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Methodenartikel

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

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DOI:

10.3791/60383

⸱

6. Oktober 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die Implementierung der Multiphotonenlithographie zur Herstellung dreidimensionaler Arrays von fluoreszierenden Fiduzialen, die in poly(ethylengglykol)-basierte Hydrogele eingebettet sind und als referenzfreie Traktionskraftmikroskopie verwendet werden können. Plattformen. Anhand dieser Anleitungen wird die Messung der 3D-Materialdehnung und die Berechnung der zellulären Traktionen vereinfacht, um Messungen der Traktionskraft mit hohem Durchsatz zu fördern.

Zusammenfassung

Die Quantifizierung der zellinduzierten Materialverformung liefert nützliche Informationen darüber, wie Zellen die physikalischen Eigenschaften ihrer Mikroumgebung erkennen und darauf reagieren. Während es viele Ansätze zur Messung zellinduzierter Materialstämme gibt, bieten wir hier eine Methodik zur referenzfreien Dehnungsüberwachung mit Submikronen-Auflösung an. Mit einem zweiphotonenaktivierten photolithographischen Musterverfahren zeigen wir, wie mechanisch und bioaktiv abstimmbare synthetische Substrate mit eingebetteten Arrays von fluoreszierenden Fiduzialenmarkern erzeugt werden, um dreidimensionale ( 3D) Materialverformungsprofile als Reaktion auf Oberflächentraktionen. Mit diesen Substraten können Zellspannungsprofile mit einem einzelnen 3D-Bildstapel einer von Interesse stehenden Zelle abgebildet werden. Unser Ziel mit dieser Methode ist es, die Traktionskraftmikroskopie zu einem zugänglicheren und einfacher zu implementierenden Werkzeug für Forscher zu machen, die zelluläre Mechanotransduktionsprozesse untersuchen, insbesondere Neulinge auf dem Gebiet.

Einleitung

Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) ist der Prozess der Annäherung zellulärer Traktionen unter Verwendung interpolierter Verschiebungsfelder von Treuhandmarkern, die von einer anhängerhaften und kontraktilen Zelle erzeugt werden. Mit TFM kann der Einfluss mechanischer Hinweise in der extrazellulären Umgebung auf wichtige zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration untersucht werden1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Leider können viele vorhandene Ansätze schwierig zu implementieren sein oder erfordern vertraut mit hochspezialisierten Analyse- und Rechenwerkzeugen, was die Verwendung von TFM für unerfahrene Forscher erschwert. Wir beschreiben eine Methode zur Generierung einer TFM-Plattform, die einige der Schwierigkeiten bei der Analyse eliminiert und gleichzeitig eine Datenerfassung mit hohem Durchsatz bietet.

Von den bestehenden TFM-Ansätzen umfasst die am häufigsten zur Quantifizierung der Materialdehnung verwendete Die Einbeziehung kleiner fluoreszierender Marker (typischerweise nano- oder mikrometergroße Fluoreszenzperlen) in ein verformbares Hydrogel, wie Polyacrylamid (PAA) oder Polypoly (Ethylenglykol) Diakrylat (PEGDA)13,14,15. Diese auf Perlen basierenden Ansätze bieten die Möglichkeit, fiduziale Marker dicht um eine Zelle von Interesse zu gruppieren, um die Verschiebungsprobezuszeit zu maximieren. Leider kann die Verteilung der Perlen im hydrogel nicht direkt gesteuert werden, so dass die räumliche Organisation zufällig ist. Diese zufällige Platzierung führt zu Problemen wie Perlen, die zu nah beieinander sind, um sie genau zu lösen, oder so verbreiten, dass Flecken des Substrats Daten niedriger Qualität liefern. Die Unfähigkeit vorherzusagen, wo fiducial Marker in Abwesenheit von Zellen liegen, schafft auch eine Einschränkung, dass für jeden gesammelten Satz von Zelltraktionsdaten auch ein zusätzliches Referenzbild der zugrunde liegenden Marker in einem entspannten Zustand erfasst werden muss. Das Referenzbild ist erforderlich, damit die Verschiebung im beanspruchten Bild als Differenz zwischen den gestressten und unbetonten Bildern angenähert werden kann. Um einen entspannten Zustand zu erreichen, werden die zu messenden Zellen entweder chemisch entspannt oder vollständig entfernt. Dieser Prozess verhindert oft die Erfassung weiterer experimenteller Messungen, hemmt Langzeitzellstudien und begrenzt den Durchsatz. Ein Referenzbild erfordert auch Bildregistrierungstechniken, um Driften zu ermöglichen, die während des Experimentierens aufgetreten sein können, was oft zu einer umständlichen manuellen Abgleich von Spannungszustandsbildern zu Referenzbildern führt.

