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Methodenartikel

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

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DOI:

10.3791/60362

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29. Oktober 2019

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1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Zusammenfassung

C. elegans ist das führende System zur systematischen Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse während der embryonalen Entwicklung. Eine Herausforderung besteht darin, dass sich die Embryogenese über einen Zeitraum von etwa 13 h dynamisch entfaltet; diese halbtägige Zeitskala hat den Umfang der Experimente eingeschränkt, indem die Anzahl der Embryonen, die abgebildet werden können, begrenzt wurde. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit halbhohem Durchsatz, das die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung bei 80–100 Embryonen bei moderater Zeitauflösung von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchskapazität implementiert werden. Der Nutzen dieses Protokolls wird demonstriert, indem es verwendet wird, um zwei kundenspezifische Stämme abzubilden, die fluoreszierende Marker ausdrücken, die optimiert sind, um schlüsselwichtige Aspekte der Keimschichtspezifikation und Morphogenese zu visualisieren. Um die Daten zu analysieren, wurde ein benutzerdefiniertes Programm erstellt, das einzelne Embryonen aus einem breiteren Sichtfeld in allen Kanälen, Z-Schritten und Zeitpunkten schneidet und die Sequenzen für jeden Embryo in einen separaten Tiff-Stack speichert. Das Programm, das eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche (GUI) umfasst, optimiert die Datenverarbeitung durch Isolierung, Vorverarbeitung und gleichmäßige Ausrichtung einzelner Embryonen zur Vorbereitung auf Visualisierung oder automatisierte Analyse. Ebenfalls mitgeliefert wird ein ImageJ-Makro, das einzelne Embryodaten in eine Multi-Panel-Datei zusammenfasst, die maximale Fluoreszenzprojektion und Hellfeldbilder für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt anzeigt. Die hier beschriebenen Protokolle und Werkzeuge wurden validiert, indem sie zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen verwendet wurden; Diese Analyse visualisierte zuvor kommentierte Entwicklungsphänotypen und zeigte neue. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine halbhohe Durchsatz-Bildgebungsmethode in Verbindung mit einem Zuschneideprogramm und einem ImageJ-Visualisierungstool, das in Kombination mit Stämmen, die informative Fluoreszenzmarker exdrücken, Experimente zur Analyse erheblich beschleunigt. embryonale Entwicklung.

Einleitung

Der C. elegans Embryo ist ein wichtiges Modellsystem für die mechanistische Zellbiologie und Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse, die die embryonale Entwicklung antreiben1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Bis heute wurde ein Großteil der Charakterisierung sowohl von Ereignissen auf zellulärer Ebene als auch von Zellschicksalsspezifikationen im Embryo mit relativ hohen zeitlichen Auflösungsexperimenten erreicht, die fluoreszierende Marker. Obwohl dieser Ansatz für Ereignisse in der Größenordnung von Sekunden bis zehn Minuten gut geeignet ist, wird er technisch einschränkend für die Charakterisierung längerer Prozesse in der Reihenfolge von Stunden zu Tagen. Die embryonale Entwicklung von der ersten Spaltung bis zum Ende der Dehnung dauert etwa 10 h. Bei dieser Zeitskala würden halbhohe Durchsatzmethoden, die eine gleichzeitige Bildgebung mit niedrigerer Zeitauflösung (d. h. Erfassung in 5–20 min Zeitintervallen) größerer Kohorten von Embryonen aus unterschiedlichen Bedingungen ermöglichen würden, eine neue Reihe von Experimenten eröffnen; z. B. die Ermöglichung systematischer groß angelegter Screening-Bemühungen und die Analyse einer ausreichenden Anzahl von Embryonen für Vergleiche der Folgen molekularer Störungen.

