Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Summary

Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.

Abstract

Menschliche embryonale Stammzellen zeigen eine einzigartige Fähigkeit, auf Morphogene in vitro zu reagieren, indem sie selbstorganisierende Muster der Zellschicksalsspezifikation, die der primären Keimschichtbildung während der Embryogenese entsprechen. Somit stellen diese Zellen ein mächtiges Werkzeug dar, mit dem die Mechanismen untersucht werden können, die die frühe menschliche Entwicklung vorantreiben. Wir haben eine Methode entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu kultivieren, die sowohl die Geometrie der Kolonien als auch ihre mechanische Umgebung kontrolliert, um die physikalischen Parameter zu rekapitulieren, die embryogenese. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die Fähigkeit, Polyacrylamid-Hydrogele mit definierten Mustern von extrazellulärem Matrixliganden an der Oberfläche zu erzeugen, um die Zellanhaftung zu fördern. Dies wird erreicht, indem Schablonen mit den gewünschten geometrischen Mustern hergestellt, diese Schablonen verwendet werden, um Muster aus extrazellulärem Matrixliganden auf Glasabdeckungen zu erzeugen, und diese Muster während der Polymerisation auf Polyacrylamid-Hydrogele übertragen werden. Diese Methode ist auch mit der Traktionskraftmikroskopie kompatibel, so dass der Benutzer die Verteilung der zellgenerierten Kräfte innerhalb der begrenzten Kolonien messen und abbilden kann. In Kombination mit biochemischen Standardtests können diese Messungen verwendet werden, um die Rolle zu untersuchen, die mechanische Hinweise bei der Schicksalsspezifikation und Morphogenese bei der frühen menschlichen Entwicklung spielen.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) versprechen den Einsatz in der regenerativen Medizin und in der Gewebetechnik. Die pluripotente Natur dieser Zellen gibt ihnen die Möglichkeit, in jeden adulten Zelltyp zu differenzieren. Während große Fortschritte bei der Leitung des Schicksals von hESCs auf bestimmte Zelltypen gemacht wurden, ist es sehr schwierig geblieben, ganze Gewebe oder Organe de novo^{1,2,3,4, 5}. Dies ist zu einem großen Teil auf ein begrenztes Verständnis der Mechanismen zurückzuführen, die die Bildung dieser Gewebe während der menschlichen Entwicklung vorantreiben. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind in den letzten Jahren eine Reihe von Methoden zur Modellierung des frühen Embryos und der nachfolgenden Entwicklungsstadien mit embryonalen Stammzellen^{6,7,8,9 ,10,11,12,13}.

Kurz nach der Ableitung der ersten hESC-Linien¹⁴wurde nachgewiesen, dass embryoide Körper aus hESCs in der Lage waren, spontan Zellen der drei primären Keimschichten⁶zu produzieren. Aufgrund der inhärenten mangelnden Kontrolle über die Größe und Morphologie von embryoiden Körpern variierte die Organisation der Keimschichten jedoch erheblich und entsprach nicht der Organisation des frühen Embryos. In jüngerer Zeit entwickelten Warmflash et al. eine Methode, um Kolonien von hESCs auf Glassubstraten mittels Mikromusterung einzugrenzen, die Kontrolle und Konsistenz über die Größe und Geometrie der^Kolonien8 . In Gegenwart von BMP4, einem wichtigen Morphogen in der frühen Entwicklung, waren diese begrenzten Kolonien in der Lage, sich selbst reproduzierbare Spezifisierungsmuster an Schicksale zu organisieren, die die primären Keimschichten darstellen. Obwohl dies ein nützliches Modell für die Untersuchung der Mechanismen darstellte, mit denen primäre Keimschichten hergestellt werden, entsprachen die Muster der Schicksalsspezifikation nicht genau der Organisation und Morphogenese, die während der Embryogenese¹⁵beobachtet wurden. Eine getreuere Rekapitulation der frühen embryonalen Entwicklung wurde erreicht, indem hESCs in eine dreidimensionale extrazelluläre Matrix (ECM) von Matrigel¹¹eingebettet wurden, was den bisher stärksten Beweis für die Fähigkeit von hESCs zur Selbstorganisation und Modellierung lieferte. die frühen Stadien der Embryogenese ex vivo. Diese Methode führt jedoch zu inkonsistenten Ergebnissen und ist daher unvereinbar mit einer Reihe von Assays, die verwendet werden könnten, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Selbstorganisation und Schicksalsspezifikation aufzudecken.

