Methodenartikel

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

DOI:

10.3791/60350

⸱

29. Oktober 2019

 ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular Biology and Lewis-Sigler Institute of Integrative Genomics, Princeton University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll wird erläutert, wie bakterielle Proben für die dreidimensionale Bildgebung vorbereitet und montiert werden und wie die dreidimensionale Form von E. coli aus diesen Bildern rekonstruiert wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Form eines Bakteriums ist wichtig für seine Physiologie. Viele Aspekte der Zellphysiologie wie Zellmotilität, Raubund und Biofilmproduktion können durch die Zellform beeinflusst werden. Bakterielle Zellen sind dreidimensionale (3D) Objekte, obwohl sie selten als solche behandelt werden. Die meisten Mikroskopietechniken führen zu zweidimensionalen (2D) Bildern, die zum Verlust von Daten in Bezug auf die tatsächliche 3D-Zellform und Lokalisierung von Proteinen führen. Bestimmte Formparameter, wie z. B. Gaußsche Krümmung (das Produkt der beiden Hauptkrümmungen), können nur in 3D gemessen werden, da 2D-Bilder nicht beide Hauptkrümmungen messen. Darüber hinaus liegen nicht alle Zellen flach, wenn die Montage und 2D-Bildgebung von gekrümmten Zellen die Formen dieser Zellen möglicherweise nicht genau darstellt. Die genaue Messung der Proteinlokalisierung in 3D kann helfen, die räumliche Regulation und Funktion von Proteinen zu bestimmen. Es wurde eine Vorwärts-Faltungstechnik entwickelt, die die Unschärfefunktion des Mikroskops nutzt, um 3D-Zellformen zu rekonstruieren und Proteine genau zu lokalisieren. Hier wird ein Protokoll zur Vorbereitung und Montage von Proben für die Live-Zell-Bildgebung von Bakterien in 3D beschrieben, um sowohl eine genaue Zellform zu rekonstruieren als auch Proteine zu lokalisieren. Die Methode basiert auf einfacher Probenvorbereitung, fluoreszierender Bildaufnahme und MATLAB-basierter Bildverarbeitung. Viele hochwertige Fluoreszenzmikroskope können einfach für diese Messungen modifiziert werden. Diese Zellrekonstruktionen sind rechenintensiv und der Zugriff auf Rechenressourcen mit hohem Durchsatz wird empfohlen, wenn auch nicht erforderlich. Diese Methode wurde erfolgreich auf mehrere Bakterienarten und Mutanten, fluoreszierende bildgebende Verfahren und Mikroskophersteller angewendet.

Einleitung

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Zellen aller Typen regeln ihre Formen für bestimmte Funktionen. Zum Beispiel sind Neuronen anders geformt als Blutzellen und haben unterschiedliche Funktionen. In ähnlicher Weise kommen Bakterienzellen in einer Vielzahl von Formen und Größen, obwohl der Zweck dieser Formen nicht immer bekannt ist1,2. Daher ist es wichtig, dass die Form von Bakterienzellen genau bestimmt wird. Die skizzierte Methode zeigt eine leicht zu implementierende Methode, um Daten zu sammeln, die für die 3D-Analyse der meisten lebenden oder fixierten Bakterienzellen geeignet sind.

Die beschriebene Methode ermöglicht es, 3D-Bilder von Bakterienzellen zu nehmen, um die 3D-Zellform der Probe genau darzustellen und Proteine innerhalb dieser Formen präzise zu lokalisieren. Herkömmliche Mikroskopie-Techniken nehmen 2D-Bilder, was problematisch ist, wenn Zellen untersucht werden, die abnormale oder nicht symmetrische Formen haben, wie Mutanten von Escherichia colioder gekrümmte Bakterien wie Vibrio cholerae und Helicobacter pylori. Während hochauflösende 3D-Bilder die Wichtigste Eingabe für diese Methode sind, gibt die Methode kein hochauflösendes Bild zurück. Vielmehr rekonstruiert diese Methode die 3D-Oberflächenkoordinaten und die Form der Zelle mithilfe eines Vorwärts-Faltungsalgorithmus mithilfe aktiver Konturen und der scheinbaren Unschärfefunktion des Mikroskops3 (Abbildung 1). Es wurde verwendet, um die bakterielle Aktin homolog MreB in E. coli4,5,6,7, das neuartige Periskeletal-Element CrvA in V. cholerae8, und die Bactofilin CcmA in Helicobacter pylori9 (Abbildung 2).

Die Lokalisierung von Proteinen kann einen Einblick in ihre Funktionen geben. Beispielsweise werden Proteine, die an der Zellteilung beteiligt sind, normalerweise auf die Midzelle10,11lokalisiert. Hochdurchsatzstudien wurden durchgeführt, um alle Proteine eines Bakteriums zu lokalisieren, in der Hoffnung, Einblicke in ihre Funktionen zu gewinnen12. Leider wurden diese Studien mit 2D-Bildgebung und 1D- oder 2D-Analyse durchgeführt, was es unmöglich macht, bestimmte Aspekte der Proteinlokalisierung zu messen, wie z. B. die Lokalisierung auf zelluläre geometrische Merkmale.

