Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Summary

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die Implementierung der Multiphotonenlithographie zur Herstellung dreidimensionaler Arrays von fluoreszierenden Fiduzialen, die in poly(ethylengglykol)-basierte Hydrogele eingebettet sind und als referenzfreie Traktionskraftmikroskopie verwendet werden können. Plattformen. Anhand dieser Anleitungen wird die Messung der 3D-Materialdehnung und die Berechnung der zellulären Traktionen vereinfacht, um Messungen der Traktionskraft mit hohem Durchsatz zu fördern.

Abstract

Die Quantifizierung der zellinduzierten Materialverformung liefert nützliche Informationen darüber, wie Zellen die physikalischen Eigenschaften ihrer Mikroumgebung erkennen und darauf reagieren. Während es viele Ansätze zur Messung zellinduzierter Materialstämme gibt, bieten wir hier eine Methodik zur referenzfreien Dehnungsüberwachung mit Submikronen-Auflösung an. Mit einem zweiphotonenaktivierten photolithographischen Musterverfahren zeigen wir, wie mechanisch und bioaktiv abstimmbare synthetische Substrate mit eingebetteten Arrays von fluoreszierenden Fiduzialenmarkern erzeugt werden, um dreidimensionale ( 3D) Materialverformungsprofile als Reaktion auf Oberflächentraktionen. Mit diesen Substraten können Zellspannungsprofile mit einem einzelnen 3D-Bildstapel einer von Interesse stehenden Zelle abgebildet werden. Unser Ziel mit dieser Methode ist es, die Traktionskraftmikroskopie zu einem zugänglicheren und einfacher zu implementierenden Werkzeug für Forscher zu machen, die zelluläre Mechanotransduktionsprozesse untersuchen, insbesondere Neulinge auf dem Gebiet.

Introduction

Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) ist der Prozess der Annäherung zellulärer Traktionen unter Verwendung interpolierter Verschiebungsfelder von Treuhandmarkern, die von einer anhängerhaften und kontraktilen Zelle erzeugt werden. Mit TFM kann der Einfluss mechanischer Hinweise in der extrazellulären Umgebung auf wichtige zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration untersucht werden^{1,2,3,4 ,5,6,7,}

Protocol

1. Photopolymerisierung eines PEGDA-Basishydrogels

1. Sammeln von Reagenzien
   1. Sammeln Sie Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP), 3,4 kDa-Poly(Ethylen)-Glykoldiakrylat (PEGDA), n-Vinylpyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mit PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mit PEGDA (PEG-633) und PEGylatiertem RGDS-Peptid ( PEG-RGDS) aus den jeweiligen Gefriertruhen und bringen sie jeweils auf Raumtemperatur.
   2. In separaten Bernstein-Mikrozentrifugenröhrchen 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633 und 6 mg RGDS-Peptid messen.
2. Vorbereitung der Pre-Polymer-Lösung
   1. Lösen Sie ....

Results

Im gesamten Protokoll gibt es eine Reihe von Prüfpunkten, die Feedback geben, um die Qualität des Mustervorgangs zu bewerten. Um einen Einblick in die Bewertung der Fortschritte an jedem dieser Kontrollpunkte zu geben, liefern wir repräsentative Ergebnisse eines tatsächlichen Experiments. Die Ergebnisse unterstreichen die Anwendung dieses Protokolls auf einem photomusterten Hydrogel, das für die TFM-Analyse menschlicher Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) vorbereitet wurde. Die Ergebnisse umfassen Rohbilddaten sowie ver.......

Discussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Workflow bereitzustellen, der einen Großteil der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Generierung und Analyse von TFM-Daten lindert. Einmal zubereitet, sind die photomusterten Hydrogele einfach zu bedienen und erfordern nur Kenntnisse der Standard-Gewebekulturpraktiken und der Fluoreszenzmikroskopie. Der referenzfreie Aspekt ermöglicht eine sorglose Navigation auf zellbeladenen Hydrogelen und eliminiert umständliche Bildverarbeitungsschritte wie die Bildregistrierung zwischen R.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Spritzenvorsatzfilter, 0,2 μ m Supor Membran, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Ermöglicht die Filtration von Makromerlösungen vor der Basengelsynthese und nachfolgenden Lithographieschritten.
Acrylat-Silan-funktionalisierte #1.5 Deckgläser	in-house	in-house	Acrylate ermöglichen die Bindung von basischem Hydrogel an die Glasoberfläche, um die Hydrogele zu immobilisieren. Siehe Referenz: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Weitfeldmikroskop mit strukturiertem Beleuchtungsmodul zur Aufnahme von Bildern für TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Ausgestattet mit einem Laser-Scanning-Mikroskop, das für die Multiphotonen-Lithographie verwendet wird.
Doppelseitiges Klebeband, 9500PC, 6,0 mil	3M		Bindet acrylat-silan-funktionalisierte Deckgläser an Petrischale.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Ermöglicht das Ausziehen von doppelt beschichtetem Klebeband und ermöglicht die Zuführung des Bandes in den Plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning-Mikroskop für die Multiphotonen-Lithographie.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Führt benutzerdefinierte Skripte aus, um Lithografieanweisungen für das Mikroskop und die Analyse von TFM-Daten zu generieren.
Modell SC Plotter	USCutter	SC631E	Schneidet doppelseitiges Klebeband in Ringe, um Deckgläser an Petrischalen zu binden.
Objektiv C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Ausgestattet sowohl für das Weitfeldmikroskop als auch für das Laser-Scanning-Mikroskop, um sowohl für die Lithographie als auch für TFM verwendet zu werden.
PEG-AF633	in-house	>in-house	Fluorophor-markierte Acrylat-PEG-Variante zur Herstellung von Passermarken. Siehe Referenz: 21
PEG-DA	em>in-house	in-house	Basismaterial für Hydrogele. Siehe Referenz: 21
PEG-RGDS	em>in-house	in-house	RGDS-Peptid-markierte Monoacrylat-PEG-Variante zur Förderung der Zelladhäsion. Siehe Referenz: 21
Petrischalen	CELLTREAT	229638	8 mm Löcher werden mit einem Entkernungsbohrer in die Mitte jeder Schale geschnitten, um die Basis-Hydrogele einzupassen.
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	Zur Herstellung von Abstandshaltern zur Kontrolle der Dicke des Basishydrogels (auch bekannt als PDMS).
Spritze, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Ermöglicht die Filterung von Makromerlösungen vor der Basengelsynthese und den nachfolgenden Lithographieschritten.
UV-Lampe	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerisiert basisches Hydrogel.
1-Vinyl-2-pyrrolidinon (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radikalischer Beschleuniger und Co-Monomer. Verbessert den Einbau von pegylierten Fluorophoren während der Lithographie.