Andere TFM-Methoden, die als referenzfrei gelten, implementieren irgendeine Form der Kontrolle über die Verteilung von Treuhandmarkern, entweder durch hochauflösende Lithographie, Mikrokontaktdruck oder Mikrospritzen16,17,18 ,19,20. Referenzfreies TFM wird durch die Annahme erreicht, dass der entspannte Zustand für jeden Treuhandmarker basierend darauf vorhergesagt werden kann, wie Markerpositionen während des Herstellungsprozesses vorgeschrieben wurden. Diese Methoden ermöglichen eine vollständige Erfassung des Spannungszustands einer Zelle innerhalb einer einzelnen Bildaufnahme, bei der die räumlichen Markerverschiebungen im Vergleich zu einer impliziten Referenz gemessen werden, als aus der fiducialmarker-Geometrie abgeleitet werden kann. Während die Konsistenz bei der Markerplatzierung in der Regel mit diesen Plattformen erreicht wird, leiden sie im Allgemeinen unter ihren eigenen Mängeln im Vergleich zu den weit verbreiteten, auf Perlen basierenden Ansätzen, einschließlich: 1) verringerter Traktionsauflösung; 2) verringerte Genauigkeit von Verschiebungen a-ebenen (in einigen Fällen eine vollständige Unfähigkeit zu messen); und 3) verminderte Anpassbarkeit von Plattformsubstraten und Materialien (z. B. Ligandendarstellung, mechanische Eigenschaften).

Um diese Mängel zu beheben, haben wir eine neue referenzfreie TFM-Plattform entwickelt. Die Plattform nutzt multiphotonaktivierte Chemie, um ein kleines Volumen eines Fluorophors mit bestimmten 3D-Positionen innerhalb des Hydrogels zu vernetzen, die als Treuhandmarker zur Messung der Materialbelastung dienen. Auf diese Weise haben wir eine Plattform entwickelt, die ähnlich wie perlenbasierte Ansätze funktioniert, aber mit dem erheblichen Vorteil, dass treue Marker in gerasterte Arrays organisiert sind, die eine referenzfreie Materialdehnungsverfolgung ermöglichen. Diese referenzfreie Immobilie bietet viele Vorteile. In erster Linie ermöglicht es eine nicht-intrusive Überwachung von zellulären Traktionszuständen (d. h. umgeht die Notwendigkeit, Zellen zu entspannen oder zu entfernen, um Referenzpositionen von verdrängten Treuhandmarkern zu erhalten). Dies war unser primäres Ziel bei der Entwicklung dieses Systems, da wir beabsichtigten, andere nachgelagerte Analysemethoden in Verbindung mit TFM zu integrieren, was mit zerstörerischen Endpunkt-TFM-Ansätzen schwierig sein kann. Zweitens ermöglicht die Verwendung einer impliziten Referenz basierend auf gerasterten Arrays eine nahezu vollständige Automatisierung der Verschiebungsanalyse. Die Regelmäßigkeit der Arrays erzeugt einen vorhersagbaren Workflow, bei dem das Auftreten von Ausnahmefällen (d. h. Beispielzellendaten, die unerwartete Artefakte wie suboptimale Markerabstände oder Registrierungsübereinstimmungen enthalten) auf einem Minimum beibehalten werden kann. Drittens bietet der Weg fallder ein Referenzbild die Freiheit, viele Zellen in einer einzigen Probe über einen längeren Zeitraum zu überwachen. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Perlen-basierten Ansätzen, bei denen sich je nach Genauigkeit der automatisierten Bühnenbewegungen des Mikroskops Fehler bei der Positionierung ansammeln und die Schwierigkeit erhöhen können, Referenzbilder auf Zellspannung richtig zu registrieren. Bilder. Insgesamt ermöglicht diese Plattform einen höheren Durchsatz beim Sammeln zellulärer Spannungsdaten.

Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Leser mit der zwei-Photonen- laserscannenden Lithographie-Technik vertraut zu machen, die wir implementiert haben, um diese referenzfreie TFM-Plattform zu generieren, um in-plane und a-plane Traktionskomponenten zu messen, die von Zellen erzeugt werden, die ausgesät werden. auf der Oberfläche. Nicht in diesem Protokoll enthalten ist die Synthese einiger monomerer Komponenten. Im Allgemeinen umfassen diese Reaktionen fast identische "Ein-Topf"-Synthese-Reaktionsschemata, die zuvor21beschrieben wurden, und Alternativen zu diesen Produkten können ebenfalls gekauft werden. Unser Ziel ist es auch, die Leser mit den softwarebasierten Tools vertraut zu machen, die wir erstellt haben, um den Einsatz von handelsüblichen Laser-Scanning-Mikroskopen als 3D-Druckwerkzeuge zu fördern und die Analyse von fiduzialen Markerverschiebungen zu erleichtern.