Angesichts dieser bestehenden Methoden und ihrer jeweiligen Grenzen versuchten wir, eine Methode zur reproduzierbaren Kultivierung von hESC-Kolonien definierter Geometrien unter Bedingungen zu entwickeln, die die extrazelluläre Umgebung des frühen Embryos modellieren. Um dies zu erreichen, verwendeten wir Polyacrylamid-Hydrogele mit abstimmbarer Elastizität, um die mechanischen Eigenschaften des Substrats zu steuern. Mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie an Hühnerembryonen im Gastrulationsstadium fanden wir heraus, dass die Elastizität des Epiblasts von Hunderten von Pascal bis zu einigen Kilopascal reichte. So konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen mit Elastizität in diesem Bereich, um als Substrat für hESC-Kolonien zu dienen. Wir haben unsere bisherigen Methoden zur Kultivierung von hESCs auf Polyacrylamid-Hydrogelen^7,9 modifiziert, um eine robuste Kontrolle über die Geometrie der Kolonien zu ermöglichen. Dies gelang uns durch das erste Mustern von ECM-Liganden, nämlich Matrigel, auf Glashüllen durch mikrofabrizierte Schablonen, wie bereits berichtet¹⁶. Wir haben dann eine neuartige Technik entwickelt, um den gemusterten Liganden während der Polymerisation auf die Oberfläche von Polyacrylamid-Hydrogelen zu übertragen. Die Methode, die wir hier beschreiben, besteht darin, die Photolithographie zu verwenden, um einen Siliziumwafer mit den gewünschten geometrischen Mustern herzustellen, Stempel dieser geometrischen Merkmale mit Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen und diese Stempel zu verwenden, um die Schablonen zu erzeugen, die schließlich erlauben, Denligand auf die Oberfläche von Glasabdeckungen zu mustern und zu Polyacrylamid zu übertragen.

Neben der Rekapitulation der mechanischen Umgebung des frühen Embryos ermöglicht die Beschränkung von hESC-Kolonien auf Polyacrylamid die Messung zellgenerierter Kräfte mit Traktionskraftmikroskopie (TFM), wie in unserer vorherigen Methode⁹berichtet. Kurz gesagt, fluoreszierende Perlen können in das Polyacrylamid eingebettet und als Treuhandmarker verwendet werden. Zellgenerierte Kräfte werden berechnet, indem die Verschiebung dieser Perlen nach dem Aussaat von hESCs auf das gemusterte Substrat abgebildt wird. Darüber hinaus können die resultierenden Traktionskraftkarten mit traditionellen Assays wie Derimmunfärbung kombiniert werden, um zu untersuchen, wie die Verteilung zellgenerierter Kräfte in begrenzten hESC-Kolonien die nachgeschaltete Signalisierung regulieren oder modulieren kann. Wir erwarten, dass diese Methoden zeigen werden, dass mechanische Kräfte eine entscheidende Rolle bei der Musterung der Zellschicksalsspezifikation während der frühen embryonalen Entwicklung spielen, die derzeit übersehen wird.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden zur Verwendung von hESCs wurden vom Human Gamete, Embryo and Stem Cell Research (GESCR) Committee der University of California San Francisco zugelassen.

1. Herstellung von Siliziumwafer n. B. mit geometrischen Merkmalen

1. Erstellen Sie eine Fotomaske mit den gewünschten geometrischen Features. Verwenden Sie computergestützte Entwurfssoftware, um die Funktionen zu entwerfen. Für die Verwendung mit negativem Photoresist, machen Features undurchsichtig und der Rest der Maske transparent.
   HINWEIS: Zum Mustern auf Abdeckungen mit einem Durchmesser von 18 mm gruppieren Sie die Merkmale für jede Versuchsbedingung in 10 x 10 mm Bereiche, um sicherzustellen, dass die in Schritt 3 erzeugten Schablonen auf die Abdeckungen passen.
2. Spin Mantel negativer Photoresist auf einen 100 mm Siliziumwafer. Verwenden Sie das Photoresist-Datenblatt, um die Geschwindigkeit und Länge der Drehung zu bestimmen, um eine Filmdicke von 100-250 m zu erzeugen.
   HINWEIS: Die Foliendicke sollte so eingestellt werden, dass das Seitenverhältnis der Breite der Muster zur Höhe der Schablone so nahe wie möglich bei 1:1 liegt. Wir empfehlen jedoch eine Mindestdicke von 100 m, da alles andere zarte Schablonen produziert, die leicht reißen.
3. Verarbeiten Sie den Photoresist gemäß dem Produktdatenblatt. Dies beinhaltet in der Regel eine weiche Backen, UV-Belichtung mit Fotomaske in einer Maske Aligner, Post-Belichtung backen, Entwicklung, und harte stolbacken. Als Beispiel wird die Prozedur zur Verarbeitung der in diesem Protokoll verwendeten Wafer in Tabelle 1beschrieben.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Siliziumwafern, da sie zerbrechlich sind. Einmal erzeugt, können Wafer wiederholt verwendet werden, solange sie nicht beschädigt werden.

