Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung und Analyse glomerulären parietalen Epithelzellauswüchsen von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert sind. Diese Methode kann verwendet werden, um Wege zu untersuchen, die an der Proliferation und Migration von parietalen Epithelzellen beteiligt sind.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Glomeruläres Outgrowth als Ex-Vivo-Assay zur Analyse von Pfaden, die an der Parietalepithel Cell Activation beteiligt sind
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Aktivierung der Parietalepithelzelle (PEC) ist einer der Schlüsselfaktoren, die an der Entwicklung und Progression der Glomerulosklerose beteiligt sind. Die Hemmung von Wegen, die an der Aktivierung parietaler Epithelzellen beteiligt sind, könnte daher ein Werkzeug sein, um das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen abzumildern. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultur und Analyse parietaler Epithelzellauswüchse von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert wurden. Nach der Sezieren isolierter Mausnieren wird das Gewebe gehackt, und Glomeruli werden durch Sieben isoliert. Verkapselte Glomeruli werden gesammelt, und einzelne Glomeruli werden für 6 Tage kultiviert, um ein glomeruläres Auswachsen von parietalen Epithelzellen zu erhalten. Während dieser Zeit kann die Verbreitung und Migration von parietalen Epithelzellen analysiert werden, indem die Zellzahl oder die Oberfläche der auswachsenden Zellen bestimmt wird. Dieser Assay kann daher als Werkzeug verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Genexpression bei transgenen oder Knockout-Mäusen oder die Auswirkungen von Kulturbedingungen auf parietale Epithelzellwachstumseigenschaften und Signalisierung zu untersuchen. Mit dieser Methode können wichtige Wege untersucht werden, die am Prozess der parietalen Epithelzellaktivierung und damit bei Glomerulosklerose beteiligt sind.
Einleitung
Glomeruläre Erkrankungen sind eine wichtige Gruppe von Nierenerkrankungen und stellen eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) dar. Leider sind spezifische Behandlungsmöglichkeiten begrenzt, und der Übergang zum ESRD ist unvermeidlich. Glomeruläre Erkrankungen werden durch das Vorhandensein von glomerulären Verletzungen definiert und können in entzündlichen und nicht-entzündlichen Erkrankungen gruppiert werden. Obwohl die anfängliche Beleidigung anders ist, haben neuere Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer zellulärer Mechanismus zu glomerulärer Epithelzellhyperplasie und letztlich zu Glomerulosklerose bei allen glomerulären Erkrankungen führt, un....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Tierethikkommission der Radboud Universität Nijmegen durchgeführt.
HINWEIS: Unbehandelte, gesunde Wildtyp-Mäuse (n = 4) und cd44-/- (n = 4) Mäuse wurden im Alter von 12 bis 16 Wochen geopfert. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet. Alle Mäuse waren auf dem C57Bl/6 Hintergrund.
1. Maus-Nieren-Sektion
- Opfern Sie gesunde WT-Mäuse oder genetisch veränderte Mäuse durch zervikale Dislokation.
- Sezieren Sie ganze Mausnieren direkt nach dem Opfern der Mäuse. Führen Sie dazu eine mediane Laparotomie mit einer Bauchschere ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 1zeigt ein systematisches Diagramm der Methode zur Durchführung des glomerulären Auswuchs-Assays. Abbildung 2A-D zeigt glomeruläre Auswüchse von gekapselten Glomeruli zu verschiedenen Zeitpunkten, wie sie mit der Lichtmikroskopie beobachtet wurden. Auswüchse werden an Tag 2, 4 und 6 (Abbildung 2B-D) in der Kultur nach Glomerulus-Isolierung von der Mausniere.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll kann man einzelne gekapselte Glomeruli verwenden, um die parietale Epithelzellproliferation zu bewerten, die eine Folge der parietalen Epithelzellaktivierung ist. Dieses Ex-vivo-Modell wird es uns ermöglichen, die molekularen Bahnen, die an der parietalen Epithelzellaktivierung beteiligt sind, im Detail zu untersuchen. Die beschriebene Methode beruht auf dem einfachen Konzept der Nierensektion und Siebung, um verkapselte Glomeruli zu isolieren und zu kulturieren und die P.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von der Niederländischen Nierenstiftung (Grant 14A3D104) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO VIDI-Stipendium: 016.156.363) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24-Well-Zellkulturplatte | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelzellmarker (verwendete Konzentration 1:200) | |
| Huhn-Anti-Ratte Alexa 647 | Thermo Fisher | ( verwendete Konzentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Einbettmedium mit DAPI | |
| Digitales inverses Lichtmikroskop | Westburg, EVOS fl Mikroskop | ||
| Esel-Anti-Ziege Alexa 568 | Thermo Fisher | ( verwendete Konzentration 1:200) | |
| Esel-Anti-Kaninchen Alexa 568 | Thermo Fisher | ( verwendete Konzentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots Kit | Lonza | mit Hydrocortison, hEGF, GA-1000, FBS und BBE | |
| Fetal Rinderserum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluoreszenzmikroskop | Leica Microsystems GmbH | ||
| ziegen-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podozytenmarker (verwendete Konzentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| Petrischale | Sarstedt | Größe 100 | |
| Kaninchen-anti-claudin1 | Abcam | Parietaler Epithelzellmarker (verwendete Konzentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. E. Gelman, Parietaler Epithelzellmarker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietaler Epithelzellmarker (verwendete Konzentration 1:200) | |
| Skalpell | Dahlhausen | Größe 10 | |
| Siebe | Endecotts Ltd | Größe 300 µ m, 75 µ m, 53 µ m, Stahlspritze | |
| BD Plastipak | Größe: 20 ml | ||
| Mikrotiterplatten mit ultraniedrigem Aufsatz | Corning Costar | 6-Well-Platten |
Referenzen
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