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Protokoll

1. Photopolymerisierung eines PEGDA-Basishydrogels

  1. Sammeln von Reagenzien
    1. Sammeln Sie Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP), 3,4 kDa-Poly(Ethylen)-Glykoldiakrylat (PEGDA), n-Vinylpyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mit PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mit PEGDA (PEG-633) und PEGylatiertem RGDS-Peptid ( PEG-RGDS) aus den jeweiligen Gefriertruhen und bringen sie jeweils auf Raumtemperatur.
    2. In separaten Bernstein-Mikrozentrifugenröhrchen 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633 und 6 mg RGDS-Peptid messen.
  2. Vorbereitung der Pre-Polymer-Lösung
    1. Lösen Sie die LAP in 1 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS, pH 7,4). Verwenden Sie 200 l der gelösten LAP-Lösung, um den PEGDA aufzulösen. Verwenden Sie dann 200 l der PEGDA-Lösung, um das PEG-RGDS aufzulösen.
      HINWEIS: Wenn die Steuerung der Zellform gewünscht wird, lassen Sie das Auflösen von PEG-RGDS in der Basishydrogel-Prepolymer-Lösung weg, da es über zwei Photonen, Laserscanning-Lithographie später im Protokoll hinzugefügt wird.
    2. Verwenden Sie 80 l PBS, um den PEG-488 aufzulösen. Fügen Sie der Vorpolymerlösung 2,5 l dieser Lösung hinzu.
      HINWEIS: Der PEG-488 gibt dem endgültigen Hydrogel ein fluoreszierendes Signal, das während der Musterung verwendet werden kann, und die Konzentration kann modifiziert werden, um die Signalintensität zu ändern.
    3. Filtern Sie die komplette Vorpolymerlösung durch einen 0,2 m Polytetrafluorethylenfilter (PTFE), um partikelfreie Partikel zu entfernen, die in der Lösung vorhanden sein können. Wenn Reaktanten richtig synthetisiert sind, sollte der Filter nicht verstopft werden.
  3. Photopolymerisieren des Basishydrogels
    1. Legen Sie 3 l der Vorpolymerlösung auf eine dünne flache Platte perfluoralkoxyalaner Alkane (PFA). Legen Sie flache 150 m dicke Polydimethylsiloxan (PDMS) Streifen um den Tropfen der Vorpolymerlösung, aber nicht in Kontakt mit. Legen Sie einen acrylat-silanisierten Abdeckschlupf21,22,23,24 auf das PDMS – mit dem Unterpulvertropfen zentriert unter dem Deckblatt –, um den Vorpolymertröpfchen auf die Dicke des PDMS-Abstandshalter.
    2. Setzen Sie die sandwichierte Vorpolymerlösung UV-Licht aus, bis ein Hydrogel vollständig ausgebildet ist (ca. 1 min bei 14 mW/cm2 von 370-400nm Licht).
    3. Trennen Sie den Deckelrutsch vorsichtig von den PDMS-Abstandshaltern und befestigen Sie ihn mit hochleistungsstarkem, doppelseitigem Acrylkleber an einer offenen Petrischale. Drücken Sie auf die Klebekontaktfläche, um eine vollständige Abdichtung zwischen Deckel-, Klebstoff- und Petrischale zu schaffen – mit Vorsicht, um das Glas nicht zu knacken.
    4. Spülen Sie das Hydrogel in der Petrischale mit sterilgefiltertem PBS, um biologische und partikelförmige Verunreinigungen zu minimieren.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.4 nach Bedarf, um die gewünschte Anzahl von Hydrogelen zu erstellen.
    6. Fügen Sie 8 L NVP zu den verbleibenden 800 L LAP-Lösung hinzu und halten Sie diese Lösung sowie ungeklärte PEG-633 bis zum Muster.
      HINWEIS: Die LAP-Lösung mit NVP ist sehr lichtempfindlich und polymerisiert, wenn sie nicht im Dunkeln gehalten wird. Das Einwickeln des Rohres in Aluminiumfolie kann dazu beitragen, seine Haltbarkeit zu verbessern.

