Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

Zusammenfassung

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie zur In-vitro-Produktion von Proteinen. Wenn CFPS jedoch über das Labor hinausgehen und zu einem weit verbreiteten und standardgerechten Fertigungstechnologie werden, müssen wir die Leistungsgrenzen dieser Systeme verstehen. Zu dieser Frage haben wir ein robustes Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode verwendet interne Standards mit ¹³C-Aniline markiert, während Verbindungen in der Probe mit ¹²C-Aniline derivatisiert werden. Die internen Standards und Proben wurden durch die umgekehrte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) gemischt und analysiert. Die Ko-Elution von Verbindungen eliminierte die Ionenunterdrückung, was eine genaue Quantifizierung der Metabolitenkonzentrationen über 2-3 Größenordnungen ermöglichte, wobei der durchschnittliche Korrelationskoeffizient 0,988 betrug. Fünf der vierzig Verbindungen wurden mit Aniline nicht markiert, wurden jedoch noch in der CFPS-Probe nachgewiesen und mit einer Standardkurvenmethode quantifiziert. Der chromatographische Lauf dauert ca. 10 min. Zusammen genommen haben wir eine schnelle, robuste Methode entwickelt, um 40 Verbindungen, die an CFPS beteiligt sind, in einem einzigen LC/MS-Lauf zu trennen und genau zu quantifizieren. Die Methode ist ein umfassender und genauer Ansatz zur Charakterisierung des zellfreien Stoffwechsels, so dass wir letztendlich die Ausbeute, Produktivität und Energieeffizienz zellfreier Systeme verstehen und verbessern können.

Einleitung

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine vielversprechende Plattform für die Herstellung von Proteinen und Chemikalien, eine Anwendung, die traditionell lebenden Zellen vorbehalten ist. Zellfreie Systeme werden aus rohen Zellextrakten abgeleitet und eliminieren die Komplikationen im Zusammenhang mit dem Zellwachstum¹. Darüber hinaus ermöglicht CFPS den direkten Zugang zu Metaboliten und biosynthetischen Maschinen ohne Die Interferenz einer Zellwand. Es fehlt jedoch an einem grundlegenden Verständnis der Leistungsgrenzen zellfreier Prozesse. Hochdurchsatzmethoden zur Metabolitenquantifizierung sind wertvoll für die Charakterisierung des Stoffwechsels und entscheidend für den Aufbau metabolischer Rechenmodelle^2,3,4. Häufige Methoden zur Bestimmung der Metabolitenkonzentrationen sind Kernspinresonanz (NMR), Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), enzymbasierte Assays und Massenspektrometrie (MS)^{5,6,7 ,8}. Diese Methoden sind jedoch oft durch ihre Unfähigkeit, mehrere Verbindungen gleichzeitig effizient zu messen, begrenzt und erfordern oft eine Probengröße, die größer ist als typische zellfreie Reaktionen. Beispielsweise können enzymbasierte Assays oft nur zur Quantifizierung einer einzelnen Verbindung in einem Lauf verwendet werden und sind begrenzt, wenn die Stichprobengröße klein ist, z. B. bei zellfreien Proteinsynthesereaktionen (in der Regel auf einer Skala von 10-15 L). In der Zwischenzeit erfordert NMR eine hohe Fülle von Metaboliten für die Detektion und Quantifizierung⁵.  Angesichts dieser Unzulänglichkeiten bieten Chromatographiemethoden in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC/MS) mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit und die Fähigkeit, mehrere Arten gleichzeitig zu messen⁹; Die analytische Komplexität nimmt jedoch erheblich zu, da die Anzahl und Vielfalt der Arten gemessen wird. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die das Hohe Durchsatzpotenzial von LC/MS-Systemen voll ausschöpfen. Verbindungen in einer Probe werden durch flüssige Chromatographie getrennt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Das Signal der Verbindung hängt von seiner Konzentration und Ionisationseffizienz ab, wobei die Ionisation zwischen Verbindungen variieren kann und auch von der Probenmatrix abhängen kann.