2. Herstellung von Deckellipsen

1. Zubereitung von säuregewaschenen "Top"-Abdeckungen
   1. Legen Sie 18 mm Durchmesser #1 Dicke Abdeckungeninteilen in eine Glas Petrischale. Die entsprechende Anzahl der Abdeckungen hängt von der Größe der Schale ab. Für eine 100-mm-Schale 50-100 Abdeckungen gleichzeitig zubereiten. Die Volumenmengen, die durch den Rest dieses Abschnitts angegeben werden, entsprechen einer 100 mm Schale.
   2. Fügen Sie 20 ml 1 M HCl in die Petrischale und schütteln Sie die Schale vorsichtig, um die Abdeckungen zu zerstreuen. Stellen Sie sicher, dass alle Abdeckungen untergetaucht sind und lassen Sie Luftblasen zwischen den Abdeckungen ab. Übernacht bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubieren.
      VORSICHT: HCl ist sauer und ätzend. Seien Sie vorsichtig und tragen Sie geeignete PSA während der Arbeit mit HCl.
   3. Dekant HCl von der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
   4. Nach dem Wegwerfen der Endwäsche 20 ml 100% Ethanol in die Schale geben. Mit Zangen die Abdeckungen einzeln entfernen und zwischen zwei Stück Filterpapier zum Trocknen anordnen.
   5. Trockene Deckellipsen in einem verschlossenen Behälter aufbewahren. Säuregewaschene Deckelkönnen im Voraus zubereitet und unter staubfreien Bedingungen einen Monat oder länger gelagert werden.
2. Herstellung von Glutaraldehyd-aktivierten "Boden"-Abdeckungen
   HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in den vorherigen Methoden^7,9.
   1. Legen Sie 18 mm Durchmesser #1 Dicke Abdeckungeninlips in eine Petrischale.
   2. 20 ml 0,2 M HCl in die Petrischale geben und die Schale vorsichtig schütteln, um die Abdeckungen zu zerstreuen. Stellen Sie sicher, dass alle Abdeckungen untergetaucht sind und lassen Sie Luftblasen zwischen den Abdeckungen ab. Übernacht bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubieren.
   3. Dekant HCl von der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
   4. Nach dem Wegwerfen der letzten Wäsche 20 ml 0,1 M NaOH hinzufügen und vorsichtig schütteln, um Abdeckungen zu zerstreuen und zu tauchen. Bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 1 h bebrüten.
   5. Dekant NaOH von der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
   6. Nach dem Wegwerfen der endigen Wäsche 20 ml einer 1:200 Verdünnung von 3-Aminopropyltrimethoxysilan in reinstes Wasser hinzufügen und sanft schütteln, um Dielips zu dispergieren und zu untertauchen. Bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 1 h oder über Nacht bebrüten.
      VORSICHT: 3-Aminopropyltrimethoxysilan ist entzündlich und kann Hautreizungen verursachen. Behandeln Sie mit Sorgfalt, tragen Sie geeignete PSA und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Entsorgungsvorschriften.
   7. Dekantiert die verdünnte 3-Aminopropyltrimethoxysilan-Lösung aus der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt mindestens fünf Wäschen wiederholen. Es ist wichtig, alle 3-Aminopropyltrimethoxysilan zu entfernen, bevor Sie fortfahren.
   8. Nach dem Wegwerfen der Endwäsche 20 ml einer 1:140 Verdünnung von 70% Glutaraldehyd in Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) hinzufügen und vorsichtig schütteln, um Deckellipsen zu dispergieren und zu untertauchen. Bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 1 h oder über Nacht bebrüten.
      VORSICHT: 70% Glutaraldehyd ist giftig und kann Hautreizungen verursachen. Behandeln Sie mit Sorgfalt, tragen Sie geeignete PSA und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Entsorgungsvorschriften.
   9. Dekantiert die verdünnte Glutaraldehydlösung aus der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
   10. Nach dem Entsorgen der Endwäsche 20 ml 100% Ethanol hinzufügen. Mit Zangen die Abdeckungen einzeln entfernen und zwischen zwei Stück Filterpapier zum Trocknen anordnen.
   11. Trockene Deckellipsen in einem verschlossenen Behälter aufbewahren. Glutaraldehyd-aktivierte Abdeckungen können im Voraus hergestellt und bis zu sechs Monate gelagert werden.

