Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden

Zusammenfassung

Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.

Zusammenfassung

Mykobakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, setzen natürlich extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die immunologisch aktive Moleküle enthalten. Das Wissen über die molekularen Mechanismen der Vesikelbiogenese, den Gehalt der Vesikel und ihre Funktionen an der Pathogen-Host-Schnittstelle ist sehr begrenzt. Um diese Fragen zu lösen, sind strenge Verfahren für die Isolierung, Reinigung und Validierung von Elektrofahrzeugen erforderlich. Zuvor wurde festgestellt, dass die Vesikelproduktion verbessert wurde, wenn M. tuberculosis einer Eisenbeschränkung ausgesetzt war, ein Zustand, dem Mtb in der Wirtsumgebung begegnete. Hier wird ein vollständiges und detailliertes Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Elektrofahrzeugen von eisenmangeligen Mykobakterien vorgestellt. Quantitative und qualitative Methoden werden angewendet, um gereinigte Elektrofahrzeuge zu validieren.

Einleitung

Mykobakterielle extrazelluläre Vesikel (MEVs) sind membrangebundene Nanopartikel mit einer Größe von 60 bis 300 nm, die natürlicherweise von schnell- und langsam wachsenden Mykobakterien freigesetzt werden¹. MEVs, die von pathogenen Mykobakterien freigesetzt werden, bilden einen Mechanismus, um mit dem Wirt über immunologisch aktive Proteine, Lipide und Glykolipide zu interagieren, die konzentriert und geschützt abgesondert werden^2,3,4. Um MEVs zu charakterisieren und ihre Biogenese und Funktionen zu verstehen, sind strenge und effiziente Methoden der Vesikelreinigung und -validierung von entscheidender Bedeutung. Bisher wurden MEVs aus den Kulturfiltraten von Mykobakterien isoliert, die in einem eisenreichen^Medium1^,5,6,7,8angebaut wurden.

Frühere Arbeiten zeigten jedoch, dass die Eisenbegrenzung die Freisetzung von Vesikel in Mtb stark stimuliert, möglicherweise um Eisen über Mycobactin zu fangen, ein Siderophor, das in MEVs⁹abgesondert wird. Obwohl Verfahren für die Isolierung von MEVs von Mtb, die in eisenhohem Medium kultiviert wurden, beschrieben wurden, wurde keine effiziente Methode zur Gewinnung von MEVs aus eisenarmen Kulturen beschrieben. Daher ist das Ziel dieser Methode, MEVs aus niedrigen Eisenkulturen zu isolieren, zu reinigen und zu quantifizieren, so dass sie für biochemische und funktionelle Tests und für die Analyse genetischer Determinanten der Vesikelproduktion in Mykobakterien verwendet werden können.

Protokoll

1. Vorbereitung des eisenabschöpfungsorientierten definierten Mediums

1. Bereiten Sie 1 l minimalen Medium (MM) durch Auflösen von 5 g KH₂PO₄, 5 g L-Asparagin, 20 ml Glycerin und 2 g Dextrose in 900 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter vor. Vermeiden Sie Glas, um Eisenkontamination zu verhindern. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 N NaOH und das Volumen auf 1 L mit Wasser ein.
2. 50 g Metallchelatharz (MCR) hinzufügen und vorsichtig mit einem magnetischen Rührstab für 24 h bei 4 °C rühren. Sterilisieren und entfernen Sie den MCR durch Filtration durch eine 0,22 m Filtereinheit mit einem Kunststoffempfänger. Um die Filtration zu beschleunigen und Filterverstopfungen zu verhindern, lassen Sie das Harz sedimentieren für ca. 30 min vor der Filtration.
   HINWEIS: Dieses Medium enthält weniger als 2 M Resteisen, wie durch atomare Absorptionsspektroskopie bestimmt.
3. Ergänzung MM mit 0,5 mg/L ZnCl₂, 40 mg/L mgSO₄und 0,1 mg/L MnSO₄. Separat, bereiten konzentrierte Bestände (1.000x) der Metallergänzungen in entionisiertem Wasser und sterilisieren durch Filtration vor MM-Supplementierung. Eisenabbau, metallergänztmm wird hier als low iron MM (LIMM) bezeichnet.
4. Aus einem 50 mM Lager von FeCl₃ in 10 mM HCl gelöst, fügen Sie 1 ml bis 1 L LIMM (50 M Endkonzentration) zu hohen Eisen MM (HIMM) vorzubereiten.