Zum Beispiel wird MreB, ein dynamisches Protein, das für die Stabform vieler Bakterien benötigt wird, vermutet, dass es durch die Lokalisierung der Zellwandsynthese funktioniert, und seine Lokalisation spiegelt die Lokalisation der Zellwandsynthese7,13wider. MreB von mehreren Arten zeigt geometrische Anreicherung4,6,7,14,15. Dynamische Oberflächenpolymere, wie MreB, können die Geometrie der Oberfläche mit dem zeitgemittelten Anreicherungsprofil16 koppeln und sich an bestimmten Geometrien orientieren, indem sie die mit der Bindung an die Membran verbundene Energie minimieren17. Während die Bedeutung des Drehens, Bündelns, Biegens und Der Dynamik für MreB noch nicht vollständig geklärt ist, ist es wichtig zu beachten, dass genaue Messungen beider Hauptkrümmungen einer Oberfläche eine vollständige 3D-Darstellung der Zelle erfordern. Um die Krümmungen, auf die sich Proteine localisieren, am genauesten zu messen, ist es daher bevorzugt, 3D- statt 2D-Bildgebung zu verwenden. 3D-Bildgebung eliminiert die Notwendigkeit, jene Krümmungen, die nicht in 2D gemessen werden können, zu berechnen, eine Schätzung, die in asymmetrischen Zellen möglicherweise nicht genau ist18.

Obwohl die 2D-Bildgebung von Zellen schneller ist und nicht so viel postimaging-Rechenarbeit erfordert, bietet die 3D-Bildgebung eine genauere Darstellung der Zelle sowie die Möglichkeit, Oberflächenmerkmale wie Krümmung zu messen, die nicht in 2D gemessen werden können. Da die 3D-Bildgebung an der Tagesordnung ist, werden neue Einblicke in die Zellform und Die Proteinlokalisierung möglich.

Protokoll

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1. Probenvorbereitung

  1. Machen Sie E. coli fluoreszierend für die Bildgebung entweder durch Engineering sie, um ein zytoplasmatisches fluoreszierendes Protein6 auszudrücken oder mit einem Membranfarbstoff5. Andere Bakterienarten können anstelle von E. coliverwendet werden.
    1. Transformieren Sie Zellen über Elektroporation mit einem Plasmid, das das zytoplasmatische mCherry Fluoreszenzprotein kodiert.
      HINWEIS: Verschiedene fluoreszierende Proteine anderer Farben von können verwendet werden.
    2. Wachsen Sie die Transformanten auf einer LB-Platte mit dem entsprechenden Antibiotikum bei 37 °C. Besorgen Sie einzelne Kolonien und identifizieren Sie positive Klone durch Mikroskopie. Antibiotikaresistente Kolonien, die unter dem Mikroskop rot erscheinen, enthalten das Plasmid, das mCherry trägt.
  2. Wachsen Sie 2 ml der Nachtkultur in LB flüssigen Medien mit den entsprechenden Antibiotika bei 37 °C in einem Schüttelinkubator. Verwenden Sie entweder eine Kolonie von einer Platte oder eine kleine Menge eines Gefrierschranks als Inoculum.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Medien, die für die für das Experiment ausgewählten Bakterienzellen erforderlich sind.
  3. Subkultur die Nachtkultur 1:1.000 in 5 ml frische LB-Medien und lassen Sie die Zellen zu exponentiellen Phase bei 37 °C in einem Schüttelinkubator für 3-4 h wachsen. Messen Sie die OD600 der Zellen zu bestätigen, dass sie sich in der exponentiellen Phase (d.h. , OD600 = 0,2 bis 0,4).
    HINWEIS: Die Bildgebung kann in jeder Wachstumsphase durchgeführt werden, abhängig vom durchgeführten Experiment.

2. Folienvorbereitung

HINWEIS: Es ist wichtig, Medien mit geringer Autofluoreszenz zu verwenden. Jedes Medium mit geringer Autofluoreszenz kann verwendet werden. In diesem Experiment ist 1% Agarose M63 minimale Medienpads und Versiegelung mit VaLaP19 erforderlich, um Zellen in 3D abzubilden.