3. Erzeugung von Schablonen zum Mustern von ECM Ligand

1. Erzeugung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Zwischenstempeln
   1. Mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 nach Gewicht. Mischen Sie gründlich.
      HINWEIS: Für die Erstanwendung von PDMS bereiten Sie ca. 100 g PDMS vor, um eine 100-mm-Schale zu füllen. Für nachfolgende Anwendungen entfernen Sie PDMS nur aus der Mitte der Schale, in der sich die Siliziumwafer-Features befinden, und bereiten 20-30 g neues PDMS vor.
   2. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einem Trockenmittel für 30-60 min oder bis alle Luftblasen entfernt sind.
   3. Den modifizierten Siliziumwafer aus Schritt 1 in eine 100-mm-Kunststoffschale geben. Gießen Sie die PDMS-Mischung langsam und gleichmäßig über die Oberfläche des Wafers. Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen von der Oberfläche des Wafers zu lösen.
   4. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch 10 min über den Wafer oder bis alle Luftblasen entfernt sind oder an die Oberfläche des PDMS gekommen sind.
   5. Das PDMS bei 70 °C für 2 h backen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
   6. Schneiden Sie mit einem Skalpell oder Einem Kastenschneider den Bereich von PDMS aus der Mitte der Schale aus, die die geometrischen Merkmale enthält.
   7. Schneiden Sie das PDMS in ca. 10 x 10 mm Quadrate, die jeweils die Eigenschaften für einen einzigen Versuchszustand enthalten. Diese werden in den nachfolgenden Schritten des Protokolls als "Stempel" bezeichnet.
2. Erzeugung von Flachplatten von PDMS
   1. Mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 8:1 nach Gewicht. Bereiten Sie ca. 20 g für jede zu verwendende 100-mm-Schale vor. Mischen Sie gründlich.
   2. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einem Trockenmittel für 30-60 min oder bis alle Luftblasen entfernt sind.
   3. Gießen Sie das PDMS langsam und gleichmäßig in eine saubere 100 mm Schale. Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen zu lösen.
   4. Das PDMS bei 70 °C für 2 h backen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
   5. Entfernen Sie das PDMS aus der Schale. Invertieren, so dass die Oberfläche des PDMS, die in Kontakt mit dem Boden der Schale war nach oben.
   6. Schneiden Sie für jeden in Schritt 3.1 erzeugten Stempel ein Quadrat von 15 x 15 mm PDMS. Diese werden in den nachfolgenden Schritten des Protokolls als "flache Platten" bezeichnet.
3. Generieren von Schablonen
   1. Ordnen Sie flache Platten von PDMS auf dem Deckel einer 150 mm Schale oder einer anderen flachen Oberfläche an, um die Handhabung zu erleichtern. Achten Sie auf einen ausreichenden Abstand zwischen den Platten (z.B. für eine 150-mm-Schale, ordnen Sie neun flache Platten mit gleichmäßigem Abstand an).
   2. Invertieren Sie jeden Stempel, der in Schritt 3.1 erzeugt wird, auf eine flache Platte von PDMS, so dass die Merkmale auf dem Stempel mit der flachen Platte von PDMS in Kontakt stehen. Drücken Sie vorsichtig auf die Oberseite des Stempels mit Zangen, um einen gleichmäßigen Kontakt zu gewährleisten.
   3. Stützen Sie vorsichtig den Deckel mit PDMS-Stempel/Platte paart sich auf der Basis der Schale, so dass der Deckel in einem Winkel ruht. Dies unterstützt den Abtransport des UV-härtenden Polymers im nächsten Schritt.
   4. Legen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtendes Polymer an die obere Schnittstelle jedes Stempel-/Plattenpaares. Das Polymer wird zwischen den beiden durch Oberflächenspannung, unterstützt durch die Schwerkraft, böse sein.
      HINWEIS: Viele verschiedene UV-härtende Polymere können in diesem Protokoll funktionieren. Wir haben Norland Optical Adhesive 74 für die folgenden Eigenschaften ausgewählt: i) Schnelle Aushärtung bei Uv-Licht, ii) Einfache Entfernung von PDMS-Stempeln bei Aushärtung, iii) Robuste Haftung auf Glasabdeckungen mit manuellem Druck.
   5. Sobald das Polymer vollständig durchgeäuft wurde, legen Sie den Deckel mit Stempel-/Plattenpaaren flach auf die Arbeitsfläche. Legen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtendes Polymer an jede der verbleibenden drei Seiten jeder Stempel-/Plattenschnittstelle.
   6. Verbinden Sie die Polymertropfen mit einer 200-L-Pipettenspitze an den Rändern der Stempel-/Plattenschnittstelle. Dadurch wird ein Rahmen erstellt, der die Ligandenlösung in Schritt 4 hält.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Polymer um die Ränder des Stempels arbeiten. Wenn die Stempel-/Plattenschnittstelle unterbrochen ist, wird das Polymer unter den Features abtreten und die Schablone wird sich nicht richtig bilden.
   7. Legen Sie die Stempel-/Plattenpaare vorsichtig in eine UV-Sterilisationsbox. Verwenden Sie die sterile "Str" Leistungseinstellung und belichten Sie für 10 min.
   8. Entfernen Sie die Stempel-/Plattenpaare aus der UV-Sterilisationsbox. Entfernen Sie mit zwei Zangenpaaren vorsichtig den PDMS-Stempel, während Sie die flache Platte und Schablone halten, die sich aus dem UV-härtenden Polymer gebildet haben.
   9. Entfernen Sie die Schablone mit Zangen vorsichtig und invertieren Sie sie so, dass die Oberfläche, die mit der flachen Platte von PDMS in Berührung kam, nach oben gerichtet ist.
      HINWEIS: Die Schablonen sind zart. Seien Sie vorsichtig, während Sie sie geben, vor allem beim Entfernen von ihnen aus dem PDMS, damit sie nicht reißen.
   10. Legen Sie die invertierten Schablonen wieder in eine UV-Sterilisationsbox. Verwenden Sie die sterile "Str" Leistungseinstellung und belichten Sie für 3 min.