Die gleiche Ionisationseffizienz zwischen der Probe und den Standards zu erreichen, ist eine Herausforderung, wenn LC/MS zur Quantifizierung von Analyten verwendet wird. Darüber hinaus wird die Quantifizierung mit der Metabolitenvielfalt aufgrund der Signalspaltung und Heterogenität in Protonenaffinität und Polarität¹⁰schwieriger. Schließlich kann die Co-Eluing-Matrix der Probe auch die Ionisierungseffizienz der Verbindungen beeinflussen. Um diese Probleme zu lösen, können Metaboliten chemisch ableitungsiert werden, wodurch die Trennungsauflösung und Empfindlichkeit durch LC/MS-Systeme erhöht wird, während gleichzeitig die Signalspaltung in einigen Fällen^10,11verringert wird. Chemische Derivatisierung funktioniert durch Tagging bestimmte funktionelle Gruppen von Metaboliten, um ihre physikalischen Eigenschaften wie Ladung oder Hydrophobizität anzupassen, um die Ionisationseffizienz zu erhöhen¹¹. Verschiedene Tagging-Mittel können verwendet werden, um verschiedene funktionelle Gruppen (z.B. Aumine, Hydroxyle, Phosphate, Carbonsäuren usw.) anzusprechen. Aniline, ein solches Derivatisierungsmittel, zielt auf mehrere funktionelle Gruppen gleichzeitig ab und fügt eine hydrophobe Komponente in hydrophile Moleküle ein, wodurch ihre Trennungsauflösung und das Signal¹²erhöht werden. Um den Co-Eluing-Matrix-Ionenunterdrückungseffekt zu beheben, entwickelten Yang und seine Mitarbeiter eine Technik, die auf der Group Specific Internal Standard Technology (GSIST)-Kennzeichnung basiert, bei der Standards mit ¹³C-Aniline-Isotopen markiert und mit der Probe ^{gemischt werden. 12,13}. Der Metabolit und der entsprechende interne Standard haben die gleiche Ionisationseffizienz, da sie ko-elute, und ihr Intensitätsverhältnis kann verwendet werden, um die Konzentration in der experimentellen Probe zu quantifizieren.

In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode basiert auf dem GSIST-Ansatz, bei dem wir ¹²C-Aniline und ¹³C-Aniline verwendet haben, um Metaboliten mit umgekehrter Phase LC/MS zu markieren, zu erkennen und zu quantifizieren. Der lineare Bereich aller Verbindungen umfasste 2-3 Größenordnungen mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,988. Somit ist die Methode ein robuster und genauer Ansatz, um den zellfreien Stoffwechsel und möglicherweise Vollzellextrakte abzuhören.

Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien zur Aniline-Kennzeichnung

1. Bereiten Sie eine 6 M Anilinelösung bei pH 4,5 vor. In einer Haube arbeiten, kombinieren Sie 550 l Aniin mit 337,5 l LCMS-Wasser und 112,5 l 12 M Salzsäure (HCl) in einem Zentrifugenrohr. Vortex gut und lagern bei 4 °C.
   HINWEIS: Aniline kann 2 Monate lang bei 4 °C gelagert werden.
   VORSICHT: Aniline ist hochgiftig und sollte mit einer Dunstabzugshaube bearbeitet werden. Salzsäure ist hochkorrosiv
2. Bereiten Sie eine 6 M ¹³C Anilinelösung bei pH 4,5 vor. Kombinieren Sie 250 mg ¹³C 6-Aniin mit 132 l Wasser und 44 l von 12 M HCl. Vortex gut und lagern bei 4 °C.
3. Bereiten Sie 200 mg/ml N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) Lösung vor. Lösen Sie 2 mg EDC in 10 l Wasser für jede Probe, die getaggt werden soll, und wirbeln Sie gut.
   HINWEIS: EdC-Lösung sollte am selben Tag wie die Reaktion vorbereitet werden. EDC wirkt als Katalysator für die Ableitung von Verbindungen mit Aniline¹².

2. Vorbereitung von Normen

1. Stellen Sie separate Lagerlösungen für alle Verbindungen vor, die in LC/MS-Wasser gelöst sind (Tabelle 1).
2. Erstellung einer internen Standard-Lagerlösung
   1. Kombinieren Sie alle Verbindungen mit Ausnahme von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Acetyl-Coenzym A (ACA) und Glycerin-3-Phosphat (Gly3P) mit den entsprechenden eine 2 mM Stofflösung aller Compounds zu erstellen.
3. Kombinieren Sie NAD, NADP, FAD, ACA und Gly3P mit den entsprechenden Volumes, um eine 2 mM-Lagerlösung zu erstellen.