  1. Bereiten Sie eine 1%-Lösung von Agarose in 20 ml minimalen Medien vor.
    1. Mikrowelle die Lösung, bis die Agarose vollständig gelöst ist und die Lösung klar erscheint.
    2. Bewahren Sie die Lösung in einem 60 °C-Wasserbad auf, bis sie einsatzbereit ist.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bei Bedarf verfestigt und geschmolzen werden oder in kleinere Mengen eingepfercht werden, die bei Bedarf geschmolzen werden. Nach mehreren Verwendungen kann sich das Medium verfärben und sollte ersetzt werden.
  2. VaLaP-Dichtmittel auf einer Kochplatte bei 80 bis 100 °C schmelzen.
    HINWEIS: Bereiten Sie VaLaP, als Dichtstoff verwendet werden, durch Schmelzen von je 50 g Petroleumgelee, Lanolin und Paraffin zusammen in einem Becher auf einer heißen Platte bei 80 bis 100 °C. Diese große Menge VaLaP kann bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden und reicht für >500 Dias. Die Erwärmung bei >100 °C führt dazu, dass sie sich abschwächt und ihre Farbe verdunkelt.
  3. Legen Sie zwei Stapel mit je drei 20 mm x 20 mm Deckelscheine an den gegenüberliegenden Enden eines Schlittens (sechs Gesamtabdeckungen).
  4. Pipette 200 L Agarose-Pad-Lösung auf dem Schlitten.
    HINWEIS: Wenn Sie keinen technischen fluoreszierenden Fleck verwenden, kann der Agarose-Pad-Lösung vor diesem Schritt ein Membranfarbstoff hinzugefügt werden. Den Farbstoff in Wasser aussetzen und 1 ml der Agarose-Pad-Lösung zu einer Endkonzentration von 5 g/ml färben.
  5. Sofort und fest eine zweite Rutsche nach unten auf den Stapel von Abdeckung rutscht, um den Agar abzuflachen und lassen Sie es für 1 min bei Raumtemperatur erstarren.
  6. Schieben Sie vorsichtig von der oberen Folie.
  7. Verwenden Sie das große Ende einer 200-L-Pipettenspitze, um einzelne Pads aus dem Gel (Durchmesser: 5 mm) auf dem Schlitten auszuschneiden und fehlerhaftes oder nicht benötigtes Gel zu entsorgen.
    HINWEIS: Wenn mehrere Stämme oder Bedingungen geabbildungen, wird für jeden ein separates Pad benötigt. Wenn nur eine Sorte abgebildet werden soll, machen Sie 3-4 Pads, um den Coverslip zu unterstützen.
  8. Pipettenzellen auf und ab mehrmals, um Zellklumpen zu stören und sicherzustellen, dass die Kultur gut gemischt ist. Pipette 1 l Subkultur von Schritt 1.3 auf ein Pad.
    HINWEIS: Zellformrekonstruktionen erfordern einzelne Zellen, die andere Zellen nicht berühren. Bei Verwendung stationärer Phasen- oder Kulturen mit hoher Zelldichte kann es notwendig sein, die Probe 1:10 zu verdünnen, bevor sie auf das Pad gestellt wird.
  9. Lassen Sie die Probenluft für 5 x 10 min trocknen. Stellen Sie sicher, dass das Tröpfchen vollständig in das Pad absorbiert wird. Wenn Flüssigkeit übrig bleibt, bewegen sich die Zellen in der Flüssigkeit und können nicht abgebildet werden.
  10. Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Oberseite der Pads.
  11. Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit geschmolzenem VaLaP, indem Sie sanft mit einem Wattestäbchen um den Rand des Deckelschlupfes bürsten. Achten Sie darauf, es von der Oberseite des Deckels schlupf zu halten, wo das Ziel berührt wird. Der VaLaP härtet in Sekundenschnelle aus und versiegelt die Probe.
  12. Stellen Sie das Beispiel sofort ab.
    HINWEIS: Das Beispiel sollte abgebildet werden, sobald die Folie vorbereitet ist. Die Zellen können auf den Pads wachsen, und wenn sie die Rekonstruktionen teilen, wird es schwieriger sein.

3. ImagingRequirements

  1. Stellen Sie sicher, dass die z- oder Fokussierachse des Mikroskops präzise Bewegungen von weniger als 50 nm machen kann. Verwenden Sie z piezo-Stufen (siehe Tabelle der Materialien), die auf Forschungsmikroskopen verfügbar sind, da typische motorisierte Fokusgeräte diese Präzision nicht bieten können.
    HINWEIS: Unter der Annahme des Nyquist-Shannon-Sampling-Kriteriums20muss man die Fähigkeit haben, 0,5-fach die kleinste gewünschte Schrittgröße oder das 2-fache der gewünschten Raumfrequenz zu bewegen. Für die in diesem Protokoll erforderlichen 100 nm-Schritte ist eine Stufe mit einer Genauigkeit von 50 nm oder weniger erforderlich.
  2. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop ein 100-faches Objektiv mit einer minimalen numerischen Blende (NA) von 1,45 enthält.
    1. Sammeln Sie Z-Stacks von 200 bis 400 verschiedenen Zellen, um sicherzustellen, dass genügend Zellen für nachgelagerte Anwendungen erhalten werden.
      HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen hängt von der zugrunde liegenden Variabilität der Zinsprobe ab. Einige der zellen, die an dieser Stelle gesammelt werden, werden es nicht durch die Rekonstruktionsschritte schaffen.
  3. Stellen Sie sicher, dass der Z-Stack den Einstellungen entspricht, die für den Formkanal verwendet werden, wenn ein sekundärer Fluoreszenzkanal (Protein, metabolisches Etikett usw.) gemessen wird.