2. Erstellen von Musteranweisungen

  1. Entwerfen eines binären Abbilds
    1. Um eine virtuelle Maske zum Verschreiben von fiducial Marker-Arrays zu erstellen, verwenden Sie Bildverarbeitungs- oder Zeichensoftware, um ein Bild mit einem Seitenverhältnis von 100:1 (z. B. 2000 Pixel lang x 20 Pixel breit) zu erstellen.
    2. Erstellen Sie eine Reihe von 100 gleichmäßig verteilten weißen Pixeln auf einem schwarzen Hintergrund, der entlang der langen Achse des Bildes zentriert ist.
    3. Speichern Sie dieses Bild als *.tif-Dateityp.
      HINWEIS: Wenn die Steuerung der Zellenform gewünscht ist21,25,26,27,28, erstellen Sie eine zusätzliche virtuelle Maske. Verwenden Sie eine quadratische Bildleinwand, und erstellen Sie positive weiße Features auf schwarzem Hintergrund. Für die Ungefähreinstellung einer geeigneten Größe für die weißen Merkmale (die schließlich die Zellhaftung unterstützen) gehen sie davon aus, dass die Gesamtgröße des Bildes der Größe des Ansichtsfeldes des Mikroskops entspricht, das für die Laserscan-Lithographie verwendet wird.
  2. Konvertieren eines binären Bildes in eine digitale Maske
    1. Laden Sie die LSM-ROI-Generator Funktionen kostenlos im Software-Repository29herunter.
    2. Öffnen Sie Matlab und finden Sie das Verzeichnis der heruntergeladenen Funktionsdateien. Sobald Sie sich im Verzeichnis befinden, öffnen Sie das Matlab-Skript run_script.m, und führen Sie das Skript aus.
    3. Wählen Sie die binäre *.tif-Datei für die Konvertierung. Wählen Sie dann einen Ordner aus, um Regionsdateien zu speichern.
    4. Geben Sie die gewünschte endgültige Größe des ausgewählten Bildes in Mikrometern ein. Das Eingabebild wird skaliert und bemaßt, um diesen Parametern zu entsprechen. Damit das gesamte Bild in das Ansichtsfeld des Mikroskops passt, muss die Gesamtgröße des Bildes kleiner oder gleich der Größe des Mikroskop-Ansichtsfelds sein.
    5. Wenn Sie ein einzelnes Pixelarray erstellen, deaktivieren Sie in den ROI-Generator-Optionen das Kontrollkästchen Entfernen unter Kleine Regionen/Einzelne Pixel, um das Kontrollkästchen Quadratezu aktivieren, und deaktivieren Sie use under Horizontale Bruchlinien. Klicken Sie dann auf OK.
      HINWEIS: Wenn Sie eine Regionsdatei zum Erstellen von Einzelzellenmustern erstellen, sind die Standardoptionen geeignet.
    6. Suchen Sie die resultierende *.ovl-Datei im zuvor angegebenen Ordner. Diese Datei muss zum Mikroskop gebracht werden, um die gewünschten Bereiche zu laden, die den Laserverschluss während der zweiphotonen Laserscanning-Lithographie steuern.