3. Vorbereitung der Probe (Abbildung 1)

1. Die Proteine in einer zellfreien Proteinsynthesereaktion zu löschen und auszufällen, indem sie der Reaktion ein gleiches Volumen eiskaltes 100% Ethanol hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr.
   ANMERKUNG: Proben können an dieser Stelle bei -80 °C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden

4. Etikettierreaktion

1. Etikettierprobe mit ¹²C-Aniline-Lösung
   1. Übertragen Sie die Probe mit 6 l in ein neues Zentrifugenrohr und bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 50l.
      HINWEIS: Der Volumenstichprobenumfang kann von der spezifischen CFPS-Reaktion abhängen.
   2. Fügen Sie 5 l von 200 mg/ml EDC-Lösung hinzu.
   3. Fügen Sie 5 L ^{von 12}C-Aniline-Lösung hinzu.
      HINWEIS: Die Anilinelösung gliedert sich in zwei Phasen. Mischen Sie gut, bevor Sie die Reaktion hinzufügen.
   4. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für 2 h bei Raumtemperatur.
   5. Nach 2 h die Rohre aus dem Shaker nehmen und 1,5 l Triethylamin (TEA) in einer Dunstabzugshaube zur Reaktion hinzufügen.
      HINWEIS: Triethylamin erhöht den pH-Wert der Lösung, die die Aniline-Tagging-Reaktion stoppt und die Verbindungen stabilisiert.
      VORSICHT: Triethylamin ist giftig und verursacht Reizungen der Augen und Atemwege.
   6. Zentrifuge bei 13.500 x g für 3 min.
2. Kennzeichnung interner Standards mit ¹³C-Aniline-Lösungen
   1. Verdünnung der internen Lagerlösung auf 80 m mit einem Endvolumen von 50 l.
      ANMERKUNG: Die Konzentration interner Standards kann auf Niveaus in der Nähe der Versuchsprobe angepasst werden.
   2. Fügen Sie 5 l von 200 mg/ml EDC-Lösung hinzu.
   3. Fügen Sie 5 L ^{von 13}C-Aniline-Lösung.
   4. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für 2 h bei Raumtemperatur.
   5. Nach 2 h die Rohre vom Shaker entfernen und 1,5 L TEA in einer Dunstabzugshaube zur Reaktion hinzufügen.
   6. Zentrifuge bei 13.500 x g für 3 min.
3. Kombinieren von getaggtem internen Standard und getaggtem Beispiel
   1. Mischen Sie 25 l ¹²C-Aniline-beschriftete Probe mit 25 l ^{von 13}C-Aniline-beschrifteten Standard.
   2. Übertragen Sie auf eine Auto-Sampler-Durchstechflasche und analysieren Sie sie nach dem LC/MS-Verfahren.
4. Erstellen einer Standardkurve für nicht markierte Metaboliten
   1. Verdünnung der Stammlösung von nicht markierten Metaboliten (NAD, NADP, FAD, ACA und Gly3P) auf Endkonzentrationen von 320 M, 80 m, 20 m und 5 M bei einem Volumen von 50 l.
   2. Fügen Sie 5 l von 200 mg/ml EDC-Lösung hinzu.
   3. Fügen Sie 5 L ^{von 12}C-Aniline-Lösung hinzu.
   4. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für 2 h bei Raumtemperatur.
   5. Nach 2 h die Rohre vom Shaker entfernen und 1,5 L TEA in einer Dunstabzugshaube zur Reaktion hinzufügen.
   6. Zentrifuge bei 13.500 x g für 3 min.
   7. Überstand auf eine Auto-Sampler-Durchstechflasche übertragen und nach dem LC/MS-Verfahren analysieren.
      HINWEIS: Die nicht markierten Metaboliten folgen dem gleichen Verfahren wie die Probe, um die Probenmatrix zu replizieren, um eine ähnliche Ionisierungseffizienz aufrechtzuerhalten.

