Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Summary

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Abstract

C. elegans ist das führende System zur systematischen Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse während der embryonalen Entwicklung. Eine Herausforderung besteht darin, dass sich die Embryogenese über einen Zeitraum von etwa 13 h dynamisch entfaltet; diese halbtägige Zeitskala hat den Umfang der Experimente eingeschränkt, indem die Anzahl der Embryonen, die abgebildet werden können, begrenzt wurde. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit halbhohem Durchsatz, das die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung bei 80–100 Embryonen bei moderater Zeitauflösung von bis zu 14 verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Das Protokoll ist einfach und kann von jedem Labor mit Zugang zu einem Mikroskop mit Punktbesuchskapazität implementiert werden. Der Nutzen dieses Protokolls wird demonstriert, indem es verwendet wird, um zwei kundenspezifische Stämme abzubilden, die fluoreszierende Marker ausdrücken, die optimiert sind, um schlüsselwichtige Aspekte der Keimschichtspezifikation und Morphogenese zu visualisieren. Um die Daten zu analysieren, wurde ein benutzerdefiniertes Programm erstellt, das einzelne Embryonen aus einem breiteren Sichtfeld in allen Kanälen, Z-Schritten und Zeitpunkten schneidet und die Sequenzen für jeden Embryo in einen separaten Tiff-Stack speichert. Das Programm, das eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche (GUI) umfasst, optimiert die Datenverarbeitung durch Isolierung, Vorverarbeitung und gleichmäßige Ausrichtung einzelner Embryonen zur Vorbereitung auf Visualisierung oder automatisierte Analyse. Ebenfalls mitgeliefert wird ein ImageJ-Makro, das einzelne Embryodaten in eine Multi-Panel-Datei zusammenfasst, die maximale Fluoreszenzprojektion und Hellfeldbilder für jeden Embryo zu jedem Zeitpunkt anzeigt. Die hier beschriebenen Protokolle und Werkzeuge wurden validiert, indem sie zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung nach dem Abbau von 40 zuvor beschriebenen Entwicklungsgenen verwendet wurden; Diese Analyse visualisierte zuvor kommentierte Entwicklungsphänotypen und zeigte neue. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine halbhohe Durchsatz-Bildgebungsmethode in Verbindung mit einem Zuschneideprogramm und einem ImageJ-Visualisierungstool, das in Kombination mit Stämmen, die informative Fluoreszenzmarker exdrücken, Experimente zur Analyse erheblich beschleunigt. embryonale Entwicklung.

Introduction

Der C. elegans Embryo ist ein wichtiges Modellsystem für die mechanistische Zellbiologie und Analyse der Zellschicksalsspezifikation und morphogenetischen Ereignisse, die die embryonale Entwicklung antreiben^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Bis heute wurde ein Großteil der Charakterisierung sowohl von Ereignissen auf zellulärer Ebene als auch von Zellschicksalsspezifikation....

Protocol

1. Vorbereitung von C. elegans Embryonen für die Bildgebung mit hohem Durchsatz

HINWEIS: Das Ziel dieses Teils des Protokolls ist es, eine Population von halbsynchronisierten (2 bis 8-Zellen-Stadium) C. elegans Embryonen, die von geeigneten Markerstämmen seziert werden (Abbildung 2), in eine Glasbodenplatte 384-Well-Platte für die Bildgebung zu laden. Andere Plattenformate könnten ebenfalls funktionieren, aber die 384 Brunnenplatten werden bevorzugt, weil die geringe Brunnengröße die Ausbreitung von Embryonen auf einen relativ kleinen Bereich beschränkt, was die Identifizierung ....

Results

Eine große Herausforderung bei der Charakterisierung der Wirkung molekularer Störungen auf die embryonale Entwicklung von C. elegans besteht darin, dass es etwa 10 h dauert, bis Embryonen von der ersten Spaltung bis zum Ende der Dehnung bei 20°¹⁶fortschreiten. Eine Methode mit halbhohem Durchsatz, bei der große Kohorten von Embryonen gleichzeitig abgebildet werden können, ist für Ereignisse auf dieser Zeitskala nützlich, da sie die Abbildung mehrerer Bedingungen parallel zu einer ausreich.......

Discussion

Diese Arbeit beschreibt eine Reihe von Werkzeugen und Methoden, die entwickelt wurden, um größere Anstrengungen zu ermöglichen, die Funktion von Genen in der embryonalen Entwicklung in C. eleganszu profilieren. Unsere Methode mit hohem Durchsatz ermöglicht eine 3D-Zeitraffer-Bildgebung der embryonalen Entwicklung bei einer Auflösung von 20 min für 80–100 Embryonen in einem einzigen Experiment. Während dieses Protokoll für die Verwendung mit beliebigen Markerstämmen angepasst werden kann, zeigt diese Arbeit das P.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator-Röhrchen-Baugruppe	Drummond Scientific	2-000-000
kalibrierte Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Im Lieferumfang des konischen Röhrchens CV1000
15 mL) enthalten)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Mikroskop	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depressionsobjektträger (3-Well)	Erie Scientific	1520-006
Dissektionsmikroskop	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Zentrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9	Pufferlabor vorbereitet	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-Foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Platten	Labor vorbereitet	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Skalpell #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-Boden, Glasboden	Greiner Bio-One	781855
Tetramisol Hydrochlorid	Sigma Aldirch	T1512-10G
Pinzette, Dumont #3	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	0109-3-PO
U-PlanApo Objektiv (10" x 0,4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo Objektiv (60 x 1,35 NA)	Olympus	1-U2B832