4. Musterung ECM Liganden auf Deckellips

1. Schablonen auf säuregewaschene Deckellipsen pressen
   1. Legen Sie einen säuregewaschenen Deckelfürstück für jede Schablone auf ein sauberes Stück Laborfolie.
   2. Mit Zangen jede Schablone flach seit unten auf einen säuregewaschenen Deckelschlupf legen. Platzieren Sie so, dass Features auf dem Deckzettel zentriert sind.
   3. Legen Sie ein kleines Stück Laborfolie auf jede Schablone. Drücken Sie fest und gleichmäßig auf die Schablone, um einen starken Kontakt zwischen der Schablone und dem Coverslip herzustellen.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! Drücken Sie fest und über die gesamte Oberfläche der Schablone. Wenn kein ausreichender Kontakt erstellt wird, tritt die Ligandenlösung zwischen der Schablone und den Abdeckungen auf, und die Musterung schlägt fehl. OPTIONAL: Um einen ausreichenden Kontakt zwischen der Schablone und dem Deckelschlupf zu bestätigen, wird die Pipette 100 l ultrareines steriles Wasser auf die Oberfläche jeder Schablone gebracht und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 h auf Leckage prüfen. Wasser aus erfolgreich verklebenden Schablonen ansaugen und fortfahren.
2. Plasmareinigung der Oberfläche der Schablonen-Abdeckungen zur Erhöhung der Hydrophilie
   1. Legen Sie die Abdeckungen mit Schablonen in einen Plasmareiniger. Tragen Sie Hochleistungsplasma für 30 s auf.
3. Vorbereitung der ECM-Ligandlösung
   HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sollten, wenn möglich, unter sterilen Bedingungen abgeschlossen werden.
   1. Sterile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 Lösung auf Eis legen. Nach eiskalter Form Matrigel und Kollagen hinzufügen, um Konzentrationen von 225 g/ml bzw. 25 g/ml zu erreichen. OPTIONAL: Zur Fehlerbehebung oder zur Ligandenvisualisierung, fügen Sie einen fluoreszierend markierten Liganden in die Ligandenlösung ein.
      1. HINWEIS: Mit dieser Methode können verschiedene ECM-Liganden verwendet werden. Für verschiedene Liganden kann eine zusätzliche Optimierung erforderlich sein, um die ideale Konzentration, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur zu bestimmen. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt.
   2. Pipette die Ligandenlösung auf die Oberfläche jeder Schablone. Für Schablonen aus 10 x 10 mm quadratischen Stempeln, tragen Sie 100 l pro Schablone auf.
   3. Überprüfen Sie, ob Luftblasen in Schablonenfunktionen angezeigt werden. Verwenden Sie bei Bedarf feingekippte Zangen oder eine 2-L-Pipettenspitze, um Luftblasen von Features zu entfernen.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! Wenn Luftblasen an der Oberfläche des Deckels gefangen bleiben, wird der Liganden nicht an die Oberfläche adsorbieren und das resultierende Muster wird unvollständig sein.
   4. Die Schablonen-Coverlips mit Ligand in eine Schüssel geben, mit Laborfolie umwickeln und über Nacht bei 4 °C brüten.