4. Imaging

  1. Setzen Sie den versiegelten Schlitten auf das Mikroskop und lassen Sie ihn 5 min sitzen, um die Temperatur mit der Umgebung zu gleichsetzen, da der Mikroskopraum möglicherweise eine andere Temperatur als der Probenvorbereitungsraum hat.
  2. Nehmen Sie einen fluoreszierenden Z-Stack der Probe.
    HINWEIS:     Der Z-Stack sollte die Probe vollständig mit einem Z-Abstand abdecken, der kleiner als die Schärfentiefe ist. Bei einem 1,45 NA 100x objektiv und 1 'm dicken E. coli-Zellen funktionieren 40 Schritte bei 100 nm pro Schritt gut. Für größere Zellen oder Zellen, die nicht perfekt flach auf der Oberfläche liegen, können 50 oder mehr Schritte erforderlich sein. Fügen Sie genügend Schritte ein, und stellen Sie sicher, dass die Stichprobe oben und unten vollständig verschwommen ist.
    1. Verwenden Sie die mit dem Mikroskop verbundene Software (siehe Materialtabelle), um das Mikroskop zu steuern.
    2. Konzentrieren Sie sich mit den Mikroskopfokusrädern auf die Mitte der Zelle. Aktivieren Sie unter ND-Erfassung das Feld Z, um einen Z-Stack zu nehmen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Startseite, um die Mitte der Zelle als Ausgangspunkt festzulegen. Stellen Sie die Schrittgröße auf 0,1 m und den Bereich auf 4 m ein. Stellen Sie sicher, dass das Z-Gerät auf die Piezo-Stufe eingestellt ist.
    3. Stellen Sie die Fluoreszenzkanäle unter dem Lambda-Fenster auf die Einstellungen für die abgebildeten fluoreszierenden Moleküle ein. In diesem Experiment wurden GFP und mCherry verwendet.
      HINWEIS: Nehmen Sie einen zusätzlichen Z-Stack mit der gleichen Schrittgröße und -reichweite im zweiten Farbkanal, wenn die 3D-Verteilung eines zusätzlichen Fluoreszenzkanals gewünscht ist. In diesem Experiment wurde zytoplasmatische mCherry verwendet, um die Zellform zu bestimmen und MreB-GFP wurde als zweiter Farbkanal21verwendet.
    4. Stellen Sie sicher, dass die Reihenfolge des Experiments auf Lambda (z-Serie) festgelegt ist, sodass vor dem Wechsel ein vollständiger Z-Stack in jedem Farbkanal erforderlich ist.
    5. Klicken Sie auf Jetzt ausführen, um die Bildaufnahme zu starten und die Datei zu speichern, wenn ein oder beide Z-Stacks abgeschlossen sind.
    6. Wechseln Sie zu einem neuen Bereich auf dem Pad, und wiederholen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.5.

5. Zellrekonstruktion

  1. Schneiden Sie einzelne Zellen zu, und speichern Sie die Bilder als gestapelte Tiff-Datei, sodass nur eine Zelle pro Datei vorhanden ist. Stellen Sie sicher, dass diese Zelle gut von allen anderen Zellen isoliert ist (d. h. etwa das 5-fache der halbmaximalen Gesamtbreite der Unschärfefunktion in xy.
    HINWEIS:     Dies kann mit frei verfügbarer Bildanalysesoftware erfolgen (siehe Materialtabelle).
    1. Zeichnen Sie ein Feld um eine einzelne Zelle, und duplizieren Sie diese Zelle 2x, einmal für jeden Kanal. Stellen Sie sicher, dass das doppelte Hyperstack-Feld aktiviert ist, und ändern Sie den Kanal auf 1 oder 2, und stellen Sie sicher, dass die Slices den gesamten Z-Stack enthalten.
      HINWEIS: Wenn nur die Form der Zellen und kein zusätzliches fluoreszierendes Protein geabbildungist wird, ist nur ein Kanal vorhanden.
    2. Sobald beide Stacks verfügbar sind, gehen Sie zu Images | Stapel | Werkzeuge | Verketten, um die Bilder zuerst mit dem Proteinkanal und dem Formkanal zu kombinieren.
    3. Speichern Sie das neue Bild als Tiff-Datei.
  2. Messen Sie die Unschärfefunktion des Mikroskops mit subdiffraktionierten fluoreszierenden Perlen22. Dies muss für jedes Mikroskop- und Mikroskopobjektiv erfolgen, kann aber vor oder nach der Abbildung der von Interesse interessierten Proben durchgeführt werden.
    1. Durchschnittlich zusammen mehrere unabhängige Perlen mit einigen manuellen Eingriffen mit verfügbarer Software (siehe Tabelle der Materialien).
      HINWEIS: Das Endprodukt sollte ein 3D-Bild der Unschärfefunktion mit dem gleichen Xyzabstand wie die von Interesse sind.
  3. Führen Sie die Skripts für die Rekonstruktion von Vorwärts-Konvolution-Zellen mithilfe der verfügbaren Software aus. Die neueste Version dieser Skripte kann frei von https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public heruntergeladen werden.
    1. Erstellen Sie einen Ordner in einem Ordner auf dem Desktop, der die zugeschnittenen Bilder und die Datei cell_shape_settings_tri.txt aus shae-cellshape-public/exampleData_tri enthält.
    2. Bearbeiten Sie cell_shape_setting_tri.txt, um die richtigen Einstellungen für das Experiment von Interesse zu erhalten. Für dieses Experiment enthält die Einstellungsdatei die folgenden Zeilen:
      nm_per_pixel 70
      Z_Skala 0,65
      stack_z_size 41
      stack_t_size 1
      Fstack_z_größe 41
      Fstack_t_größe 1
      stack_seperation_nm 100
      Fstack_seperation_nm 100
      psfScript -999 osuPSF20180726
      Gradient 1