Hier beschreiben wir eine methode mit einem halbhohen Durchsatz zur Überwachung der C. elegans embryogenese, die die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung in 80–100 Embryonen von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach zu implementieren und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchsfähigkeiten durchgeführt werden. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind in Abbildung 1beschrieben. Kurz gesagt, Embryonen werden von gravid Erwachsenen seziert, die fluoreszierende Marker von Interesse ausdrücken und junge Embryonen (2–8 Zellstadium) in Brunnen einer 384-Well-Platte für die Bildgebung übertragen. In diesem Format trichtert die relativ kleine Brunnengröße Embryonen in einen engen Bereich, was die Identifizierung von Feldern mit mehreren Embryonen für die Zeitraffer-Bildgebung erleichtert. Um die ungefähr synchrone Entwicklung über die Kohorte von Embryonen hinweg aufrechtzuerhalten, werden Sezierungen in gekühlten Medien durchgeführt und die Platte auf Eis gehalten, was eine signifikante Entwicklung während des stundenlangen Sezierzeitfensters verhindert. Die Platte wird auf das Mikroskop übertragen und Embryonen werden in einem temperaturgeregelten Raum über Nacht gefilmt, in 20 min Zeitintervallen, mit einer 60x Öl-Tauchlinse 1,35 NA-Linse, um den gesamten Z-Bereich in 2 m Schritten zu sammeln. Fünfzig Felder, die jeweils zwischen 1 und 5 Embryonen enthalten, werden in einem einzigen Nachtlauf abgebildet. Je nach gewünschtem Experiment könnte die Zeitauflösung erhöht werden (z. B. Bildgebung in 5–10 min Intervallen), indem die Anzahl der abgebildeten Felder proportional verringert wird.

Mit diesem Protokoll erzeugt selbst ein einziger Nachtlauf eine signifikante Datenmenge (80–100 Embryonen, die über 50 Felder verteilt sind) und größere Experimente können in Bezug auf die Datenanalyse schnell unüberschaubar werden. Um die Verarbeitung, Visualisierung und Rationalisierung dieser Daten zu erleichtern, wurde ein Programm entwickelt, um Embryonen auszuschneiden und auszurichten und Vorverarbeitungsschritte durchzuführen (optional), und ein ImageJ-Makro, das die Daten kompiliert, um die Anzeige zu vereinfachen. Diese Programme können verwendet werden, um Bilder zu verarbeiten, die mit konventionellen Ansätzen gesammelt wurden, da sie unabhängig von der Bildgebungsmethode sind und nur eine einzige Hellfeldebene erfordern. Das erste Programm nimmt ein 4D-Feld auf, das mehrere Embryonen (GUI-Option oder Quellcode embryoCrop.py) oder mehrere 4D-Felder enthält, die mehrere Embryonen enthalten (screenCrop.py), schneidet Embryonen fest und orientiert sie in einer vorderen Posterior-Konfiguration. Diese Programme geben Benutzern auch die Möglichkeit, Hintergrundsubtraktion, Driftkorrektur und Dämpfungskorrektur durchzuführen. Die resultierenden Dateien sind einheitlich vorverarbeitete, eng zugeschnittene Tiff-Stacks für jeden Embryo, die für die automatisierte Bildanalyse geändert werden können. Um das Anzeigen aller Embryonen für jede Bedingung zu vereinfachen, wurde ein ImageJ-Makro (OpenandCombine_embsV2.ijm) geschrieben, das alle Embryonen aus einem bestimmten Zustand zu einem einzigen Tiff-Stack zusammenfügt und hellfeldbildende Bilder und eine Projektionsfarbe mit maximaler Intensität ( RGB) Überlagerungen, nebeneinander, für jeden Embryo. Die Methoden wurden validiert, indem sie verwendet wurden, um die embryonale Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen in einem Paar von kundenspezifischen Stämmen zu charakterisieren, die fluoreszierende Marker exdrücken, die optimiert sind, um Schlüsselaspekte der Keimschicht zu visualisieren. Spezifikation und Morphogenese10,11. Zusammen werden das semi-hohe Durchsatz-Embryo-Bildgebungsprotokoll und bildverarbeitende Werkzeuge höhere Probenzahlenexperimente und groß angelegte Screening-Bemühungen ermöglichen, die darauf abzielen, Entwicklungsprozesse zu verstehen. Darüber hinaus werden diese Stämme auch ein effizientes Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen molekularer Störungen auf die Embryogenese bieten.

