Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Summary

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Abstract

Eine dreidimensionale sphäroide Zellkultur kann in Zellexperimenten nützlichere Ergebnisse erzielen, da sie Zellmikroumgebungen des lebenden Körpers besser simulieren kann als zweidimensionale Zellkulturen. In dieser Studie haben wir eine elektrische motorgesteuerte Lab-on-a-CD-Plattform (Compact Disc) hergestellt, ein so genanntes zentrifugales mikrofluidisches Sphäroid-basiertesphärisches Sphäroid (CMS)-Kultursystem, um dreidimensionale (3D) Zellsphäride zu erstellen, die eine hohe Zentrifugalkraft implementieren. Dieses Gerät kann die Drehzahlen variieren, um Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gzu erzeugen. Das CMS-System hat einen Durchmesser von 6 cm, hat hundert 400 m Mikroschäbe und wird durch Formen mit Polydimethylsiloxan in einer Polycarbonatform hergestellt, die von einer numerischen Computersteuerungsmaschine vorgefertigt wurde. Eine Barrierewand am Kanaleingang des CMS-Systems nutzt Fliehkraft, um Zellen gleichmäßig im Chip zu verteilen. Am Ende des Kanals befindet sich ein Diabereich, der es den Zellen ermöglicht, in die Mikrobrunnen einzudringen. Als Demonstration wurden Sphäroide durch Monokultur und Kokultur menschlicher, aus Fettgewonnener Stammzellen und menschlicher Lungenfibroblasten unter Hochgravitationsbedingungen mit Hilfe des Systems erzeugt. Das CMS-System verwendete ein einfaches Betriebsschema, um Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturen von Konzentrisch, Janus und Sandwich zu produzieren. Das CMS-System wird in Zellbiologie- und Gewebe-Engineering-Studien nützlich sein, die Sphäroide und organoide Kultur von einzelnen oder mehreren Zelltypen erfordern.

Introduction

Es ist einfacher, biologische In-vivo-Mikroumgebungen mit dreidimensionaler (3D) Sphäroid-Zellkultur zu simulieren als mit zweidimensionaler (2D) Zellkultur (z. B. konventionelle Petrischalenzellkultur), um physiologisch realistischere experimentelle Ergebnisse¹. Derzeit verfügbare Sphäroid-Bildungsmethoden umfassen die Hängetropfentechnik², Flüssigkeits-Overlay-Technik³, Carboxymethyl-Zellulose-Technik⁴, magnetische kraftbasierte mikrofluidische Technik⁵, und die Verwendung von Bioreaktoren⁶. Obwohl jede Methode ihre eigenen ....

Protocol

1. Zentrifugal mikrofluidische Basis Sphäroid (CMS) Kultur Chip Herstellung

1. Machen Sie PC-Formen für die oberen und unteren Schichten des CMS-Kulturchips durch CNC-Bearbeitung. Detaillierte Abmessungen des Chips sind in Abbildung 1angegeben.
2. Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 (w/w) für 5 min und legen Sie sie in einen Trockengrund für 1 h, um Luftblasen zu entfernen.
3. Nachdem Sie das PDMS-Gemisch in die Formen des CMS-Kulturchips gegossen haben, entfernen Sie Luftblasen für 1 h mehr und härten Sie in einer Wärmekammer bei 80 °C für 2 h aus.
4. Legen Sie sie in den gesaugte....

Results

Der CMS-Kulturchip mit einem Durchmesser von 6 cm (Abbildung 2) wurde erfolgreich nach dem obigen Protokoll hergestellt. Zunächst wurde der Chip getrennt von einer oberen und einer unteren Schicht hergestellt und dann durch Plasmabindung miteinander verbunden. Die resultierenden Sphäroide können leicht durch Lösen des Chips gesammelt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss und zentralen, gleitenden und Microwell-Regionen (Abbildung 3

Discussion

Das CMS ist ein geschlossenes System, bei dem alle injizierten Zellen ohne Abfall in den Mikrobrunnen gelangen, was es effizienter und wirtschaftlicher macht als herkömmliche mikrowellbasierte Sphäroid-Erzeugungsmethoden. Im CMS-System wird das Medium alle 12–24 h durch ein Saugloch ersetzt, das entwickelt wurde, um die Medien im Chip zu entfernen (Abbildung 3A). Während des Mediensaugvorgangs entweicht kaum ein Medium aus dem Inneren des Mikrobrunnens aufgrund der Oberflächenspannung zwisch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-Drucker	Cubicon	3DP-210F
Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotikum-Antimykotikum	Gibco	15240-062	Enthält 1% des fertigen Mediums und
Puffer CellTracker Grün CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Rot CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerische Steuerung (CNC) Rotationsgravierer	Roland DGA	EGX-350
Gleichstrommotor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbeccos modifiziertes Eaggle-Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fötales Rinderserum	ATCC	30-2020	Enthält 10 % fertige mittlere
menschliche Lungenfibroblasten (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computergestütztes Designprogramm
Petrischale & Phi; 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Oberflächenbehandelter
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Verdünnen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 4% (w/v) Lösung
Polycarbonat (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxan (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021