      HINWEIS: Diese Textdatei ist in Abschnitte gegliedert und jeder Abschnitt wird in eine eigene Variable analysiert. Während viele der Einstellungen nicht von Experiment zu Experiment geändert werden müssen, sollte man sicherstellen, dass die Größe des z-Stacks (stack_z_size für Shape, Fstack_z_size für Protein von Interesse), Abstand des z-Stacks (stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), relative Fokusverschiebung des Mikroskops (Z_scale)23, die Pixelgröße in xy (nm_per_pixel) und der Name des Skripts, das die Unschärfefunktion des Mikroskops lädt (psfScript ) dem Experiment entsprechen. Das Gradientenfeld sollte auf 1 gesetzt werden, wenn der Formkanal zytoplasmatisch gefüllt ist, und 0, wenn es sich um ein membranbeflecktes Objekt handelt.
    3. Führen Sie die Cell_shape_detector3dConvTriFolder-Funktion (shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/) mit der Zeichenfolge an den Ordnerspeicherort gefolgt von der Nummer der Zelle, auf der gestartet werden soll, und der Anzahl der Zellen, die Sie ausführen möchten.
      HINWEIS: Ein Beispiel für die Eingabe sieht wie folgt aus: Cell_shape_detector3dConvTriFolder ('Pfad zum Ordner mit zugeschnittenen Bildern', Startindex im Ordner, ' von Zellen). Eine typische Zelle kann zwischen 5 und 20 min dauern, bis die Rekonstruktion konvergiert und beendet wird.
  4. Überprüfen Sie die Zellrekonstruktionen, um sicherzustellen, dass sie korrekt sind, bevor Sie die Zellen für statistische Analysen verwenden.
    1. Führen Sie ScreenFits (shae-cellshape-public/shae-fitViewerGui/) aus, um einzelne Zellrekonstruktionen visuell zu überprüfen.
    2. Klicken Sie beim Öffnen der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) auf die Schaltfläche Ordner auswählen, und wählen Sie dann den Ordner mit den in Schritt 5.3 erstellten Rekonstruktionsdatendateien (TRI.mat) aus.
    3. Wählen Sie das Feld neben der Zellenrekonstruktion aus, wenn eine Zelle falsch geformt erscheint oder nicht vollständig konvergiert (Abbildung 3). Dies könnte wie eine Zelle mit einem Loch, einer flachen Seite oder einem Zweig aussehen, der aus ihr herauskommt. Dadurch wirdFLAG' an den Dateinamen angehängt, sodass er von jeder nachgelagerten Analyse ausgeschlossen werden kann.
      HINWEIS: Die rekonstruierte Zelle kann mit den Originalbildern verglichen werden. Dies kann besonders wichtig sein, wenn Ihre Zellen aus einer verschiedenen heterogenen Population von Formen stammen.
  5. Run enrichmentSmoothingSpline (shae-cellshape-public/), um ein Anreicherungsprofil der relativen Konzentration des Proteins von Interesse in Abhängigkeit von der Gaußschen Krümmung an der Oberfläche zu erstellen.
    1. Wählen Sie jeden Ordner mit TRI.mat-Dateien aus, die in Schritt 5.3.3 erstellt wurden.
    2. Wählen Sie die neu erstellte Datei (5.5.1) curve.mat aus.
      HINWEIS: Für jeden Ordner, der in 5.5.1 ausgewählt wurde, wird eine datei curve.mat erstellt. Alle Anreicherungsprofile werden in einem Diagramm dargestellt. Wenn einzelne Diagramme erforderlich sind, als 5.5 für jeden Ordner auszuführen.
      HINWEIS: Neben der präzisen geometrischen Lokalisierung eines fluoreszierenden Proteins gibt es viele andere Möglichkeiten, die Daten aus dem sekundären Kanal zu analysieren, einschließlich der Zählung der Anzahl, Größe und Ausrichtung von Objekten4.