3. Herstellung von fiducial Marker-Arrays

  1. Einweichen des Basishydrogels
    1. Fügen Sie dem AF633 bei schlechten Lichtverhältnissen 200 l der LAP/NVP-Lösung hinzu (beide in Schritt 1 vorbereitet). Mischen Sie gründlich und schützen Sie vor Licht.
    2. Entfernen Sie alle PBS-Lösungen aus der Petrischale, die ein PEGDA-Hydrogel aus Schritt 1 enthält.
    3. Fügen Sie den gelösten PEG-633 zum Hydrogel hinzu, um ein Tröpfchen zu bilden, das das Basishydrogel vollständig umfasst.
      HINWEIS: Wenn das Loch in der Petrischale nur geringfügig größer als das Hydrogel ist, kann es als Gut dienen, um die Musterlösung zu halten. Andernfalls stellen Sie sicher, dass der Coverslip vollständig trocken ist, bevor Sie eine Musterlösung hinzufügen, oder dass das Hydrogel vom Hydrogel abläuft, wodurch das Hydrogel während der Musterung dehydriert wird.
    4. Die Petrischale auf den Probenhalter auf der Mikroskopbühne legen und den Deckel auf die Petrischale legen. Lassen Sie die Musterlösung in das Hydrogel für mindestens 30 min im Dunkeln einweichen.
      HINWEIS: Das Mikroskop kann während dieser Einweichzeit eingeschaltet und konfiguriert werden. Die Verwendung des 488 nm Lasers zum Abbilden des Hydrogels während des Einweichens ist in Ordnung.
  2. Konfigurieren des Mikroskops
    1. Mit einer 488 nm Laserlinie und Filtern, die geeignet sind, AlexaFluor 488 abzubilden, lokalisieren Sie das Hydrogel mit dem PEG-488-Signal. Blockerfassung längerer Emissionswellenlängen aus dem Detektor, da diese mit Signal enthaiert werden.
    2. Finden Sie die Mitte des Hydrogels in der XY-Ebene mit vertikalen und horizontalen Kachelscans und Null die Bühnenposition hier.
    3. Finden Sie die Oberfläche des Hydrogels mit Linienscans und der Z-Stack-Funktion. Null die Fokusposition hier. Nivellieren Sie das Hydrogel, indem Sie diese Linienscans vom XY-Mittelpunkt entfernen, um die Oberflächenposition zu identifizieren und die eingestellten Schrauben für die Mikroskopstufe einzustellen.
    4. Erstellen Sie im Arbeitsbereich der Mikroskopsoftware eine separate Experimentierdatei für die Fotomusterung. Stellen Sie die Multiphotonenleistung auf 1,8 % (15,5 mW bei 740 nm gemessen an der hinteren Öffnung des Objektivs) und die Scangeschwindigkeit auf 6 (0,1 m/s) ein. Passen Sie die Größe des Bildrahmens in Pixel an, um eine Pixelgröße von 0,1 m pro Pixel und ein Seitenverhältnis von 100:1 zu erreichen.
    5. Laden Sie die in Schritt 2.2 erstellte Regionsdatei (*.ovl) in die Registerkarte Regionen. Verwenden Sie ein Makro, um alle Regionen auf Erfassung festzulegen.
    6. Schalten Sie die Z-Stack-Funktion ein und stellen Sie den Abstand auf 3,5 m für eine Gesamttiefe von 28 m und die Gesamtzahl der Z-Slices von 9 ein.
    7. Verwenden Sie die Positionsfunktion, um bestimmte Positionen auf dem Hydrogel festzulegen, an denen die fiduzialen Marker-Arrays fotomustert werden.
      ANMERKUNG: Die Z-Position dieser Positionen bestimmt die Mittlere Position jedes Z-Stacks; Achten Sie beim Platzieren von Positionen darauf, dass jede Position gewährleistet, dass sich das gemusterte Volumen an allen Oberflächenpositionen mit dem Hydrogel überlappt.
    8. Verwenden Sie die Kachelfunktion, um zusätzliche Zeilen und Spalten an jeder Position anzugeben. Achten Sie darauf, überlappende gemusterte Bereiche zu vermeiden. Stellen Sie im Idealfall sicher, dass gemusterte Bereiche nahe genug sind, um leere und unbrauchbare Positionen zwischen den Positionen zu entfernen.
  3. Photomusterung der fiducial Marker-Arrays
    1. Wenn sich die Einweichzeit der 30-min-Marke nähert, nehmen Sie alle 5 min aufeinanderfolgende Z-Stack-Linienscans der Oberfläche des Hydrogels, um auf Schwellungen basierend auf Veränderungen in der Position der Oberfläche relativ zur Nullfokusposition zu überprüfen.
    2. Wenn sich die Oberflächenposition über ein Intervall von 5 min nicht ändert, laden Und führen Sie die in Schritt 3.2.4 erstellten Mustereinstellungen aus.
    3. Nachdem das Musterexperiment ausgeführt wurde, verwenden Sie den 488 nm Laser, um zu überprüfen, ob sich die Oberfläche des Hydrogels während der Musterung nicht bewegt hat.
      HINWEIS: Wenn sich die Oberfläche des Hydrogels nicht in der gleichen Position wie vor dem Mustern befindet, gibt es mehrere Szenarien. Das Hydrogel hatte vor dem Mustern kein Quellgleichgewicht erreicht, das Hydrogel begann während des Musterns auszutrocknen, oder das Mikroskop erlebte Z-Drift. Die Quelle dieser Oberflächenübersetzung sollte in nachfolgenden Musterausführungen identifiziert und korrigiert werden.
    4. Entfernen Sie das Hydrogel aus dem Mikroskop und aspirieren Sie die PEG-633-Lösung aus der Petrischale.
      HINWEIS: Das Hydrogel ist immer noch extrem lichtempfindlich. Das Hydrogel im Dunkeln zu halten ist sehr wichtig, bis alle Spülungen abgeschlossen sind.
    5. Spülen Sie das Hydrogel 3 Mal mit steril-gefilterten PBS, um sicherzustellen, dass spülen Sie vollständig zwischen jeder aufeinanderfolgenden Spülung. Wiederholen Sie diese dreifache Spülung alle 15 min für 1 h.
    6. Lassen Sie das Hydrogel über Nacht in PBS abspülen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
    7. Das Hydrogel mit PBS verdünnen. Anschließend spülen Sie das Hydrogel schnell mit einer 200-bedienten Ethanollösung, gefolgt von einer weiteren Dreifachspülung mit PBS. Lassen Sie das Hydrogel nicht über einen längeren Zeitraum in 200 nachgewiesenem Ethanol sitzen.
      HINWEIS: Einige Komponenten der Musterlösung können aus der Lösung abstürzen und sich auf der Oberfläche des Hydrogels ablagern und als feste Fluoreszenzschicht (1-5 Mikrometer dick) unter 633 nm Beleuchtung erscheinen. Das Spülen mit 200 proof Ethanol sollte diese unerwünschten Komponenten entfernen.
  4. Verwenden von aufeinanderfolgenden Photomustern zum Generieren von Einzelzellenmustern (Optional)
    HINWEIS: Wenn die Kontrolle über den Zellstreubereich und die Form gewünscht wird, können mehrere Runden der Musterung durchgeführt werden. Das Basisgel muss PEG-RGDS bei seiner ursprünglichen Formulierung weglassen. Es wird empfohlen, die Musterung der fiduzialen Marker-Arrays zuletzt durchzuführen, um ein Bleichen der fluoreszierenden Treuhandmarker zu vermeiden.
    1. 20 mg PEG-RGDS in der in Schritt 1 vorbereiteten LAP/NVP-Lösung auflösen.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 – 3.3 mit der PEG-RGDS-Lösung anstelle der PEG-633-Lösung. Verwenden Sie die entsprechende Regionsdatei, die die einzelnen Zellmuster definiert (Anweisungen finden Sie unter Schritt 2).
      HINWEIS: Um die Arrays von PEG-RGDS-Mustern zu visualisieren, gibt es mehrere Optionen. Eine fluoreszierende Variante von PEG-RGDS kann21,30 oder der PEG-RGDS mit fluoreszierendem PEG dotiert werden. Empfohlen: Alternativ kann die 488 nm Laserlinie zusammen mit dem Multiphotonen-Musterlaser laufen, um das PEG-488-Signal im Basishydrogel zu bleichen, wodurch nicht fluoreszierende Regionen entstehen, die mit der RGDS-Integration übereinstimmen.