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Protokoll

1. Vorbereitung von C. elegans Embryonen für die Bildgebung mit hohem Durchsatz

HINWEIS: Das Ziel dieses Teils des Protokolls ist es, eine Population von halbsynchronisierten (2 bis 8-Zellen-Stadium) C. elegans Embryonen, die von geeigneten Markerstämmen seziert werden (Abbildung 2), in eine Glasbodenplatte 384-Well-Platte für die Bildgebung zu laden. Andere Plattenformate könnten ebenfalls funktionieren, aber die 384 Brunnenplatten werden bevorzugt, weil die geringe Brunnengröße die Ausbreitung von Embryonen auf einen relativ kleinen Bereich beschränkt, was die Identifizierung von Feldern erleichtert, die mehrere Embryonen für die Zeitraffer-Bildgebung enthalten. Die ungefähre Synchronisierung der Embryonen stellt sicher, dass der gesamte Entwicklungsverlauf für jeden der Embryonen auf einem Feld erfasst wird.

  1. 5–10 ml 0,1 mg/ml Lösung des Tetramisolehydrochlorids (TMHC) in eiskaltem M9-Medium gelöst (0,45 M Na2HPO4-7H2O, 0,11 M KH2PO4, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH4Cl) während der Sezier- und Bildgebung. Dieses Medium enthält ein Anästhetikum, um sicherzustellen, dass sich bewegende geschlüpfte Larven die Bildgebung von Embryonen in früheren Entwicklungsstadien nicht stören.
    HINWEIS: Wenn Sie die Zuschneide- und Visualisierungstools zum Analysieren von Daten verwenden, die mit standardmäßigen Agarose-Pad-Montagemethoden erfasst wurden, fahren Sie mit Abschnitt 3 weiter fort.
  2. Aliquot 70 l der vorbereiteten Lösung in einzelne Brunnen einer Glasboden-384-Well-Platte mit einem Brunnen für jeden Zustand; vermeiden Sie die äußeren zwei Reihen der Platte, um Kanteneffekte zu verhindern.
    HINWEIS: Es ist nützlich, umliegende Brunnen mit klebebarer PCR-Plattenfolie zu maskieren (siehe Beispiel in Abbildung 1D), dies bewahrt benachbarte Brunnen für zukünftige Experimente und erleichtert das Auffinden geeigneter Brunnen unter dem Seziermikroskop. Sobald die Lösung aliquoted ist, halten Sie die Platte und die verbleibende Lösung während der gesamten Sezierung auf Eis.
  3. Generieren Sie Mundpipetten für die Übertragung von Embryonen aus der Depressionsrutsche (wo die gravid hermaphrodites seziert werden) zu den Brunnen. Kapillarpipezen (25 l kalibrierte Pipetten) über eine Flamme ziehen und brechen, um ein feines verjüngtes Ende zu erzeugen(Abbildung 1D). Eine Pipette wird pro Zustand benötigt, um Kreuzkontamination zu verhindern; Pipetten nach Gebrauch entsorgen.
  4. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um 10 Gravid-Erwachsene unter einem Sezierbereich in 150 l der eiskalten TMHC-Lösung zu übertragen, die für jede Erkrankung auf eine Depressionsrutsche aufgenommen wird. Sezieren Sie die Würmer mit der Pinzette und einem Skalpell, um die Embryonen freizusetzen.
  5. Laden Sie eine gezogene Kapillarpipette in den mit den Pipetten enthaltenen Saugeraufsatz und mundpipet, um alle 2 bis 8-Zellen-Embryos in einen individuellen Brunnen der vorbereiteten Platte zu übertragen (Abbildung 1D). Vermeiden Sie die Übertragung von Embryonen im späten Stadium und Sezierreste. Untersuchen Sie unter einem Sezierbereich und ob Aggregate von Embryonen vorhanden sind, Mundpipette nach oben und unten oder Tippen Klumpen von Embryonen mit Pipettenspitze zu dispergieren.
    HINWEIS: Um Kreuzkontamination zu vermeiden, reinigen Sie Seziergeräte und verwenden Sie eine frische Mundleitung, während Sie sich zwischen den Bedingungen bewegen. Platte zwischen den Sezierungen auf Eis lagern.
  6. Sobald Würmer aus allen Bedingungen seziert und Embryonen in ihren entsprechenden Brunnen gelegt wurden, drehen Sie die 384-Well-Platte für 1 min bei 600 x g, um die Embryonen zu begleichen.
  7. Wischen Sie den Boden der Platte mit einem mit Ethanol getränkten Tuch ab, um Rückstände zu entfernen, und legen Sie die Platte auf ein konfokales Mikroskop, das mit einem Plattenhalter ausgestattet ist, in einer temperaturgeregelten Umgebung.
    HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben diese Methode mithilfe der Lab-Einrichtung. bitte ändern Sie die Erfassungsbedingungen an die experimentellen Bedürfnisse und Ausrüstungen. Hier kommt eine konfokale Scannerbox mit einer mikrolens-verstärkten Dual-Nipkow-Spinnscheibe, einer 512 x 512 EM-CCD-Kamera, einer hochpräzisen Auto-XY-Bühne (bezeichnete Auflösung 0,1 m) und einer motorisierten Z-Achsen-Steuerung (bezeichnete Auflösung 0,1 m) zum Einsatz. Dieses System wird in einem Raum von 16 °C aufbewahrt, der die Mikroskoptemperatur während der Nachtbildgebung zwischen 21 und 23 °C hält.
  8. Um Felder mit geeigneten Embryonen zu identifizieren, führen Sie einen Vorscan von jedem Brunnen mit einem 10x 0.4 NA Objektiv und geeigneter Bildgebungssoftware durch. Die optimalsten Felder enthalten mehr als einen Embryo im Frühstadium, der sich in derselben Fokalebene wie andere Embryonen befindet und idealerweise nur minimalen Kontakt zwischen benachbarten Embryonen hat. Markieren Sie Positionen geeigneter Regionen.
  9. Um Bildgebungsfelder auszuwählen, wechseln Sie zum 60-fachen Objektiv und passen Sie die Brennebene bei jedem Punktbesuch an, um die Embryonen entsprechend zu sektionieren. 1–4 Felder pro Brunnen werden abgebildet, für insgesamt 50 Felder in 14 Brunnen, und jedes Feld kann zwischen einem und fünf Embryonen enthalten. Insgesamt werden aus jeder Erkrankung 4 bis 15 Embryonen für hochauflösende Bildgebung ausgewählt.
    HINWEIS: Eine Schlüsselvariable in diesem Schritt ist die Verwendung von ausreichend Öl; Legen Sie Öl auf das Ziel, Besuch Punkte in jedem Brunnen, um das Öl um die Oberfläche aller Brunnen zu verteilen und dann einen zusätzlichen Tropfen Öl auf das Ziel vor der Auswahl der Felder anwenden.
  10. Stellen Sie die ausgewählten Felder mit einem 60x 1,35 NA-Ziel ab, um 18 z Abschnitte in 2'm-Intervallen alle 20 min für 10 h zu erfassen. Die bildgebenden Bedingungen mit den Keimschicht- und Morphogenese-Reporterstämmen sind wie folgt: Hellfeld, 90% Leistung, 25 ms, 20% Gewinn; 488 nm, 100% Leistung, 200 ms, 60% Gewinn; 568 nm, 45% Leistung, 150 ms, 60% Gewinn.
  11. Nach Abschluss der Bildgebung, bewerten Embryonale Letalität durch durchführung einer niedrigen Vergrößerung (10x 0,4 NA Objektiv) ganze gut hellfeldscan 20-24 h nach dem Beginn der Nacht Bildgebung.