5. Übertragung von Ligand auf Polyacrylamid-Gel

1. Entfernen von Ligandenlösung und Schablone aus jedem Coverslip
   1. Die Ligandenlösung von der Oberfläche einer Schablone absaugen. Ligand-Lösung kann gesammelt und bei 4 °C gelagert und bis zu einem Monat wiederverwendet werden.
   2. Mit Zangen den Deckelrutsch kurz mit Schablone in eine Schüssel mit sterilem PBS zum Waschen untertauchen.
   3. Untertauchen Sie den Deckelmit Schablone kurz in eine zweite Schale mit sterilem PBS zum Waschen.
   4. Entfernen Sie die Schablone von der Oberfläche des Deckelzettels. Achten Sie darauf, den Coverslip nicht zu brechen.
   5. Untertauchen Sie den Deckel in eine Schüssel mit ultrareinem sterilem Wasser, um Salze aus den PBS-Wäschen zu entfernen. Tippen Sie auf den Rand des Deckelslipzurutsche zu einem empfindlichen Aufgabenwisch, um überschüssiges Wasser abzuleiten.
   6. Trocknen Sie den Deckelunterrutschunter unter einem Inertgas, wie Stickstoff. Markieren Sie die Unterseite des Coverslips, um die Orientierung von diesem Punkt nach vorne zu verfolgen. Achten Sie darauf, die gemusterte Seite nach oben zu halten.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1 bis 5.1.6 für jeden Schablonen-Coverslip.
2. Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogelen mit gemusterten Coverlips
   ANMERKUNG: Siehe frühere Methoden für zusätzliche Angaben^7,9 Sterilisieren Sie alle Kappenhalter, Rohre und Abstandshalter, die zur Herstellung von Polyacrylamidgelen verwendet werden, indem Sie über Nacht mit 10 % Bleichmittel waschen und mindestens fünfmal mit Wasser abspülen, um Bleichmittel zu entfernen, und kurz in 70% Ethanol waschen. Legen Sie alle Stücke auf empfindliche Aufgabentücher in einem sterilen Biosicherheitsschrank zum Trocknen vor Gebrauch.
   1. Bereiten Sie Polyacrylamid-Lösung vor, um die gewünschte Hydrogelelastizität zu erhalten (Tabelle 2). Mischen Sie alle Komponenten außer den fluoreszierenden Mikrosphären und dem Kaliumpersulfat (PPS).
      HINWEIS: Bereiten Sie 1% Kaliumpersulfatlösung jedes Mal frisch vor.
   2. Entgasen Sie die Polyacrylamidlösung, Mikrosphären und PPS in separaten Rohren unter Vakuum für 30 min.
   3. Für jeden gemusterten Abdeckslip einen glutaraldehydaktivierten "Boden"-Deckelschlupf mit einem Abstandsabstand (18 mm Außendurchmesser, 14 mm Innendurchmesser) auf die Oberseite zubereiten.
   4. Nach der Entgasung Mikrosphären kurz beschallen und der Polyacrylamidlösung entsprechendes Volumen hinzufügen. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten, achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Kurz beschallen.
   5. Fügen Sie der Polyacrylamidlösung ein entsprechendes Volumen von PPS hinzu. Pipette nach oben und unten, um die Lösung zu mischen, achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
      HINWEIS: Nach dem Hinzufügen von PPS, schnell arbeiten, um die Schritte 5.2.6 bis 5.2.11 abzuschließen, bevor Polyacrylamid polymerisiert.
   6. Pipette 75-150 l (je nach Dicke des Abstandsraums) in die Mitte jedes Glutaraldehyd-aktivierten Deckelrutsches.
   7. Mit Zangen einen gemusterten Deckelschlupf auf jeden Glutaraldehyd-aktivierten Deckelrutsch mit Polyacrylamid und Spacer legen, so dass der gemusterte Liganden der Polyacrylamidlösung gegenübersteht. Wenn eine ausreichende Polyacrylamidlösung zugegeben wurde, wird die Oberflächenspannung das Polyacrylamid zwischen den beiden Abdeckungen ableiten und es werden keine Luftblasen vorhanden sein.
   8. Nehmen Sie jedes Polyacrylamid "Sandwich" auf und berühren Sie vorsichtig die Seite zu einem empfindlichen Aufgabenwisch, um überschüssige Polyacrylamidlösung abzuleiten.
   9. Legen Sie jedes Polyacrylamid-"Sandwich" vorsichtig in einen Kappenhalter mit Gewinden, die mit 15 ml konischen Bodenrohren kompatibel sind. Die Ausrichtung sollte so sein, dass der Boden des Glutaraldehyd-Abdeckungsrutsches in Kontakt mit der Unterseite des Kappenhalters ist und der gemusterte Deckelschlupf oben ist.
   10. Schrauben Sie ein 15 ml kegelförmiges Unterrohr in jeden Kappenhalter, um die Polyacrylamid-"Sandwiches" an Ort und Stelle zu halten. Die Rohre sollten fest sein, um Leckagen zu verhindern, aber achten Sie darauf, nicht zu verengen und die Abdeckungen zu knacken.
   11. Zentrifugieren Sie das Polyacrylamid "Sandwiches" in den Rohren in Schwenkschaufeln bei 200 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie in Rohrregale, um die Orientierung für weitere 50 min beizubehalten, um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten. Mit Folie bedeckt halten, um das Bleichen fluoreszierender Mikrosphären zu verhindern.
       HINWEIS: Zentrifugation ist entscheidend, wenn diese Methode verwendet wird, um TFM auszuführen. Die Fliehkraft verschiebt alle Mikrosphären auf eine einzige Ebene, die sich letztlich knapp unter der Oberfläche des Hydrogels befinden wird. Dies ist ideal für die Abbildung von Mikrosphärenverschiebungen, die zur Berechnung zellgenerierter Traktionsspannungen verwendet werden. Wenn TFM nicht durchgeführt wird, können Mikrosphären aus der Polyacrylamidlösung herausgelassen werden und die Polymerisation kann an der Tischplatte ohne Zentrifugation auftreten.
   12. Entfernen Sie polymerisierte Polyacrylamid "Sandwiches" aus den Rohren und tauchen Sie in PBS in einer 100 mm Schale ein. In Laborfolie einwickeln und 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Herstellung von gemusterten Gelen für Säzellen
   1. Verwenden Sie ein Skalpell und Zange, um sorgfältig den gemusterten Coverslip und den Abstandsabstand aus dem Polyacrylamid "Sandwich" zu entfernen, während es in PBS versunken bleibt. Der gemusterte Ligand wird während der Polymerisation auf das Polyacrylamid übertragen und bleibt nach dem Entfernen des Deckellipses erhalten. Das Polyacrylamid-Gel bleibt am Glutaraldehyd-aktivierten Deckelbeschlag befestigt.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! Das Polyacrylamid muss in PBS getaucht werden, während der Deckelrutsch entfernt wird oder die Ligandenmuster zerstört werden.
   2. Platzieren Sie jeden Deckelrutsch mit gemusterten Polyacrylamid in einen Kappenhalter. Legen Sie eine Dichtung (18 mm Außendurchmesser, 14 mm Innendurchmesser) auf den Deckelund und um das Polyacrylamid, wo sich der Abstandser befand. Schrauben Sie ein abgesästes 15 mm konisches Bodenrohr in den Kappenhalter und bilden sie mit dem gemusterten Polyacrylamid unten. Diese Baugruppen passen für eine einfache Handhabung in die Bohrungen einer Standard 12-Well-Platte.
   3. Waschen Sie jedes Gel, indem Sie der Bohrgutbaugruppe 500 l PBS hinzufügen. 10 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln bebrüten. Entfernen Sie PBS und wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wähbe.
   4. Nach der letzten PBS-Wäsche 500 L Knockout-DMEM-Medien zu Gelen geben und bei 37 °C über Nacht inkubieren. Gele können bis zu 5 Tage vor der Aussaat von Zellen bei 37 °C mit Medien aufbewahrt werden.
   5. Ersetzen Sie am Tag vor dem Aussaat der Zellen knockout-DMEM für komplette KSR-Medien und brüten Sie bei 37 °C über Nacht.