5. Einrichtung des LC/MS-Verfahrens

1. Herstellung von Lösungsmitteln
   1. Bereiten Sie 5 mM Tri-Butylamin (TBA) wässrige Lösung auf pH 4,75 mit Essigsäure eingestellt.
      HINWEIS: TBA in der mobilen Phase hilft den Analyten eine gute Auflösung und Trennung¹⁴zu erreichen.
   2. Bereiten Sie 5 mM TBA in Acetonitril (ACN).
   3. Bereiten Sie Waschlösungsmittel mit 5% Wasser und 95% ACN vor.
   4. Spüllösungsmittel mit 95% Wasser und 5% ACN aufbereiten.
2. Einrichtung von MS-Bedingungen
   1. Stellen Sie das Massenspektrometer auf den negativen Ionenmodus mit einer Sondentemperatur von 520 °C, einer negativen Kapillarspannung von -0,8 kV, einer positiven Kapillarspannung von 0,8 kV und stellen Sie die Software ein, um Daten auf 5 Punkte/s zu erfassen.
   2. Legen Sie ausgewählte Ionenaufzeichnungen (SIR) für jeden Metaboliten mit angegebenen Kegelspannungen und Massenüberladungswerten (m/z) fest. Siehe Tabelle 1.
3. Initialisierung von LC/MS gemäß Herstelleranleitung
   1. Prime Lösungsmittellinien im Lösungsmittelmanager für 3 min.
   2. Prime Waschlösungsmittel (5% Wasser, 95% ACN) und Spüllösungsmittel (95% Wasser, 5% ACN) für 15 s für 5 Zyklen.
   3. Stellen Sie den Probenmanager auf 10 °C ein.
   4. Installieren Sie eine C18-Säule (1,7 mm, 2,1 mm x 150 mm) und initialisieren Sie die Säule mit 100 % ACN bei 0,3 mL/min für 10 min.
   5. Konditionieren Sie die Säule bei 95% Wasser und 5% ACN bei 0,3 ml/min für 10 min vor der Einführung von Lösungsmitteln mit Puffern.
   6. Konditionieren Sie die Säule bei 95% Lösungsmittel A (5mM TBA wässrig, pH 4,75) und 5% Lösungsmittel B (5 mM TBA in ACN) bei 0,3 ml/min für 10 min.
   7. Aufbau eines Gradientenprotokolls mit der Elution ab 95% Lösungsmittel A und 5% Lösungsmittel B, erhöht auf 70% Lösungsmittel B in 10 min, erhöht auf 100% Lösungsmittel B in 2 min und gehalten bei 100% Lösungsmittel B für 3 min. Rückkehr zu Ausgangsbedingungen (95% Lösungsmittel A , 5% Lösungsmittel B) über 1 min und halten Sie für 9 min, um die Säule wieder auszuausgleichen.
   8. Konditionieren Sie die Spalte mit dem Gradientenprotokoll dreimal vor Injektionen auf die Spalte.
4. Injektion von Proben und Standards
   1. In jizieren Sie 5 l der Probe in die Spalte und erfassen Sie die entsprechenden m/z Ionenintensitäten für die ¹²C-Aniline-markierte Probe.
   2. Injizieren Sie 5 l der gleichen Probe erneut, erfassen Sie aber dieses Mal die m/z-Ionenintensitäten für die ¹³C-Aniline-markierten Standards.
      HINWEIS: Unser LC/MS-System ist nicht in der Lage, sowohl ¹²C- als auch ¹³C-m/z-Intensitäten in den angegebenen SIR-Zeitfenstern zu erfassen, da es zu viele Daten ist, die im angegebenen Zeitfenster erfasst werden können. Daher injizieren wir die gleiche Probe zweimal.
   3. Injizieren Sie nicht markierte Metabolitenstandards von der niedrigsten Konzentration auf die höchste Konzentration und erfassen Sie die entsprechenden m/z Ionenintensitäten.