2. Embryonale Letalität Scoring

  1. Anhand der nachdem durchscannten Felder werden embryonale Letalität und Larvendefekte bewertet, indem Sie geschlüpfte Würmer und ungeschlüpfte Embryonen für jeden Brunnen zählen.
  2. Erzielen Sie ungeschlüpfte Embryonen als embryonales Tödliches. Ausschließen von verhafteten Ein- bis Vier-Zellen-Embryonen von der Tödlichkeitszahl, da junge sezierte Embryonen manchmal die Eischalenbildung nicht abschließen (wenn die Meiose II noch nicht vollständig ist) und Durchlässigkeitsfehler zu osmotischen Komplikationen in den ersten beiden Jahren führen können. Geschäftsbereiche.
  3. Partitur teilweise geschlüpfte oder vollständig geschlüpfte Würmer mit Körpermorphologie oder Verhaltensstörungen, wie dumpy oder gelähmt, als "abnormale Larve".

3. Automatisiertes Zuschneiden (Abbildung 3A)

HINWEIS: Die Software ist an zwei Standorten untergebracht: (1) Zenodo beherbergt eine benutzerfreundliche Version der Software12, die keine Programmierkenntnisse erfordert. (2) Github enthält den Quellcode für unsere embryoCropUI.py und screenCrop.py Software13, die Kenntnisse mit Python erfordern. Detaillierte Anweisungen zum Herunterladen und Bedienen beider Versionen des Programms finden Sie unten.