6. Culturing hESCs auf gemusterten Gelen

HINWEIS: Wenn Sie planen, Proben für die Immunfärbung nach TFM zu fixieren, nehmen Sie Bilder von unbelasteten Mikrosphärenpositionen vor der Aussaat von Zellen auf. In diesem Fall sollte fluoreszierend markierter Ligand in Schritt 4.3.1 verwendet werden, damit die eventuellen Positionen von Zellen bekannt sind, bevor die Aussaat erfolgt und Mikrosphären in diesen Regionen abgebildet werden können.

1. BestandhEsC-Kulturen und sekundäre feederfreie Kulturen auf matrigelbeschichteten Platten in konditionierten KSR-Medien vor der Aussaat auf gemusterten Polyacrylamidgelen wie zuvor beschrieben⁹erhalten.
   HINWEIS: Generieren Sie konditionierte KSR-Medien, indem Sie bestrahlte Maus-embryonale Fibroblasten in KSR-Medien kultivieren, die mit 4 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt werden. Sammeln und ersetzen Sie Medien alle 24 h.
2. Aspirieren Sie die Medien von hESCs. Kurz mit Knockout-DMEM-Medien waschen. Fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, ergänzt mit 10 'M Y27632 (Rho Kinase-Hemmer) und inkubieren bei 37 °C für 5-10 min.
3. Fügen Sie Medien mit Serum hinzu, um Trypsin zu hemmen. Besaugen Sie Medien und Pipetten vorsichtig über die Schale, um Zellen zu entfernen. Führen Sie die sanfte Pipettierung fort, um alle Zellen zu entfernen und Zellcluster mit einzelnen Zellen zu trennen.
4. Sammeln Sie die Zellsuspension und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min.
5. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von KSR-Medien zum Waschen wieder aus. Zentrifuge bei 200 x g für 3 min.
6. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in konditionierten KSR-Medien wieder auf, ergänzt durch 10 ng/mL bFGF und 10 M Y27632.
7. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 300.000 Zellen pro ml an. Pipette 500 l der Zellsuspension auf jedes gemusterte Gel (150.000 Zellen pro Gel).
8. 3 h nach der Aussaat verwenden Sie eine Pipette, um die Medien von jedem Gel sorgfältig zu saugen und durch frisch konditionierte KSR-Medien zu ersetzen, die mit 10 ng/mL bFGF und 10 'M Y27632 ergänzt werden. Dadurch werden überschüssige Zellen entfernt, die nicht an gemusterten Regionen des Polyacrylamids hafteten.
   HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! In diesem Stadium werden die Zellen lose an den gemusterten Liganden haften. Seien Sie beim Medienwechsel sehr vorsichtig, um die Zellen nicht zu lösen. Bei jedem Medienswap sollte in den folgenden Schritten die gleiche Sorgfalt geboten sein.
9. 24 h nach der Aussaat verwenden Sie eine Pipette, um die Medien sorgfältig zu saugen und konditionierte KSR-Medien zu tauschen, die mit 10 ng/mL bFGF und 5 'M Y27632 ergänzt werden.
10. 48 h nach der Aussaat, verwenden Sie eine Pipette, um die Medien sorgfältig zu saugen und austauschen für konditionierte KSR-Medien mit 10 ng/mL bFGF ergänzt. Dies entfernt den Rho-Kinase-Inhibitor aus den Medien und Experimente können am nächsten Tag beginnen, 72 h nach der Aussaat.

7. Durchführung von TFM

1. Führen Sie auf Wunsch TFM wie zuvor beschrieben⁹ unter den gewünschten experimentellen Bedingungen durch.
2. Wenn unbelastete Mikrosphärenpositionen vor der Aussaat von Zellen abgebildet wurden, fixieren Sie die Zellen nach der Einnahme von gestressten Mikrosphärenpositionen und führen Sie eine Immunfärbung durch, um die Lokalisierung von Proteinen von Interesse relativ zu Regionen mit hohen und niedrigen Zugkraftkräften zu bestimmen.

