Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung pharmakologischer Reaktionen bei prostataepitheliale Organoide vorgestellt. Organoide ähneln der in vivo-Biologie und rekapitulieren die Genetik der Patienten, was sie zu attraktiven Modellsystemen macht. Prostata-Organoide können aus Wildtyp-Prostata, gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden.

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Pharmakodynamik, des Stammzellpotenzials und der Krebsdifferenzierung in Prostataepithelialorganoiden vorgestellt. Prostata-Organoide sind Androgen-responsive, dreidimensionale (3D) Kulturen in einem definierten Medium gewachsen, die dem Prostataepithel ähnelt. Prostata-Organoide können aus Wildtyp- und gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden. Wichtig ist, dass von Patienten abgeleitete Organoide Tumoren in der Genetik und in vivo Tumorbiologie sehr ähnlich sind. Darüber hinaus können Organoide mit CRISPR/Cas9- und shRNA-Systemen genetisch manipuliert werden. Diese kontrollierte Genetik macht die Organoidkultur als Plattform attraktiv, um die Auswirkungen von Genotypen und Mutationsprofilen auf pharmakologische Reaktionen schnell zu testen. Experimentelle Protokolle müssen jedoch speziell an die 3D-Natur von organoiden Kulturen angepasst werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Beschrieben sind detaillierte Protokolle für die Durchführung von Seeding-Assays, um die Organoidbildungsfähigkeit zu bestimmen. Anschließend zeigt dieser Bericht, wie medikamentöse Behandlungen durchgeführt und pharmakologische Reaktionen durch Durchführbarkeitsmessungen, Proteinisolation und RNA-Isolation analysiert werden können. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie Organoide für Xenografting und nachfolgende In-vivo-Wachstumstests mit subkutaner Transplantation vorbereitet werden. Diese Protokolle liefern hochreproduzierbare Daten und sind weithin auf 3D-Kultursysteme anwendbar.

Einleitung

Arzneimittelresistenz ist eines der größten klinischen Probleme in der Krebsbehandlung. Die Behandlung von metastasierendem Prostatakrebs (PCa) richtet sich in erster Linie an die Androgen-Signalachse. Anti-Androgen-Therapien der nächsten Generation (z. B. Enzalutamid und Abirateron) haben große klinische Erfolge gezeigt, aber praktisch alle PCa entwickelt sich schließlich in Richtung eines Androgen-unabhängigen Zustands oder kastrationsresistenten Prostatakrebses (CRPC).

Jüngste genomische und transkriptomische Profilierung von CRPC ergab, dass es drei allgemeine Mechanismen der Resistenz bei Prostatakrebs: 1) aktivierende Mutationen, die ....

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Arbeiten wurden mit zuvor etablierten murinen Organoiden und patientenabgeleiteten Organoiden durchgeführt. Alle tierischen Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Research Animal Resource Center des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012) durchgeführt. Alle patientenabgeleiteten Gewebe wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001) gesammelt.

1. Mittel- und Puffervorbereitung

1. Vor Beginn des Experiments die Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) bei 4 °C über Nacht auftauen. Halten Sie es währ....

Ergebnisse

Seeding-Effizienz
Die Organoidbildungsfähigkeit wird durch Phänotyp und Genotyp bestimmt. Wildtyp (WT) Prostata-Basalzellen zeigten eine überlegene Organoidbildungskapazität (30%-40%) im Vergleich zu Leuchtzellen (3%) (Abbildung 1A). Nach der organoiden Etablierung nahm die Formationskapazität drastisch zu. In der Regel können 25%-30% der Zellen, die aus einem WT-Organoid gewonnen werden, ein neues Organoid bilden (

Diskussion

Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Anti-Androgen-Resistenz zugrunde liegen, und um potenzielle therapeutische Schwachstellen zu entdecken, müssen pharmakologische Reaktionen in Modellsystemen getestet werden, die Prostatakrebs imitieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Analyse pharmakologischer Reaktionen bei patientenabgeleiteten und gentechnisch veränderten Prostataorganoiden und zur Herstellung dieser Organoidproben für nachgelagerte Anwendungen beschrieben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
A83-01	Tocris	2939	Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 200 nM
ADMEM/F12	Gibco/Life-Technologien	12634028	Organoid-Medium-Komponente
B27	Gibco/Life-Technologien	17504-044	Organoid-Medium-Komponente
Zellkulturplatten	Fisher	657185
Zelltiter Glo	Promega	G7571
DHT	Sigma-Aldrich	D-073	Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 1 nM
DMSO	Fisher	BP231-100
EGF	Peprotech	315-09	Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 50 ng/ml für Maus, 5 ng/nl für
	Peprotech	100-26	Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 ng/ ml
FGF2	Peprotech	100-18B	Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 5 ng/ml
Glutamax	Gibco/Life-Technologien	35050079	Organoid-Medium-Komponente
HEPES	MADE IN-HOUSE	N/A	Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 mM
Matrigel (Wachstumsfaktor reduziert &	Corning	CB-40230C	Organoide Mediumkomponente
N-Acetylcystein	Sigma-Aldrich	A9165	Organoide Mediumkomponente: Endkonzentration 1,25 mM
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636	Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 mM
NOGGIN	Peprotech oder stabile transfizierte 293t Zellen mit Noggin-Konstrukt (Karthaus et al. 2014)	120-10C	Organoide Mediumkomponente: Endkonzentration 10% konditioniertes Medium oder 100 ng/ml
Penicillin/Streptavidin	Gemini Bio-Products	400-109	Organoide Mediumkomponente
Phospatase-Inhibitoren	Merck Millipore	524629
Prostaglandin E2	Tocris	3632464
Proteaseinhibitoren	Merck Millipore	539131
R-SPONDIN	Peprotech oder stabile transfizierte 293t Zellen mit R-Spondin1 Konstrukt (Karthaus et al. 2014)	120-38	Organoide Medium Komponente: Endkonzentration 10% konditioniertes Medium oder 500 ng/ml
RIPA Puffer	Merck	20-188
RNA-easy Minikit	Qiagen	74104
SB202190	Sigma-Aldrich	152121-30-7	Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 μ M
TryplE	ThermoFisher	12605036
Y-27632	Selleckchem	S1049	Organoid-Medium Komponente: Endkonzentration 10 μ M

Human-FGF10