4. Visualisierung von fiduzialen Marker-Arrays

  1. Erfassen eines Z-Stack-Images des fabricated Arrays
    1. Ersetzen Sie PBS in der Petrischale durch die Zellmedien, die für die Zellkultur verwendet werden.
      HINWEIS: Phenolrote freie Medien werden zur Verwendung während der Bildaufnahme empfohlen, um Phototoxizität zu verhindern.
    2. Verwenden Sie nach 1 h Einweichzeit ein Weitfeldfluoreszenzmikroskop, das mit einem strukturierten Beleuchtungsmodul und einer Hochvergrößerungswasser-Tauchobjektivlinse ausgestattet ist, um die Hydrogele mit einem Filtersatz zu visualisieren, der für die fluoreszierenden Fiduzialenmarker geeignet ist.
    3. Sammeln Sie einen hochauflösenden Z-Stack von Bildern (mit abstand 0,4 m in Z), der mindestens 20 m Tiefe von der Oberfläche des Hydrogels in das Hydrogel im gemusterten Bereich umfasst, um sicherzustellen, dass die obere Grenze des Z-Stacks mindestens 1-2 Bilder physisch über dem gemusterten Bereich (d. h. wenn die fluoreszierenden Fiduzialen marker nicht mehr sichtbar sind und nur Noch Rauschen vorhanden ist).
      HINWEIS: Die Erfassung dieses Bildstapels ist erforderlich, um zu überprüfen, ob alle Musterparameter korrekt sind und zusammen mit DenZellendaten in Schritt 5.3 analysiert werden können.

5. Durchführung von TFM mit photomusterten Hydrogelen

  1. Seeding Cells
    HINWEIS: Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, befolgen Sie alle gängigen Gewebekulturpraktiken.
    1. Befolgen Sie vor dem Zellaussaat Standardprotokolle für die jeweilige Zelllinie für Zellkultur und -wartung.
    2. (Optional) Wenn die Sterilität des Hydrogels ein Problem ist, inkubieren Sie das Hydrogel für 24 h in Medien, die Antibiotika enthalten, gefolgt von dem Spülen mit normalen Medien.
    3. Um Zellen auszusäen, setzen Sie zunächst trypsinisierte Zellen im endletzten Medienvolumen, das in der Hydrogel-Petrischale verwendet werden soll, erneut aus.
    4. Entfernen Sie alle Lösung aus der Hydrogelschale und ersetzen Sie durch die zellbeladenen Medien.
    5. Lassen Sie das Hydrogel 10 min ungestört in zellbeladenen Medien sitzen.
    6. Bewegen Sie die Petrischale vorsichtig in einen Brutkasten. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator für 4 h oder bis die Zellen sichtbar haften.
    7. Ersetzen Sie das zellbeladene Medium durch zellfreie Medien, um nicht gebundene Zellen zu entfernen.
  2. Erfassen von Bildern von Zellen und den Treuhandmarkern
    1. Stellen Sie die Temperatur für die Inkubationskammer am Mikroskop auf 37 °C und CO2 bis 5 % ein und lassen Sie die Kammer die Sollpunkte erreichen.
    2. Legen Sie die Petrischale auf den Probenhalter und suchen Sie die gemusterten Bereiche.
    3. Suchen Sie eine Zelle von Interesse (COI) und erfassen Sie ein übertragenes oder fluoreszierendes Bild des COI.
      HINWEIS: Dieses Bild wird verwendet, um die Zellbegrenzung während der Analyse zu segmentieren, sodass das Bild die Zellplatinen klar visualisieren sollte.
    4. Erwerben Sie einen Z-Stack des gemusterten Arrays unter dem COI wie in Schritt 4.1.4.
    5. Erfassen Sie einen zweiten Satz übertragener oder fluoreszierender Bilder der Zelle.
      HINWEIS: Vergleichen Sie den zweiten Bildsatz mit dem ersten, um festzustellen, ob Zellschäden aufgrund von Phototoxizität beobachtet werden und ob die Einstellungen für die Bildaufnahme angepasst werden müssen. Zellen, die nach der Exposition schrumpfen, haben wahrscheinlich signifikante phototoxische Wirkungen erlitten, die die Ergebnisse beeinflussen können.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.3-5.2.5 für jede COI.