6. Quantifizierung

1. Exportieren-Methode erstellen
   1. Wählen Sie in der Datenerfassungssoftware Datei > Neue Methode > Exportmethodeaus.
   2. Geben Sie einen Dateinamen an, z. B. AnilineTagging_Date.
   3. Überprüfen Sie die ASCII-Datei exportieren, und wählen Sie ein Verzeichnis aus, in das die Textdatei exportiert werden soll.
   4. Wählen Sie im Berichtstyp Zusammenfassung nach Alleaus.
   5. Wählen Sie unter Trennzeichenfür Spalte eine aus. Wählen Sie für Zeile [cr][if]aus.
   6. Wählen Sie in Tabelle aus, und bearbeiten Sie dann die Tabelle, um SampleName, Bereich, Höhe, Betrag und Einheiteneinzuschließen .
   7. Exportmethode speichern.
2. Quantifizierung von Metaboliten mit internen Standards mithilfe von Datenerfassungssoftware
   1. Klicken Sie auf der Registerkarte Sample Sets mit der rechten Maustaste auf die entsprechende LC/MS-Ausführung, und wählen Sie Ansicht als > Kanäle aus.
   2. Wählen Sie alle SIR-Kanäle für die ¹³C-Aniline-internen Standards einer Injektion aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Überprüfenaus.
   3. Wenn das Fenster LC-Verarbeitungsmethodenlayout nicht automatisch angezeigt wird, wechseln Sie zu Anzeigen > Verarbeitungsmethodenlayout.
   4. Wechseln Sie im Verarbeitungsmethodenlayoutzur Registerkarte Integration, und legen Sie ApexTrack als Algorithmus fest.
   5. Wechseln Sie zur Registerkarte Glätten, und legen Sie den Typ auf Mittelwert und die Glättungsstufe auf 13fest.
      HINWEIS: Jede Glättungsstufe kann ausgewählt werden, solange sie in allen Proben konsistent ist.
   6. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte MS Channel die MS 3D-Verarbeitung .
   7. Integrieren Sie im SIR-Kanalfenster jeden Peak, jeweils einen Kanal. Sobald ein Peak integriert ist, gehen Sie zu Optionen > Füllen aus Ergebnis und die Details der Spitze werden auf der Registerkarte Komponenten ausgefüllt. Ändern Sie den Peak-Namen in den entsprechenden zusammengesetzten Namen.
   8. Nachdem alle SIR-Kanäle ausgewertet wurden, speichern Sie die Verarbeitungsmethode und schließen Sie das Fenster.
   9. Wählen Sie alle SIR-Kanäle des ¹³C-Aniline- und ¹²C-Aniline-Getagt-Beispiels aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Prozessaus.
   10. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess, wählen Sie Angegebene Verarbeitungsmethode verwendenaus, und wählen Sie die Verarbeitungsmethode aus, die gerade gespeichert wird. Aktivieren Sie auch das Kontrollkästchen Exportieren, wählen Sie Angegebene Exportmethode verwenden aus, und wählen Sie die zuvor erstellte gespeicherte Exportmethode aus. Klicken Sie auf OK.
   11. Öffnen Sie die exportierte Textdatei mit Excel und berechnen Sie die Konzentration der unbekannten Verbindung mit:
       
       wobei C_x,i die Konzentration der unbekannten Probe für Metaboliten i, A_x,i ist der integrierte Bereich des unbekannten Metaboliten i, A_std,i ist der integrierte Bereich des internen Standards von Metaboliten i, C_std,i ist die Konzentration des internen Standards von Metabolit i, und D ist der Verdünnungsfaktor.
3. Quantifizierung nicht markierter Metaboliten mit Standardkurve
   1. Klicken Sie auf der Registerkarte Sample Sets mit der rechten Maustaste auf die entsprechende LC/MS-Ausführung, und wählen Sie Ansicht als > Kanäle aus.
   2. Wählen Sie alle SIR-Kanäle für die nicht markierten Standards einer Injektion aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Überprüfenaus.
   3. Wenn das Fenster LC-Verarbeitungsmethodenlayout nicht automatisch angezeigt wird, wechseln Sie zu Anzeigen > Verarbeitungsmethodenlayout.
   4. Wechseln Sie im Verarbeitungsmethodenlayout zur Registerkarte Integration, und legen Sie ApexTrack als Algorithmus fest.
   5. Wechseln Sie zur Registerkarte Glätten, und legen Sie den Typ auf Mittelwert und die Glättungsstufe auf 13fest.
      HINWEIS: Jede Glättungsstufe kann ausgewählt werden, solange sie in allen Proben konsistent ist.
   6. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte MS Channel die MS 3D-Verarbeitung .
   7. Integrieren Sie im SIR-Kanalfenster jeden Peak, jeweils einen Kanal. Sobald ein Peak integriert ist, gehen Sie zu Optionen > Füllen aus Ergebnis und die Details der Spitze werden auf der Registerkarte Komponenten ausgefüllt. Ändern Sie den Peak-Namen in den entsprechenden zusammengesetzten Namen.
   8. Nachdem alle SIR-Kanäle ausgewertet wurden, speichern Sie die Verarbeitungsmethode und schließen Sie das Fenster.
   9. Klicken Sie unter der Registerkarte Sample Sets mit der rechten Maustaste auf den Sample-Set, und wählen Sie Alter Sampleaus.
   10. Wählen Sie Betrag im neuen Fenster aus.
   11. Wählen Sie Kopieren aus der Prozessmethode aus, und wählen Sie die Prozessmethode aus, die gerade gespeichert wurde.
   12. Geben Sie die Konzentration jedes Metaboliten für jede Durchstechflasche ein, und geben Sie die Einheit als <-M für jede Komponente (oder die entsprechende Einheit) ein und wählen Sie OK.
   13. Wählen Sie das Sample-Set erneut aus, mit der rechten Maustaste, Als > Kanäle anzeigen.
   14. Wählen Sie alle SIR-Kanäle der nicht markierten Metaboliten für die Standards aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Prozessaus.
   15. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess, und wählen Sie Angegebene Verarbeitungsmethode verwendenaus. Wählen Sie die entsprechende Verarbeitungsmethode aus, und klicken Sie auf OK.
   16. Wählen Sie SIR-Kanäle für alle nicht markierten Metaboliten für die Samples, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Prozessaus.
   17. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess, wählen Sie Angegebene Verarbeitungsmethode verwenden aus, und wählen Sie die Verarbeitungsmethode aus, die gerade gespeichert wurde. Aktivieren Sie auch das Kontrollkästchen Exportieren, wählen Sie Angegebene Exportmethode verwenden aus, und wählen Sie die zuvor erstellte gespeicherte Exportmethode aus. Klicken Sie auf OK.
   18. Quantifizieren Sie die nicht markierten Metaboliten mit der Standardkurve, und exportieren Sie die Ergebnisse in eine Textdatei in das angegebene Verzeichnis.