  1. Automatisiertes Zuschneiden mit embryoCropUI ausführbarer Version (benutzerfreundliche Version)
    1. Um das embryoCropUI-Programm zu verwenden, laden Sie zuerst das Programm von Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12herunter.
      1. Laden Sie die MacOS- oder Windows-Formatversion des Programms herunter (beachten Sie, dass für die MacOS-Version MacOS X10.11 oder höher erforderlich ist).
      2. Laden Sie die Instruktionsdatei (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx) herunter, die Schritt für Schritt Anleitung zum Testen und Verwenden des embryoCropUI-Programms bietet.
      3. Laden Sie test_files.zip herunter, um zu testen, ob das Programm auf der Plattform ordnungsgemäß funktioniert (siehe Anweisungen).
    2. Entpacken sie einmal, entpacken und navigieren Sie, um die ausführbare embryoCropUI-Datei (...'embryoCropUI-_WINDOWS-EmbryoCropUI-embryoCropUI-embryoCropUI.exe) oder (...'embryoCropUI_MacOS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe) zu finden. Doppelklicken Sie, um das Terminal zu starten (oder wählen Sie "Öffnen mit" und führen Sie die ausführbare Datei embryoCropUI aus.
    3. Die ausführbare GUI schneidet jeweils ein 4D-Sichtfeld zu. Wählen Sie in der oberen linken Ecke die Schaltfläche "Öffnen", um das bestimmte Feld zum Zuschneiden (Multi-Tiff) zu laden. Wenn Sie eine Tiff-Serie mit mehreren Dimensionen (z, Zeit, Kanal) zuschneiden, laden Sie nur das erste Bild der Serie innerhalb des Ordners (eine Tiff-Serie pro Ordner).
    4. Sobald Bilder geladen wurden, geben Sie die folgenden Informationen an: Anzahl der Z-Slices, (Z), Anzahl der Zeitpunkte (T), Anzahl der Kanäle (C), der Kanal, der DIC oder hellfeld entspricht (first=1, second=2, etc.).
    5. Wählen Sie eine zusätzliche Verarbeitung aus, die für die Bilder ausgeführt werden soll. Das Programm bietet Drift-Korrektur, Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur.
    6. Geben Sie Parameter für Die Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur an, um den Verarbeitungsaufwand in der GUI-Eingabeaufforderung zu steuern. Definieren Sie für Hintergrundsubtrahieren die größte Featuregröße, die die Größe des aussagekräftigen Signals widerspiegelt. Diese Feature-Größe sollte nicht als Hintergrund betrachtet werden und muss ein ungerader Zahlenwert sein. Geben Sie einen Wert von 0-1 für Diedämpfungskorrektur ein. Der Wert für die Dämpfungskorrektur spiegelt den Prozentsatz der ursprünglichen Intensität wider, der in der entferntesten Tiefe des abgebildeten Objekts verbleibt.
      HINWEIS: Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur müssen zusammen ausgeführt werden.
    7. Geben Sie die Bildsammlungsreihenfolge (d. h. channel-z-time (czt) oder z-channel-time (zct)) an.
    8. Geben Sie die Mikrometer pro Pixel für die Bilder basierend auf der verwendeten Kamera an.
      HINWEIS: Ein schlechter Zuschnitt des Bildes tritt auf, wenn die Pixelgröße nicht richtig definiert ist.
    9. Wählen Sie Ausführen in der unteren linken Ecke aus. Ein neuer Unterordner mit der Bezeichnung "Crop" wird im gleichen Pfad wie der nicht zugeschnittene Ordner erstellt. abgeschnittene Versionen werden an diesem Speicherort gespeichert. Je nach Dateigröße sollte das Zuschneiden innerhalb von Sekunden bis Minuten abgeschlossen sein.
  2. Automatisiertes Zuschneiden mit screenCrop.py (Batch-Version Alternative zu embryoCrop GUI oben beschrieben;Nur Python-affine Benutzer)10,13
    1. Um screenCrop.py zu verwenden, die Python-Softwareversion zum Zuschneiden größerer Datensätze in einem Batch-Format, klonen oder laden Sie den Quellcode von Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git ).
    2. Lesen Sie die Anweisungen zum Konfigurieren einer geeigneten virtuellen Umgebung, und folgen Sie dem beschriebenen Dateibenennungssystem. beide sind in der README-Datei im Github-Repository detailliert: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. Sobald Umweltvariablen und Namenskonventionen ordnungsgemäß festgelegt wurden, öffnen Sie parameters.py und screenCrop.py in einem Editor ihrer Wahl.