6. Analysieren der Bilder

  1. Vorbereitung der Bilddateien für die Analyse
    1. Bereiten Sie mithilfe der in Schritt 5.2 gesammelten Daten einen zugeschnittenen Bildstapel des Bereichs um einen COI so vor, dass das untere Bild (erstes Bild) des Stapels den ersten Frame darstellt, wobei: (1) >80 % der gemusterten Markerspalten sichtbar sind, (2) das oberste Bild (letztes Bild) im Stapel keine sichtbaren Treuhandmarker mehr (d. h. über der Hydrogeloberfläche) und (3) gibt es mindestens 20 m nicht beanspruchte Treuhandmarker, die den COI umgeben.
      HINWEIS: Das Zuschneiden der Bilder reduziert die Rechenzeit während der Analyse erheblich. Der Analysecode in späteren Schritten kann ausgeführt werden, ohne die Bilder zuzuschneiden, dies wird jedoch nicht empfohlen.
    2. Erstellen Sie ein zugeschnittenes Bild des übertragenen und/oder fluoreszierenden Bildes, das dem XY-Zuschneiden des Stapels im vorherigen Schritt entspricht.
    3. Verwenden Sie entweder das zugeschnittene übertragene oder das fluoreszierende Bild – je nach jenach repräsentativer für die Zellform – um das Bild von Hand (Spuren des Zellrahmens) oder über Bildverarbeitungswerkzeuge zu segmentieren.
    4. Konvertieren Sie dieses Bild in ein binäres Bild, in dem das Innere der Zelle schwarz ist (d. h. Intensität = 0) und der Bereich, der die Zelle umgibt, weiß ist (d. h. die Intensität 0). Speichern Sie dieses Bild als Binary Mask.tif.
    5. Sammeln Sie für jede COI die Bildstapeldatei, die übertragene Bilddatei und die binäre Maskendatei in einem einzigen Ordner.
  2. Ausführen von Analyseskripts für die Bilder
    1. Klonen oder herunterladen Sie die TFM-Analysefunktionen kostenlos im Software-Repository29. Das gesamte Repository sollte heruntergeladen werden, da es eine erhebliche Anzahl von Abhängigkeiten in den Unterordnern gibt.
    2. Öffnen Sie Matlab, und fügen Sie dem Pfad das Verzeichnis und alle Unterordner des lokalen Klons des Code-Repositorys hinzu.
    3. Legen Sie das Verzeichnis innerhalb des Matlab-Arbeitsbereichs auf den Ordnerspeicherort fest, in dem die vorbereiteten Bilder in Schritt 6.1 gespeichert wurden.
    4. Öffnen und führen Sie das Tracking.m-Skript aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, befolgen Sie die Anweisungen, um die entsprechenden Bilder zu laden, erste Vorverarbeitungsschritte auszuführen und den Objektverfolgungsalgorithmus fehlerzuüberprüfen.
    5. Sobald das Skript abgeschlossen ist, öffnen und führen Sie die dispShear.m-Funktion aus. Dieses Skript sollte keine Eingaben des Benutzers erfordern.
    6. Sobald das Skript dispShear.m abgeschlossen ist, öffnen und führen Sie disp3D.maus. Wenn Sie aufgefordert werden, Bilder zu öffnen, befolgen Sie die Anweisungen.
      HINWEIS: Während der Laufzeit kann das Skript den Benutzer bitten, eine Linie auf einem Bild des gemusterten Arrays zu zeichnen. Diese Linie sollte die primäre Bewegungsachse des Scanlasers während der Musterung darstellen und mit einer Reihe gemusterter Treuhandmarkierungen aneinanderreihen. Dieser Prozess weist den Code an, in welche Richtung (d. h. Zeilen oder Spalten von Treuhandmarkierungen) wahrscheinlich die am stärksten ausgerichteten Zeilen von Treuhandmarkierungen ergeben.
    7. Nachdem der DispShear.m-Code abgeschlossen ist, führen Sie den dispSurface.m-Code gefolgt vom InterpFinal3D_2.m-Code aus. Diese Skripts sollten keine Eingaben des Benutzers erfordern.
      HINWEIS: Das Skript interpFinal3D_2.m konvertiert Verschiebungsdaten mithilfe einer extern erhaltenen Software in Oberflächentraktionen, die zuvor beschrieben wurde31. Um diese externen Funktionen anzuwenden, interpoliert interpFinal3D_2.m Verschiebungsdaten in einheitliche Raster, um als Eingaben für die Konvertierungsfunktionen zu dienen. Wenn Sie eine andere Konvertierungsmethode verwenden oder keine Traktionen erforderlich sind, kann dieser Schritt übersprungen werden.
    8. Nachdem alle Skripts ausgeführt wurden, stellen Sie sicher, dass alle Daten und Ausgaben im Ursprünglichenverzeichnis gefunden werden können.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.3 – 6.2.8 für jede COI.
      HINWEIS: Innerhalb des Code-Repositorys befindet sich ein Ordner mit Skripts, die die automatische Batchausführung jedes Skripts in einer Liste von Verzeichnissen ermöglichen. Anweisungen zur Verwendung finden Sie in den Automatisierungsskripts selbst (d. h. Kommentare innerhalb des Codes).