2. Heranwachsende Mykobakterien unter eisenbegrenzten Bedingungen

1. 50 l eines gefrorenen 15% Glycerinbestandes von Mtb auftauen und eine Agarplatte mit 10% ADN-Anreicherung (5 g/L Albumin, 2 g/L Dextrose und 0,85 g/L Natriumchlorid, 0,2% Glycerin und 0,05% Tween-80)¹⁰streichen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, bis Kolonien sichtbar sind.
2. Impfen Sie eine einzelne Kolonie von Mtb¹⁰ in 2 ml mykobakteriellebrües Brühemedium (Tisch aus Materialien) ergänzt mit ADN-Anreicherung. Mit Rührung bei 37 °C inkubieren.
3. Lassen Sie die Mtb-Kultur bis zur späten logarithmischen Phase wachsen (OD₅₄₀ ist 0,8 ). Um dies zu überprüfen, messen Sie den OD₅₄₀ mit einem Spektralphotometer.
4. Verteilen Sie 200 l der späten logarithmischen Kultur auf die mykobakteriellen Agarplatten (Materialtabelle), ergänzt mit 0,2% Glycerin, 0,05% Tween-80 und ADN. Impfen Sie mindestens 5 Platten. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis das Bakterienwachstum als Konfluentschicht sichtbar ist. Dies dauert 1 Woche für Mtb.
5. Nass einen sterilen Wattestäbchen in LIMM. Verwenden Sie diesen Tupfer, um Bakterien aus den Agarplatten zu sammeln und 100 ml LIMM zu impfen, um eine konzentrierte bakterielle Suspension mit einem OD₅₄₀ von 1,0 zu zu zubereiten.
6. Verdünnen Sie diese Suspension 10 mal auf 1 L mit LIMM und teilen Sie sie in zwei, 2 L sterile Kunststoffflaschen, die jeweils 500 ml Kultur enthalten.
7. Nehmen Sie 2 ml Kultur heraus und übertragen Sie sie in eine 5 ml Kulturröhre. Fügen Sie 10 l von 10% vol/vol tyloxapol hinzu.
8. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C stehend für 14 Tage.

3. Sammlung von MEVs

1. Messen Sie die OD₅₄₀ der 2-ml-Kultur zum Zeitpunkt der Sammlung. Machen Sie 1:10 serielle Verdünnungen der Kultur und Platte 100 l jeder Verdünnung auf Agarplatten mit ADN und 0,05% Tween-80.
2. Übertragen Sie die Kultur auf fünf 225 ml konische Zentrifugenrohre und Zentrifuge bei 2.850 x g für 7 min bei 20 °C.
3. Sammeln Sie den Kulturüberstand mit einer 50 ml Pipette und filtern Sie ihn durch eine 0,22 m Filtereinheit.

4. Isolierung von MEVs

1. Übertragen Sie das Kulturfiltrat in ein bei 4 °C platziertes Gerührzell-Ultrafiltrationssystem und filtern Sie das Konzentrat bei <50 psi durch eine 100 kDa-Grenzmembran auf 50 ml.
2. Zentrifugieren Sie das konzentrierte Kulturfiltrat bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand.
3. Zentrifugieren Sie das Kulturfiltrat in Polycarbonat-Ultrazentrifugationsröhrchen bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C.
4. Die membranösen Pellets in insgesamt 1 ml steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) durch sanfteS Pipettieren wieder aufhängen.
5. Mischen Sie 0,5 ml der in Schritt 4,4 erhaltenen Pelletsuspension mit 1,5 ml 60% Iodixanollösung, was zu einer endgültigen Iodixanolkonzentration von 45% wt/vol führt. Geben Sie diese Mischung an der Unterseite eines 13 mm x 51 mm Polypropylen dünnwandigen Ultrazentrifugenrohres aus.
6. Überlagern Sie die MEV-Iodixanol 45% Suspension mit 1 ml von 40%, 35%, 30%, 25% und 20% (vol/vol in PBS) Iodixanol-Lösungen und 1 ml PBS an der Spitze.
7. Zentrifuge bei 100.000 x g für 18 h bei 4 °C.
8. Sammeln Sie die 1 ml Dichtegradientenfraktionen von oben mit einer 1 ml Hamilton Spritze.
9. Jede gesammelte Fraktion mit PBS und Zentrifuge bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C auf 20 ml verdünnen.
10. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in 0,5 ml PBS aus. Bewahren Sie dieses Pellet bei 4 °C auf.

5. Quantifizierung von MEVs

1. Messen Sie die Proteinkonzentration in jeder Fraktion durch einen Bradford-Assay (Materialtabelle ),der den Richtlinien des Herstellers folgt.
2. Führen Sie eine Membranlipidanalyse durch.
   1. Inkubieren Sie 10 l jeder Gradientenfraktion mit der fluoreszierenden Membransonde 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatrien p-Toluenesulfonat (TMA-DPH) in einer Endkonzentration von 1 g/ml in einem abschließenden 50-L-Volumen von PBS in 96 gut schwarz Platten.
   2. Inkubieren Sie die Platten bei 33 °C für 20 min.
   3. Messen Sie die Fluoreszenz bei 360 nm Anregung und 430 nm Emission.