    4. Um einstellbare Parameter zu ändern, ohne den Quellcode zu berühren, bearbeiten Sie die parameters.py Datei.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, Parameter direkt im Header von screenCrop.py zu ändern.
      1. Wenn Sie die parameters.py Konfigurationsdatei verwenden, ändern Sie die use_configure-Einstellung in True. Wenn Sie die direkte Bearbeitung innerhalb screenCrop.py verwenden, lassen Sie die use_configure-Einstellung unter False.
      2. Suchen Sie die folgenden Informationen in der parameters.py Datei und nehmen Sie Änderungen an die gewünschten Bildparameter und Dateistruktur vor:
        1. loadFolder (Zeile 9): Wechseln Sie zu dem Laufwerk, auf dem die Dateien gespeichert sind (z. B. Z:/, D:// usw.)
        2. Datum (Zeile 7): Wechseln Sie in den Ordner, der Dateien für die Imaging-Sitzung enthält. Dies wird in der CSV-Tracking-Datei als "Experiment Folder Name" bezeichnet (siehe Anweisungen).
        3. trackingFile (Zeile 11): Wechseln Sie zum Pfad zur CSV-Datei, in der Experimentinformationen gespeichert werden.
        4. z (Zeile 13): Wird als Anzahl der z-Ebenen festgelegt.
        5. nT (Zeile14): Geben Sie die Anzahl der Zeitpunkte an.
        6. nWells (Zeile 19): Geben Sie die Anzahl der verwendeten Brunnen an.
        7. pointVisits (Zeile 20): Wird als maximale Anzahl von Punktbesuchen (pro Brunnen) festgelegt.
        8. In Zeile 10 finden Sie den Ort, der derzeit von 'CV1000/' belegt ist, und geben Sie den äußeren Ordner ein, der im Dateipfad verwendet wird. Um Probleme zu vermeiden, verwenden Sie die folgende Konvention: 'XXXXXXX/'.
        9. Geben Sie in Zeile 12 einen gültigen Dateipfad zum Speichern von Seitenverhältnisdaten für zugeschnittene Daten ein.
        10. In den Zeilen 15, 16, 17 und 18 geben True/False ein, ob die Bilder die folgende Verarbeitung durchlaufen:
          1. Eingabe True oder False für drift korrektur auf Line 15.
          2. Eingabe True oder False für Hintergrundsubtrahieren in Zeile 16. Die Feature-Größe muss empirisch für verschiedene Markerstämme und Pixelgrößen bestimmt werden. In der Konfiguration wurde die Feature-Größe als 41 für den Germ-Layer-Stamm und 201 für den Morphogenese-Stamm definiert. Hintergrundsubtrahieren muss in Verbindung mit Dämpfungskorrektur erfolgen.
          3. Eingabe True oder False für Dämpfungskorrektur auf Zeile 17.
          4. Eingabe True oder False für vordere hintere Drehung auf Zeile 18.
    5. Sobald alle Änderungen vorgenommen wurden, kann mit dem Zuschneiden begonnen werden. Wechseln Sie dazu zu screenCrop.py und wählen Sie das Wiedergabesymbol in der Symbolleiste aus, wählen Sie im Dropdown-Menü Ausführen als > Python ausführenaus.
    6. Da das Zuschneiden für ein großes Dataset mehrere Stunden dauern kann (50 Punktbesuche 18 z Schritte, 3 Kanäle, 31 Zeitpunkte), verfolgen Sie den Fortschritt des Zuschneidens im Konsolenfenster. Sobald das Zuschneiden abgeschlossen ist, zeigt ein kleines Fenster eine Vorschau der zugeschnittenen Bilder vor dem Speichern an. Für jedes Bild gibt es 3 Optionen:
      1. Speichern: Drücken Sie die Leertaste, um das Bild zu speichern, wenn das Bild ordnungsgemäß abgeschnitten wird, ohne dass Bereiche von Interesse abgeschnitten werden.
      2. X: Drücken Sie X, wenn das Bild Bereiche von Interesse abgeschnitten zu haben scheint; Das Bild wird mit einem X vor dem Namen gespeichert, um es von den anderen Bildern zu trennen.
      3. Löschen: Drücken Sie D, um das zugeschnittene Bild zu löschen, wenn das Bild nicht richtig beschnitten wird oder der Embryo nicht zufriedenstellend ist.
        HINWEIS: Die Bilder werden in einem Unterordner mit dem Namen "Cropped" im Lastordner gespeichert (definiert in Zeile 9 des Programms).