Ergebnisse

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Bakterien kommen in einer Vielzahl von Formen und Größen, die ihre Funktionen in der Natur bestimmen können1. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist eine genaue 3D-Darstellung von Zellen aus der vorwärts gerichteten Faltung eines Z-Stapels von Bildern (Abbildung 1). Diese Methode ist besonders wichtig, wenn sie mit gekrümmten Zellen (Abbildung 2) oder mit ungewöhnlich geformten Zellen (Abbildung 4A) umgeht, da eine 2D-Darstellung die Krümmung der Zellen nicht genau widerspiegelt. Um die Vorwärtsfaltungsmethode zu verwenden (Abbildung 1A), müssen Zellen entweder peripher gefärbt werden oder einen zytoplasmatischen Fleck haben(Abbildung 2B links vs. rechts).

Abbildung 4 zeigt die MreB-Lokalisierung in der Zelle. Eine GFP-Fusion wurde mit dem bakteriellen Aktinprotein MreB21 durchgeführt, um seine genaue Lokalisation sowohl in wildartigen als auch in mutierten E. coli-Zellen zu untersuchen4. Da MreB mit der Membran assoziiert ist, ist eine 3D-Bildgebung erforderlich, um ihre Position in der Zelle originalgetreu zu reproduzieren. Durch diese Messungen in 3D konnten wir die Formen sowohl der Wildtyp- alsauch der RodZ-Mutantenzellen rekonstruieren ( Abbildung 4A). Die Lokalisierung von MreB wurde gezeigt, um mit kleinen Gaußschen Krümmungen angereichert zu sein, ein geometrisches Merkmal, das nur in 3D gemessen werden kann, in einer RodZ-abhängigen Weise(Abbildung 4B).

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Abbildung 1: Die Forward-Konvolutionmethode rekonstruiert Zellen ohne Vorkenntnisse der Zellform. (A) Der Endausgang des Verfahrens ist eine 3D-Zellrekonstruktion, die durch den Vergleich einer Testform mit der kalibrierten Unschärfefunktion des Mikroskops abgeleitet wird. Dies wird mit dem beobachteten Z-Stack verglichen, bis das beobachtete 3D-Bild mit dem hypothetischen übereinstimmt. Das hier gezeigte Bild ist eine Darstellung der Rekonstruktion einer C. Halbmondzelle. (B) Die Rekonstruktionspipeline aktualisiert iterativ die geschätzten Positionen der Oberflächenelemente basierend auf dem beobachteten Bildstapel. Vollständige algorithmische Details der Methode finden Sie unter Nguyen3. (C) Die Rekonstruktionspipeline beginnt ohne a priori Kenntnisse der Form der Zelle und aktualisiert die Position und Anzahl der Oberflächensche, um dem beobachteten Z-Stack zu entsprechen. Repräsentative Bilder aus allen 30 Schritten während der 3D-Rekonstruktion werden aus drei verschiedenen Blickwinkeln einer V. Cholerae-Zelle gezeigt. Die Oberflächenpositionen dieser Form werden aktualisiert, um den Unterschied zwischen den simulierten und beobachteten Stapeln zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von drei verschiedenen geformten Bakterienarten. Dreidimensionale Rekonstruktionen können aus Zellen mit ihrer Membran gefärbt (links) oder gefüllt mit einem zytoplasmatischen Fluorophor (rechts) erfolgen. Die Form und Krümmung der Ausgangszelle ist nicht wichtig, da ein gebogener Stab, eine verdrillte Stange oder eine gerade Stange alle genau rekonstruiert werden können. Die rekonstruierten Oberflächen werden auf der Grundlage der lokalen Gaußschen Krümmung der Oberfläche gefärbt. Maßstabsleiste = 1 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Rekonstruktionen können aus mehreren Gründen fehlschlagen. Zellen müssen überprüft werden, um sicherzustellen, dass der Rekonstruktionsalgorithmus zu einem vernünftigen Ergebnis konvergiert. Links = repräsentativer Wildtyp (oben) und RodZ mutiert (unten) E. coli-Zellen, die die Qualitätskontrolle bestanden haben. Rechts = Zellen, die nicht ordnungsgemäß rekonstruiert wurden und die Qualitätskontrolle nicht bestanden haben. Es werden fünf Klassen fehlgeschlagener Konvergenz gezeigt: (i) Zellen, die zu nahe am Rand des Zuschneidebereichs liegen, was zu einer scharfen Abgrenzung führt, (ii) Zellen, die zu nahe an einer anderen Zelle liegen, (iii) Zellen, die ein Divot,(iv) Zellen erzeugten, die nicht über die ursprünglichen s und (v) andere unbekannte Fehler. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Repräsentative Daten, die die Proteinlokalisierung auf bestimmte zelluläre Geometrien zeigen. (A) Dreidimensional rekonstruierte Zellen des wilden Typs und RodZ E. coli-Zellen mit Gaußsche Krümmung und MreB-Fluoreszenzintensität angezeigt. Skala bar = 1 m . (B) Anreicherungsdiagramme von MreB aus Wildtyp und RodZ E. coli-Zellen. Werte >1 zeigen anreicherung und Werte <1 zeigen die Erschöpfung von MreB aus diesen zellulären Regionen relativ zur gleichmäßigen Abdeckung der Zelle. Schattierte Bereiche geben ein mittleres Bootstrap-Konfidenzintervall von 90 % des Mittelwerts an. Die Kurve für jede Dehnung ist ein kubischer Glättungsspline und wird mit einem Wahrscheinlichkeitsschwellenwert für extreme Krümmungen von p > 5 x 10-3abgeschnitten. Diese Zahl wurde ab (Bratton et al.) geändert. 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Erfassung hochwertiger Bilder. Um die Zellen richtig zu rekonstruieren, muss über und unter der Zelle genügend Unschärfe vorhanden sein. Daher ist es zwingend erforderlich, dass der z-Stack genommen einen ausreichend großen Abstand zurücklegt. Die Anzahl der Schritte, die während der Bildaufnahme ausgeführt wurden, kann für jede Belastung angepasst werden. E. coli-Zellen, die für rodZ gelöscht wurden, sind beispielsweise breiter und erfordern mehr Schritte und damit einen größeren Abstand als Wildtypzellen. Wenn die Probe während der Bildaufnahme driftet, kann die Rekonstruktion große Fehler aufweisen. Daher ist es wichtig, das Dia vor der Bildgebung mit dem Mikroskop in ein thermisches Gleichgewicht kommen zu lassen, um Eine Drift während der Z-Stack-Erfassung zu vermeiden. Zellen sollten auf Pads mit geringer Autofluoreszenz abgebildet werden. Medienkomponenten, wie sie im gemeinsamen LB-Medium gefunden werden, weisen eine Autofluoreszenz auf, die Probleme beim Versuch, die Zellen zu rekonstruieren, verursachen kann. Die Dichte der Zellen auf dem Bildgebungspad ist wichtig, da der Rekonstruktionsprozess unabhängig an jeder Zelle durchgeführt wird. Zu wenige Zellen erhöhen die Zeit, die benötigt wird, um Bilder einer ausreichenden Anzahl von Zellen zu erhalten, während zu viele Zellen zu bildgebenden Feldern führen, die zu dicht sind, um einzelne Zellen leicht zubeschneiden. Da nicht alle Zellen ordnungsgemäß rekonstruieren, sollten während des Erfassungsschritts zusätzliche Zellen abgebildet werden, und alle Ausgaben sollten überprüft werden, bevor sie mit der statistischen Analyse fortfahren (Abbildung 3).

