisher Scientific	A-11011	Stammkonzentration: 2 mg/mL zur Immunfärbung von Pneumokokken in mikrofluidischen Objektträgern nach pFA-Fixierung, rote Fluoreszenz
Bacto Todd-Hewitt-Bouillon	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	komplexes Bakterienkulturmedium
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilisiert, zur Herstellung von Blockierungspuffer
Zellkulturkolben mit Filter	TPP	90026	Subkultivierung von HUVEC in unbeschichteten Zellkulturkolben mit einer Oberfläche von 25 cm2
Zentrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	Schleudern von Bakterien (Volumina von >2 mL)
Zentrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	Schleudern von eukaryotischen
Zellen Zentrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	Schleudern von Bakterien (Volumina von weniger als 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	verwendet in einer Konzentration von 0,2 mg/mL zur Kultivierung von Pneumokokken, transformiert mit genetischem Konstrukt mit rotfluoreszierendem Protein und Chloramphenicol-Resistenzkassette
Klemme für Perfusionsschlauch	ibidi	10821	zum Halten der Flüssigkeit im Röhrchen vor dem Verbinden des Objektträgers mit dem Pumpensystem
CO2-Inkubator	Fisher Scientific	MIDI 40	Inkubators ist perfekt an die Größe der Fluidikeinheit mit angeschlossenem Kanalschieber angepasst und wurde für die Strömungskultivierung bei 37 Grad verwendet; C und 5% CO2
CO2-Inkubator	Sanyo	MCO-18 AIC	für die Inkubation von Bakterien und Zellen in einer definierten Atmosphäre bei 5% CO2 und 37 &/deg; C
Kolumbien Blut-Agar-Platten	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	Agar-basiertes komplexes Kulturmedium für S. pneumoniae ergänzt mit 7% Schafsblut
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter mit Druckpumpensoftware
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)	Leica	DMi8	Ein inverses Mikroskop mit einem Tisch, der von einer beheizbaren Kammer bedeckt ist, und mit einer Fluoreszenzeinheit, die mit Fluoreszenzfilter, Xenon-Lichtquelle (SP8, DMi8) und DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 Megapixel)
Di-Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	zur Verwendung für PBS-Puffer
Trocknungsmaterial	Merck	101969	orangefarbene Kieselsäurekügelchen zum Trocknen in einer Glasflasche mit einem Schlauchadapter
ECGM-Ergänzungsmischung Mix	Promocell	C-39215	Ergänzungsmischung für EKGM-Medium, erforderlich für die Präkultivierung von Endothelzellen: 0,02 ml/ml fötales Kälberserum, 0,004 ml/ml Ergänzung des Endothelzellwachstums, 0,1 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 1 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 90 & Mikro; g/mL Heparin, 1 & Mikro; g/mL Hydrocortison
ECGMS	Promocell	C-22010	EKGM ergänzt mit 5 % [w/w] FCS und 1 mM MgSO4 zur Erhöhung der Zelladhäsion
Endothelzell-Wachstumsmedium (EKGM, gebrauchsfertig)	Promocell	C-22010	Kulturmedium von HUVECs, bereits ergänzt mit allen Bestandteilen des Supplement-Mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrom jetzt	Merck S 0415	Zusatz für Zellkulturen, die für Infektionsanalysen verwendet
werden FITC-konjugierter Ziegen-Anti-Human-VWF-Antikörper	Abcam	ab8822	Stammkonzentration: 10 mg/ml, zur Immundetektion von globulären und multimerisierten VWF im Fluss
Fluidische Einheit	ibidi	10903	fluidische Einheit für die Durchflusskultivierung
Gelatine (Schweine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	zur Vorbeschichtung der Oberfläche des Mikroobjektträgerkanals
Histamindihydrochlorid	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	zur Induktion der VWF-Sekretion aus endothelialen Weibel Palade Körpern
Humane Nabelvenen-Endothelzelle (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primäre Endothelzellen von gepoolten Spendern, gelagert in flüssigem Stickstoff kristallkonserviert
Humaner VWF-spezifischer Antikörper aus Maus (monoklonal)	Santa Cruz	sc73268	Bestandskonzentration: 200 &Micro; g/mL zur Immunfärbung von VWF in mikrofluidischen Objektträgern nach PFA-Fixierung
Injektionsport		ibidi 10820	zur Injektion von Histamin oder Bakterien in den Reservoirschlauch während der Strömungszirkulation
Lichtmikroskop	Zeiss	Axiovert 35M	inverses Lichtmikroskop zur Kontrolle der eukaryotischen Zellablösung und Zellzählung mit einem 40-fachen Wasserobjektiv mit 400-facher Vergrößerung
Luer-Objektträger I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physikalisch modifizierte Objektträger für die Fludic-Kultivierung (μ – Objektträger I0,4Luer mit einer Kanalhöhe von 0,4 mm, einem Kanalvolumen von 100 μ L, einer Wachstumsfläche von 2,5 cm und einer Beschichtungsfläche von 25,4 cm2) geeignet für alle Arten von Flow-Assays, erzeugt die physikalische Behandlung eine hydrophile und haftende Oberfläche.