4. Visualisierung (Abbildung 4)

HINWEIS: OpenandCombine_embsV2.ijm10,12 ist ein ImageJ-Makro, das eine einfach zu erkennende tiff-Datei aus allen Bildern für eine bestimmte Dehnung und Bedingung erstellt. Installation von FIJI/ImageJ14,15 erforderlich. Dieses Makro wird entsprechend unserer Dateistruktur ausgeführt. Es muss geändert werden, um mit anderen Dateistrukturen zu arbeiten. Eine Anleitung zur richtigen Dateistruktur und eine detaillierte Beschreibung wichtiger Überlegungen finden Sie am Ende der GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx-Datei im Zenodo-Repository. Bitte lesen Sie diese Anweisungen vollständig durch, bevor Sie die Bildgebung zum ordnungsgemäßen Namen und Strukturieren von Dateien anzeigen, um die beste Schnittstelle mit diesem Makro zu erhalten. Als Referenz sieht unsere Dateispeicherortstruktur wie folgt aus:
Z:-zugeschnittene ,,Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15 Digit Unique Identifier _W'#F_T'#_Z'#_C'.tif
z.B. Z:-cropped-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

  1. Laden Sie OpenandCombine_embsV2 und GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx von Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w herunter.
  2. Bereiten Sie die folgenden Informationen vor:
    -Der Speicherort, an dem die Bildordner gespeichert werden (nach dem Zuschneiden).
    -Die Bildordnernamen für die zu verarbeitenden spezifischen Bedingungen (z. B. EMBD0002). Dies wird im obigen Beispiel als "Ziel" bezeichnet.
    -Ein 15-stelliger alphanumerischer eindeutiger Bezeichner, der für ein bestimmtes Nachtexperiment spezifisch ist – dieser Bezeichner ist der Name des Datenerfassungsordners (d. h. 20140402T140154) und der eindeutige Bezeichner ist in den individuellen tiff-Dateinamen eingebettet (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) für jeden embryonalen Embryo, der an diesem Tag abgebildet wurde. Das Makro verwendet diesen Bezeichner, um nach Embryonen zu suchen, die am selben Datum erworben wurden, und kann wiederholte Bedingungen mit separaten Datumsangaben in separaten ImageJ-Dateien zusammenstellen.
  3. Öffnen Sie ImageJ, und ziehen Sie die Makrodatei OpenandCombine_embsV2.ijmin die ImageJ-Leiste, oder öffnen Sie das Makro direkt.
  4. Sobald das Makro geöffnet ist, suchen Sie die Zeilen 3 und 4. Geben Sie die in Abschnitt 4.2 gesammelten Informationen gemäß den folgenden Schritten ein:
    1. Geben Sie in Zeile 3 (RNAL) den Zielnamen für die zu verarbeitenden Bilder ein. Geben Sie jedes Ziel in der folgenden Struktur newArray("XXXXXXXX/"); Zitate enthalten. Um mehrere Bedingungen gleichzeitig auszuführen, trennen Sie ein Komma und behalten Sie alle Zielnamen in der Klammer (z. B. newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
    2. Geben Sie in Zeile 4 (Datum) den 15-stelligen alphanumerischen eindeutigen Bezeichner in Anführungszeichen ein, z. B. newArray("20140402T140154").
  5. Drücken Sie Ausführung unten links im Makrofenster. Es wird ein Fenster angezeigt, in dem eine Eingabeaufforderung zum äußeren Ordner mit den zugeschnittenen Bildordnern (in 4.4.1) gestartet wird.
  6. Einmal ausgewählt, wird ein weiteres Fenster angezeigt, das die Angabe von Bildparametern ermöglicht.
    1. Geben Sie die Anzahl der Kanäle, die Anzahl der Z-Slices, die Schriftgröße für den Text, der zum Beschriften der kompilierten Bilder verwendet wird, und die Farbe für jeden Kanal ein.
    2. Check On /Off Auto Kontrast in allen Kanälen.
  7. Nachdem alle Parameter angegeben wurden, klicken Sie unten im Fenster auf OK. Die zusammengesetzte Datei beginnt zu montieren; Dies dauert mehrere Minuten pro Bedingung.
  8. Überprüfen Sie nach Abschluss die Dateien, die bei Bedarf geöffnet bleiben. Sie können ohne Speichern geschlossen werden, da das Makro die Dateien bereits in einem neu erstellten Ordner gespeichert hat, der wie folgt benannt ist: äußerer Ordnername (in der Eingabeaufforderung von Abschnitt 4.5 angegeben) + "-fiji-processed-output" (d.h. Z:" cropped-fiji-processed-output-EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