Results

Die größte Herausforderung, die es zu bewältigen gilt, hESCs in Kolonien kontrollierter Geometrie auf konformen Substraten zu kultizieren, besteht darin, ein homogenes Muster von ECM-Ligand auf der Oberfläche des Substrats zu erzeugen. Die bei dieser Methode vorgestellte Strategie besteht darin, zunächst das gewünschte Muster auf der Oberfläche eines Glasdeckels zu erzeugen und dieses Muster anschließend während der Polymerisation des Gels auf die Oberfläche eines Polyacrylamidhydrogels z...

Discussion

Um ein langes und detailliertes Protokoll zu vereinfachen, besteht diese Methode aus drei kritischen Stufen: 1) Erzeugung von ECM-Ligand auf Glasabdeckungen, 2) Übertragung der Muster auf Polyacrylamid-Hydrogele während der Polymerisation des Gels und 3) Saat-HESCs auf der gemusterten Hydrogel. Es gibt kritische Schritte, die in jeder dieser drei Phasen berücksichtigt werden müssen. Um auf den Glasabdeckungen Hochtreuemuster zu erzeugen, muss die Schablone fest auf den Deckelbeschlag gedrückt werden, um ein Auslaufen der...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05 % Trypsin	Gibco	25300054
100 mm Petrischale aus Glas	Fisher Scientific	08-747B
100 mm Petrischale aus Kunststoff	Fisher	Scientific FB0875712
15 mL Röhrchen mit konischem Boden	Corning	352095
150 mm Petrischale aus Kunststoff	Fisher Scientific	FB0875714
18 mm Durchmesser #1 Deckgläser	Thermo Scientific	18CIR-1
2% Bisacrylamid	Bio-Rad	161-0142
3-Aminopropyltrimethoxysilan	ACROS Organics 313251000
40% Acrylamid	Bio-Rad	161-0140
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	01-213-100
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	Sigma-Aldrich	F0291
Bleach	Clorox	N/A
Zentrifuge mit Schwenkeimern	Eppendorf	22623508	Modell: 5804 R
Collagen	Corning	354236
Exsicator	Fisher Scientific	08-642-7
Ethanol	Fisher Scientific	AC615095000
Fetal Serum für Rinder	Gibco	16000044
Fluoreszierende Mikrosphären	Thermo Scientific	F8821
Pinzetten (für Deckgläser)	Fisher Scientific	16-100-122
Pinzetten (für Wafer)	Fisher Scientific	17-467-328
Gelhalter	N/A	N/A	Gelhalter sind kundenspezifisch 3D-gedruckt, CAD-Zeichnung auf Anfrage erhältlich
Glutaraldehyd	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
Heizplatte	Fisher Scientific	HP88854100
Salzsäure	Fisher Scientific	A144S-500
Isopropylalkohol	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes (empfindliche Arbeitstücher)	Kimberly-Clark Professional	34120
Knockout Serumersatz	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
Mask Aligner (für die Fotolithographie)	Karl Suss America, Inc.	Karl Süss MJB3 Mask Aligner
Matrigel	Corning	354277
Mikroskop für Zugkraft	Nikon	N/A	Modell: Eclipse TE200 U
Motorisierter Positioniertisch	Prior Scientific	N/A	Modell: HLD117
Stickstoffgas	Airgas	NI 250
Norland optischer Klebstoff 74 (UV-härtendes Polymer)	Norland Produkte	NOA 74
Ofen	Thermo Scientific	PR305225G
Parafilm (Laborfolie)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS (Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	N/A	Fotomasken werden nach Maß angefertigt. CAD-Zeichnung für unsere Entwürfe auf Anfrage erhältlich
Plasmareiniger	Fisher Scientific	NC9332171
Kunststoff für Dichtung	Marian Chicago	HT6135
Kunststoff für Abstandshalter	TAP Plastics	N/A	Polycarbonatplatte, 0,01 Zoll Dicke
Kaliumchlorid (zur Herstellung von PBS)	Fisher Scientific	P217-500
Kaliumphosphat monobasisch (zur Herstellung von PBS)	Fisher Scientific	P285-500
Pottassiumpersulfat	ACROS Organics	424185000
Skalpell	Fisher Scientific	14-840-00
Siliziumwafer	Elektronenmikroskopie Sciences	71893-06	Typ P, 3 Zoll, Siliziumwafer
Natriumchlorid (zur Herstellung von PBS)	Fisher Scientific	S271-1
Natriumhydroxid	Fisher	Scientific S318-100
Dibasisches Natriumphosphat-Dihydrat (zur Herstellung von PBS)	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050 Fotolack	MicroChem	SU8-3000
SU8-Entwickler	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
UV-Sterilisationsbox	Bio-Rad	N/A	Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (Rho-Kinase-Inhibitor)	StemCell Technologies	72304