Viele der Einschränkungen für diese Methode sind technisch. Auf dem zu verwendenden Mikroskop muss ein Objektiv mit einer hohen numerischen Blende (typischerweise >1.4) haben, da dies eine optische Schnittbildung auf der Größenskala von Bakterien ermöglicht. Zusätzlich muss das Mikroskop mit einer Piezostufe ausgestattet sein, die kleine, präzise Schritte in Z-Richtung machen kann. Darüber hinaus ist der Zugriff auf Rechenressourcen mit hohem Durchsatz für die Ausführung der Bildanalysesoftware dringend zu empfehlen, da die Verarbeitungszeit für die Rekonstruktion von Zellen reduziert wird.

Eine konzeptionelle Einschränkung der Methode besteht darin, dass die richtigen Energiewaagen zur Gewichtung der Glätte der Rekonstruktion im Verhältnis zum Signal-Rausch-Verhältnis der Bilder gewählt werden müssen. Um eine Auswahl von Parametern zu validieren, sollten die Größen und Formen der Zellen mit unabhängigen Methoden wie der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder der Atomkraftmikroskopie (AFM) gemessen werden. Als Beweis des Prinzips wurden 3D-Rekonstruktionen von Zellen entweder auf einem AFM durchgeführt, um auf Z-Genauigkeit (<50 nm) oder auf einem TEM-Raster zu testen, um xy-Genauigkeit (<30 nm)3zu testen. Ein solcher korrelierter Ansatz ist zeitaufwändig und kostspielig. Ein einfacherer Ansatz kann darin bestehen, Standardproben wie Wildtypzellen oder kugelförmige Perlen mit 1 m zu abbilden. Der Durchmesser und die Pracht der Rekonstruktionen können verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Größe und Energiewaagen, die bei der Rekonstruktion verwendet werden, korrekt sind.