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Ergebnisse

Eine große Herausforderung bei der Charakterisierung der Wirkung molekularer Störungen auf die embryonale Entwicklung von C. elegans besteht darin, dass es etwa 10 h dauert, bis Embryonen von der ersten Spaltung bis zum Ende der Dehnung bei 20°16fortschreiten. Eine Methode mit halbhohem Durchsatz, bei der große Kohorten von Embryonen gleichzeitig abgebildet werden können, ist für Ereignisse auf dieser Zeitskala nützlich, da sie die Abbildung mehrerer Bedingungen parallel zu einer ausreich...

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Diskussion

Diese Arbeit beschreibt eine Reihe von Werkzeugen und Methoden, die entwickelt wurden, um größere Anstrengungen zu ermöglichen, die Funktion von Genen in der embryonalen Entwicklung in C. eleganszu profilieren. Unsere Methode mit hohem Durchsatz ermöglicht eine 3D-Zeitraffer-Bildgebung der embryonalen Entwicklung bei einer Auflösung von 20 min für 80–100 Embryonen in einem einzigen Experiment. Während dieses Protokoll für die Verwendung mit beliebigen Markerstämmen angepasst werden kann, zeigt diese Arbeit das P...

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Danksagungen

S.D.O. wurde vom National Institute of General Medical Sciences gesponserten University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524) unterstützt. A.D. und K.O. wurden vom Ludwig-Institut für Krebsforschung unterstützt, das ihnen auch Forschungsgelder zur Unterstützung dieser Arbeit zur Verfügung stellte. Wir danken Andrew Chisholm für seinen Rat in den frühen Phasen dieses Projekts, Ronald Biggs für Beiträge zu diesem Projekt nach der ersten Phase der Methodenentwicklung und Dave Jenkins und Andy Shiau für unterstützung und Zugang zur Small Molecule Discovery das high-Content-Bildgebungssystem der Gruppe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aspirator-Röhrchen-BaugruppeDrummond Scientific2-000-000
kalibrierte Pipette (25 mL)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager SoftwareYokogawa Electric CorpIm Lieferumfang des konischen Röhrchens CV1000
15 mL) enthalten)USA Scientific1475-0501
CV1000 MikroskopYokogawa Electric CorpCV1000
Depressionsobjektträger (3-Well)Erie Scientific1520-006
DissektionsmikroskopNikonSMZ-645
Eppendorf Zentrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9Pufferlabor vorbereitethttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-Foil SealBio-RadMSF1001
NGM PlattenLabor vorbereitethttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Skalpell #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-Boden, GlasbodenGreiner Bio-One781855
Tetramisol HydrochloridSigma AldirchT1512-10G
Pinzette, Dumont #3Elektronenmikroskopie Wissenschaften0109-3-PO
U-PlanApo Objektiv (10" x 0,4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo Objektiv (60 x 1,35 NA)Olympus1-U2B832
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Referenzen

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