Ergebnisse

Als Proof-of-Concept haben wir das Protokoll verwendet, um Metaboliten in einem E. coli-basierten CFPS-System zu quantifizieren, das grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exemittiert.  Die CFPS-Reaktion (14 l) wurde abgeschreckt und mit Ethanol deproteinisiert. Die CFPS-Probe wurde dann mit ¹²C-Aniline markiert, während Standards mit ¹³C-Aniline markiert wurden. Die markierte Probe und die Standards wurden dann kombiniert und in das LC/MS injiziert (Abbildung 1...

Diskussion

Zellfreie Systeme haben keine Zellwand, so dass es direkten Zugang zu Metaboliten und den biosynthetischen Maschinen ohne komplexe Probenvorbereitung gibt. Es wurde jedoch nur sehr wenig an der Entwicklung gründlicher und robuster Protokolle zur quantitativen Abhörung zellfreier Reaktionssysteme gearbeitet. In dieser Studie haben wir eine schnelle, robuste Methode zur Quantifizierung von Metaboliten in zellfreien Reaktionsgemischen und potenziell in Ganzzellextrakten entwickelt. Die individuelle Quantifizierung von Metab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12C Anilin	Sigma-Aldrich	242284	Anilin 12C
13C markiertes Anilin	Sigma-Aldrich	485797	Anilin 13C6
3-Phosphoglycerinsäure	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Essigsäure	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitril, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetyl-Coenzym A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1,7 μ M, 2,1 x 150 mm Säule	Wasser	186002353	Säule
Adenosindiphosphat	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adenosinmonophosphat	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Adenosintriphosphat	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alpha-Ketoglutarat	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citrat	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Cytidindiphosphat	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Cytidinmonophosphat	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Cytidintriphosphat	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-Glycerinaldehyd 3-phosphat	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Erythrose 4-phosphat	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Ethanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Zentrifuge	FisherScientific		Zentrifuge
Flavinadenindinukleotid	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fruktose 1,6-bisphosphat	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fruktose 6-phosphat	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumarat	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconat 6-phosphat	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glukose	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glukose 6-phosphat	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
Glycerin 3-phosphat	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Guanosindiphosphat	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Guanosinmonophosphat	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Guanosintriphosphat	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Salzsäure	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitrat	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Laktat	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malat	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Zellfreie Proteinsynthese
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamid-Adenindinukleotidphosphat reduziert	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid reduziert	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacetat	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Phosphoenolpyruvat	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Pyruvat	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribose 5-phosphat	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulose 5-phosphat	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulose 7-phosphat	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinat	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributylamin	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Triethylamin	FisherScientific	O4884	TEA
Reinstwasser	FisherScientific	10977-015	Wasser
Uridindiphosphat	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Uridinmonophosphat	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Uridintriphosphat	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex	VWR		Vortex
Wasser, LCMS	JT BAKER	9831-03	WASSER
Wasser Acquity H UPLC Klasse Quaternär Lösungsmittel Manager	Wasser		LCMS
Wasser Acquity H UPLC Klasse Probenmanager FTN	Wasser		LCMS
Waters Acquity Qda-Detektor	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Fläschchen mit vollständiger Rückgewinnung	Wasser	186000384c	LCMS-Fläschchen