Dies ist nicht die einzige Methode, die versucht, hochauflösende räumliche Informationen aus Fluoreszenzmikroskopiebildern zu extrahieren. Viele Rezensionsartikel beschreiben die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Superauflösungsmikroskopie24,25. Auflösungssteigernde Techniken wie Dekonvolutionmikroskopie26, Spinnscheibe Konfokalmikroskopie27, Pixel-Neuzuweisung28und strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM)29 zielen darauf ab, die Auflösung der Vom Mikroskop aufgenommene Bilder. Diese Methoden sind mit dem vorgestellten Ansatz nicht unvereinbar. Kürzlich wurde diese Methode angepasst, um SIM-basierte Bilder als Eingänge9zu ermöglichen. Während die Forward-Convolution-Methode einen Teil ihrer Grundlagen mit der Dekonvolutionmikroskopie teilt, hat sie eine völlig andere Ausgabe. Während Ansätze wie die Dekonvolutionmikroskopie die Auflösung des Bildes verbessern wollen, erzeugt dieser Ansatz kein Bild, sondern eine Zellformrekonstruktion mit etwa 50 nm Präzision. Einzelmolekül-Aktivkontrollmikroskopie-Techniken auf Basis spärlich beschrifteter Proben können noch höhere räumliche Präzision spart als diese Methode. In vielen Fällen erfordern diese Einzelmolekülansätze eine Optimierung der fluoreszierenden Konstrukte und können lange Erfassungszeiten erfordern, was die Verwendung mit lebenden oder dynamischen Proben erschwert. Jede dieser Methoden enthält eine oder mehrere Vorbehalte, die diese Methode nicht enthält. Zum Beispiel sind die Vorteile, die durch die konfokale Mikroskopie der Spinnscheibe beworben werden, nicht so anwendbar für Monolayer von Bakterienzellen, wo es nicht viel aus ebenem Licht gibt. Darüber hinaus bietet diese Methode eine Pipeline, um genaue 3D-Zellformen und Proteinlokalisierung ohne spezielle Fluorophore zu erfassen. Diese Methode hat minimale Hardwareanforderungen (d. h. z piezo, hohes NA-Objektiv) und erfordert nur Dutzende von Bildern pro Zeitpunkt, so dass man dynamische 3D-Strukturen leicht untersuchen kann6.

Es gibt immer mehr Ansätze, um die Organisation von Bakterienzellen in 3D-Strukturen zu untersuchen. Dazu gehören konzeptionell ähnliche Ansätze, die von hochwertigen 3D-Fluoreszenzbildern30,31,32profitieren. Dieser Ansatz erfordert gut isolierte Zellen und macht keine a priori Annahmen über zelluläre Geometrie. Um sich jedoch in dichte Zellaggregate oder Biofilme zu bewegen, wird angenommen, dass die Zellen stabartig sind. Diese Ansicht mit niedrigerer Auflösung ermöglicht weiterhin die Untersuchung der Verpackungsanordnungen der Zellen, obwohl die hohe Dichte der Zellen im Biofilm die Analyse der subzellulären Lokalisierung bestimmter Faktoren verhindert.

In Zukunft könnte es interessant sein, einen Rahmen zu entwickeln, um das einzelne Molekül und weiträumige Ansätze in diese 3D-Rekonstruktionstechnik zu integrieren. Darüber hinaus kann es möglich sein, diesen Vorwärts-Faltungsansatz mit Werkzeug für die Bildverarbeitungsegmentierung32 aufzunehmen, um Rekonstruktionen von dichteren Zellclustern zu ermöglichen.

Warum sich Zellen zu bestimmten Formen entwickelt haben, ist ein komplexes Problem, das die komplexe Umgebung widerspiegeln muss, in der sie leben. Um die Evolution und Funktion von Zellformen zu verstehen, müssen präzise und genaue Messungen dieser Formen durchgeführt werden, was diese Methode bietet.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Wir danken Jeffrey Nguyen und Joshua Shaevitz für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode.
Finanzierung: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Glenn Centers for Aging Research and National Science Foundation PHY-1734030.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
50 nm fluoreszierende KügelchenInvitrogenF8795diese werden verwendet, um die Unschärfefunktion des Mikroskops
zu messen Agarosesigma-AldrichA9539
WattestäbchenPuritan Medical Products Company LLCS304659zum Auftragen von VaLaP-Deckgläsern
verwendet VWR16004-302
FijiImageJhttps://fiji.sczur
FM4-64InvitrogenLST3166Membranfarbstoff zur Färbung von Zellen
Huygens SoftwareScientific Volume ImagingHuygens unverzichtbar oder professionellVerwendung zur Messung der Unschärfefunktion des Mikroskops
LanolinSigma-AldrichL7387kombiniert mit Paraffin und Vaseline zur Herstellung von VaLaP
LB WachstumsmediumBD Difco
M63 MediumUS BiologicalM1015
MATLABMathworksBenötigt zum Ausführen von Vorwärtsfaltungsskripten
ObjektträgerFisher12-550-133
NIS ElementsNkon
ParaffinSigma-Aldrich327212
Petroleum JellyEquate49035-038-27
Piezo Z-TischNikon77011589
Piptierspitzen -p200USA Scientific1111-0730
Pipettenspitzen - p10USA Scientific1111-3730
Verkürzung von Zellen DF0446173

Referenzen

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Fluorescent MicroscopyZ Stack AcquisitionMATLAB Image ProcessingGaussian CurvatureCell Shape ReconstructionForward Convolution TechniqueAgarose Pad Preparation

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