Magnesiumsulfat (MgSO4, unhydratisiert)	Sigma Aldrich	M7506-500G	Zur Vorbereitung von EKGMS Medium
Mikrofluidik Pumpe	ibidi	10905	Luftdruckpumpe
Neubauer Zellzählkammer	Karl Hecht GmbH & Co KG	40442002	mikroskopische Zählkammer für HUVECs
Paraformaldehyd 16% (PFA)	Elektronenmikroskopie Sciences	15710-S	zur Vernetzung von Proben
Perfusionsset	ibidi	10964	Perfusionsset Gelb/Grün hat einen Schlauchdurchmesser von 1,6 mm, eine Rohrlänge von 50 cm, ein Gesamtarbeitsvolumen von 13,6 mL, ein Totrohrvolumen von 2,8 mL und eine Reservoirgröße von 10 mL. kombiniert mit dem µ-slide L0.4Luer, bei 37 &°; C und einer Viskosität von 0,0072 dyn x s/cm2 kann ein Flussratenbereich von 3,8 mL/min bis 33,9 mL/min und eine Scherspannung zwischen 3,5 dyn/cm2 und 31,2 dyn/cm2 erreicht werden. mit einer Länge von 50 cm für mikrofluidische
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)			die Lösung wurde unter Verwendung der folgenden Chemikalien hergestellt: 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4
Kunststoffküvetten	Sarstedt	67,741	(2 x optisch) für OD-Messung bei 600 nm
Pneumokokken-spezifisches Antiserum	Pineda		gezüchtet beim Kaninchen mit hitzeinaktiviertem Streptococcus pneumoniae NCTC10319 und D39, IgG-gereinigt mit ProteinA-Sepharosesäule.
Polystyrol- oder Styroporplatte			Dies ist eine Vorsichtsmaßnahme, um Kältestress für die Zellen zu vermeiden, die in den Kanalobjektträgern ausgesät sind. Jede Art von Styropor, wie z.B. Verpackungskartonmaterial, kann verwendet werden. Die Platte könnte 0,5 cm dick sein und sollte eine Größe von 20 cm2 haben.
Kaliumchlorid (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	wird für PBS-Puffer verwendet
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computersoftware zur Steuerung der Druckpumpe, zum Einstellen der Strömungsbedingungen und zum Starten/Beenden der Strömung
Reaktionsröhrchen 1,5/2,0 mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	für Antikörperverdünnungen erforderlich
Reaktionsröhrchen mit 50 mL Volumen	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-exprimierende Pneumokokken	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae Serotyp 47 exprimierende RFP fusioniert mit ahistonähnlichem Protein, das in das Genom integriert
Serologische Pipetten 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	zum Pitieren größerer Volumina
Natriumcarbonat (Na2CO3, wasserfrei)	Sigma Aldrich	451614-25G	zur Herstellung von 100 mM Natriumcarbonatpuffer
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	zur Herstellung von PBS-Puffer
Spektralphotometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	Messung der optischen Dichte (OD) der bakteriellen Suspension bei 600 nm
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389-500G	zur Herstellung von Blockierungspuffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Wird in einer Endkonzentration von 0,1 % verdünnt in dH20 für die Permeabilisierung eukaryotischer Zellen nach PFA-Fixierung
verwendet Hefeextrakt		Oxoid LP0021	Bakterien werden im THB-Supplement mit 1% [w/w] Hefeextrakt = vollständiges bakterielles Kultivierungsmedium THY