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Ergebnisse

Im gesamten Protokoll gibt es eine Reihe von Prüfpunkten, die Feedback geben, um die Qualität des Mustervorgangs zu bewerten. Um einen Einblick in die Bewertung der Fortschritte an jedem dieser Kontrollpunkte zu geben, liefern wir repräsentative Ergebnisse eines tatsächlichen Experiments. Die Ergebnisse unterstreichen die Anwendung dieses Protokolls auf einem photomusterten Hydrogel, das für die TFM-Analyse menschlicher Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) vorbereitet wurde. Die Ergebnisse umfassen Rohbilddaten sowie ver...

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Diskussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Workflow bereitzustellen, der einen Großteil der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Generierung und Analyse von TFM-Daten lindert. Einmal zubereitet, sind die photomusterten Hydrogele einfach zu bedienen und erfordern nur Kenntnisse der Standard-Gewebekulturpraktiken und der Fluoreszenzmikroskopie. Der referenzfreie Aspekt ermöglicht eine sorglose Navigation auf zellbeladenen Hydrogelen und eliminiert umständliche Bildverarbeitungsschritte wie die Bildregistrierung zwischen R...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

O. A. Banda wurde durch ein NSF IGERT SBE2-Stipendium (1144726), Start-up-Fonds der University of Delaware und des National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) unterstützt. JHS wird durch Fördermittel des National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) und des National Science Foundation CAREER Award Program (1751797) unterstützt. Der Zugang zur Mikroskopie wurde durch Zuschüsse des NIH-NIGMS (P20 GM103446), der NSF (IIA-1301765) und des Bundesstaates Delaware unterstützt. Das strukturierte Beleuchtungsmikroskop wurde mit Mitteln des State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471) erworben. Das konfokale Mikroskop LSM880 für die Zwei-Photonen-Laserscanning-Lithographie wurde mit einem gemeinsamen Instrumentationszuschuss (S10 OD016361) erworben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acrodisc Spritzenvorsatzfilter, 0,2 μ m Supor Membran, Low Protein BindingPallPN 4602Ermöglicht die Filtration von Makromerlösungen vor der Basengelsynthese und nachfolgenden Lithographieschritten.
Acrylat-Silan-funktionalisierte #1.5 Deckgläserin-housein-houseAcrylate ermöglichen die Bindung von basischem Hydrogel an die Glasoberfläche, um die Hydrogele zu immobilisieren. Siehe Referenz: 21-24
Axio-Observer Z1 w/ApotomeZeissWeitfeldmikroskop mit strukturiertem Beleuchtungsmodul zur Aufnahme von Bildern für TFM.
Chameleon Vision iiCoherent Inc.Ausgestattet mit einem Laser-Scanning-Mikroskop, das für die Multiphotonen-Lithographie verwendet wird.
Doppelseitiges Klebeband, 9500PC, 6,0 mil3MBindet acrylat-silan-funktionalisierte Deckgläser an Petrischale.
Flexmark90 PFW LinerFLEXconFLX000620Ermöglicht das Ausziehen von doppelt beschichtetem Klebeband und ermöglicht die Zuführung des Bandes in den Plotter.
LSM-880ZeissLaser-Scanning-Mikroskop für die Multiphotonen-Lithographie.
MATLABMathworksR2018aFührt benutzerdefinierte Skripte aus, um Lithografieanweisungen für das Mikroskop und die Analyse von TFM-Daten zu generieren.
Modell SC PlotterUSCutterSC631ESchneidet doppelseitiges Klebeband in Ringe, um Deckgläser an Petrischalen zu binden.
Objektiv C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27ZeissAusgestattet sowohl für das Weitfeldmikroskop als auch für das Laser-Scanning-Mikroskop, um sowohl für die Lithographie als auch für TFM verwendet zu werden.
PEG-AF633in-house>in-houseFluorophor-markierte Acrylat-PEG-Variante zur Herstellung von Passermarken. Siehe Referenz: 21
PEG-DAem>in-housein-houseBasismaterial für Hydrogele. Siehe Referenz: 21
PEG-RGDSem>in-housein-houseRGDS-Peptid-markierte Monoacrylat-PEG-Variante zur Förderung der Zelladhäsion. Siehe Referenz: 21
PetrischalenCELLTREAT2296388 mm Löcher werden mit einem Entkernungsbohrer in die Mitte jeder Schale geschnitten, um die Basis-Hydrogele einzupassen.
Sylgard 184 Silikonelastomer KitDow Corning3097358-1004Zur Herstellung von Abstandshaltern zur Kontrolle der Dicke des Basishydrogels (auch bekannt als PDMS).
Spritze, Leur-Lok, 1 mLBD309628Ermöglicht die Filterung von Makromerlösungen vor der Basengelsynthese und den nachfolgenden Lithographieschritten.
UV-LampeUVPBlak-Ray® B-100APPolymerisiert basisches Hydrogel.
1-Vinyl-2-pyrrolidinon (NVP)Sigma-AldrichV3409-5GRadikalischer Beschleuniger und Co-Monomer. Verbessert den Einbau von pegylierten Fluorophoren während der Lithographie.
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Referenzen

  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103(2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. , Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).

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