6. Qualitative Analyse von MEVs

1. Führen Sie Proteinelektrophorese durch.
   1. Mischen Sie ca. 1 g MEV-Proben in 16 l mit 4 l 5x Probenladepuffer (10% w/v SDS, 10 mM Dithiothreitol, 20% v/v Glycerin 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v Bromphenolblau) und erhitzen die Proben im Probenpuffer bei 85 °C für 5 min.
   2. In einem 10% Tris/Glycine SDS-Polyacrylamid-Gel¹¹ eintragen und bei 10 V/cm im Laufpuffer (25 mM Tris-Basis, 190 mM Glycin, 0,1% SDS) laufen, bis die blaue Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
   3. Färben Sie das Gel mit einer ultraempfindlichen Protein-Färbelösung (Tabelle der Materialien).
2. Führen Sie den Punktfleck aus.
   1. Laden Sie 2 l einer MEVs-Aufhängung mit einer Konzentration von ca. 0,5 g/l und zweifach serielle Verdünnungen auf eine Nitrocellulosemembran und Verfahren für einen Punktblot gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Verwenden Sie ein Antiserum, das bei Mäusen gegen eine Präparation von MEVs bei einer Verdünnung von 1:5.000 als primärer Antikörper und einer Mitmagerantimaus gekoppelt an Meerrettichperoxidase (HRP) bei einer Verdünnung von 1:10.000 als sekundärer Antikörper aufgezogen wird. Detektieren Sie Antigen-Antikörper-Komplexe mit einem geeigneten HRP-Substrat-Blotting Detection Reagenz und einem Bildgebungssystem.
3. Führen Sie negative Färbung und Elektronenmikroskopie durch.
   1. Fix 250 l MEVs mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 m Cacodylat bei Raumtemperatur für 2 h und über Nacht in 4% Formaldehyd, 1% Glutaraldehyd und 0,1% PBS inkubieren.
   2. Die festen Proben mit 2% Osmiumtetroxid für 90 min färben.
   3. Die Probe seriell in Ethanol dehydrieren und in Spurrs Epoxidharz einbetten.
   4. Beobachten Sie die MEVs unter einem Transmissionselektronenmikroskop.

Ergebnisse

MEVs wurden durch Differentialsedimentation in einem Dichtegradienten gereinigt (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter den beschriebenen Bedingungen trennten sich DIE MEVs meist in Gradientenfraktion 3 (F3), was 25% Iodixanol entspricht. Diese Schlussfolgerung basiert auf dem Nachweis von Protein, Membranlipid, mikroskopischer Visualisierung intakter MEVs, Nanopartikelgrößenverteilung und positiver Reaktivität mit einem Antivesicle An...

Diskussion

Mehrere Methoden zur Reinigung von eukaryotischen Zell-abgeleiteten Exosomen wurden entwickelt¹². Im Gegensatz dazu gibt es nur begrenzte Informationen über wirksame Methoden zur Reinigung von bakteriellen EVs⁷. Effiziente Isolierung von Mtb-abgeleiteten Elektrofahrzeugen muss die intrinsischen Schwierigkeiten beim Anbau dieses pathogenen Mycobacteriums berücksichtigen. Mtb hat eine lange Teilungszeit (24 h) und sollte unter Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) Bedingungen beha...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amicon Rührzelle Modell 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltrationssystem
BD Polypropylen 225 mL konische Röhrchen	Fisher	05-538-61	Konische Zentrifugenröhrchen
Biomax 100 kDa Cut-off-Ultrafiltrationsmembran	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltrationsmembran
Chelex-100 Harz	Bio-Rad	142-2842	Metall Chelatbildnerharz
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mykobakterielle Agarplatten
Middlebrook 7H9 Bouillon	BD Difco	271310	Mykobakterienbrühe Medium
Nitrocellulose-Blotting-Membran	GE Healthcare	10600001	Blotting-Membran
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonat ultra-Zentrifugation Röhrchen 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonat-Ultra-Zentrifugationsröhrchen 25 mm x 89 mm
dünnwandiges Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen 13 mm x 15 mm	Beckman Coulter	344059	dünnwandiges Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen 13 mm x 15 mm
Protein-Assay-Farbstoff	BioRad	5000006	Bradford-Proteinfärbung
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Hochempfindliche Proteinfärbung
TMA-DPH	Molekulare Sonden	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-Hexatrien p-Toluolsulfonat-Vakuumfiltrationskolben
	CellPro	V50022	Filtereinheit