Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad

7.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/60401

⸱

4. März 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.

Zusammenfassung

Bereits in den 1970er Jahren haben Forscher erfolgreich Epithelzellen der Brust in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten transplantiert. Das Grafting-Mammaepithel mit Transplantationstechniken nutzt die hormonelle Umgebung des jugendlichen Nagetierwirts. Diese Studien sind ideal geeignet, um die Auswirkungen verschiedener biologischer Manipulationen auf die Entwicklung der Brustdrüse zu untersuchen und viele Aspekte der Brustdrüsenbiologie zu sezieren. Ein häufiges, aber einschränkendes Merkmal ist, dass transplantierte Epithelzellen stark von der umgebenden Stroma beeinflusst und durch endogenes Epithel übertroffen werden; Um natives Brustgewebe zu nutzen, muss das abdominale weiße Fettpolster vor der Transplantation gelöscht werden, um das Brustepithel zu entfernen. Ein großes Hindernis bei der Verwendung des Rattenmodellorganismus ist, dass die Beseitigung des sich entwickelnden Brustbaums bei nachentwöhnten Ratten nicht effizient ist. Bei der Transplantation in drüsenfreie Fettpolster können Spenderepithelzellen das gelöschte Wirtsfettpad wieder bevölkern und eine funktionelle Brustdrüse bilden. Das interskapulierliche Fettpolster ist ein alternativer Ort für diese Transplantate. Ein großer Vorteil ist, dass es an duktalen Strukturen fehlt, aber die normale Stroma liefert, die notwendig ist, um epitheliale Auswüchse zu fördern und in der Ratte leicht zugänglich ist. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie minimal invasiv ist, weil sie die Notwendigkeit eliminiert, den wachsenden endogene Brustbaum zu kauterisieren und zu entfernen. Darüber hinaus enthält das interskapulierliche Fettpad ein mediales Blutgefäß, das verwendet werden kann, um Standorte für die Transplantation zu trennen. Da die endogenen Drüsen intakt bleiben, kann diese Technik auch für Studien verwendet werden, die die endogene Brustdrüse mit der transplantierten Drüse vergleichen. Dieses Papier beschreibt die Methode der Brustepithelzelltransplantation in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten.

Einleitung

Postnatale Brustdrüsenentwicklung und duktale Morphogenese sind Prozesse, die weitgehend durch hormonelle Signalisierung zu Beginn der Pubertät beeinflusst werden. Bei Mäusen und Ratten, häufig verwendeten Modellorganismen der Brustdrüsenbiologie, beginnt dieser Prozess etwa 3 Wochen im Alter, wo eine schnelle Proliferation und Differenzierung zur Bildung des reifen Parenchyms führen. Die reife Brustdrüse kann zahlreiche Expansions- und Involutionrunden durchlaufen, eine Eigenschaft, die seit dem frühen20. Jahrhundert untersucht wird. Im Rahmen der Hyperproliferation und der Krebsentwicklung wurden in den 1950er Jahren1Brustdrüsentransplantationstechniken entwickelt und durch die quantitative Methodik verbessert, die Gould et al. 1977 2,3,4beigesteuert haben. Die Verfeinerung der Transplantationstechnik bei Nagetieren hat zu großen Fortschritten beim Verständnis der normalen Brustdrüsenbiologie beigetragen, die immer noch weit verbreitet sind, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und genetischer Manipulationen auf normale Brustdrüsenentwicklung und Krankheitszustände zu untersuchen.

Viele Hypothesen wurden erstellt und anschließend mit Brustdrüsentransplantation getestet, zuerst beschrieben von DeOme et al. 19591. Experimente über mehrere Jahrzehnte zeigten die Neigung des duktalen Gewebes, das aus den Spender-Brustdrüsen entnommen wird, um das gesamte Fettpolster5,6,7 wieder zu bevölkern, und zeigten, dass eine kritische Komponente der Entwicklung der Brustdrüse in diesen epithelialer Strukturen liegt. Spätere Studien an Mäusen zeigten, dass eine einzelne Bruststammzelle ein gelöschtes Fettpolster wieder bevölkern kann und zur Entdeckung eines einzigen, gemeinsamen Vorläufers von Basal- und Luminal-Mammaepithelzellen8,9,10beigetragen hat. Im Einklang mit diesen Schlussfolgerungen, Es wurde vorgeschlagen, dass Transplantation erhöht den Pool von Zellen mit Multilineage-Wiederbevölkerung Potenzial als Folge der Plastizität, so dass die transplantierten Zellen eine funktionelle Brustdrüsewachsen 7,10,11,12,13. Wichtig ist, dass der Einsatz von Transplantationstechniken bei Nagetieren die Grenzen von zellkulturinduzierten Anomalien14 überwindet und oft in nur wenigen Wochen Ergebnisse liefert.

Während das Verfahren ursprünglich im Zusammenhang mit präneoplastischen Läsionen bei Mäusen beschrieben wurde, wurde es bald auf Ratten ausgeweitet und in Verbindung mit der karzinogenen Behandlung verwendet, um die Multiplizität als Maß für die Krebsanfälligkeit zu etablieren15, aber die Popularität von Transplantationstechniken hat die Entwicklung genetischer Werkzeuge für jede Art verfolgt. Obwohl Mausstudien mit Transplantation viele translationale Befunde beigesteuert haben, ähnelt das Parenchym der Rattenbrustdrüse dem Menschen näher16,17 und bietet deutliche Vorteile für die Untersuchung von Östrogenrezeptor-positivem (ER+) Brustkrebs. Brusttumoren sind in beiden Arten induzierbar, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf Hormonempfindlichkeit und Genexpressionsprofile. Ein primärer Unterschied ist, dass Rattenbrusttumoren ausdrücken und von der Funktion der Eierstock- und Hypophysenhormonrezeptoren abhängen, nämlich Östrogen und Progesteron (PR), ähnlich dem Luminal-A-Subtyp des menschlichen Brustkrebses. Tatsächlich wurde die Transplantation von Epithelzellen, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwendet, um genetische Varianten zu untersuchen, die an Brustkrebs beteiligt sind, und die zelluläre Autonomie der Wirkungen auf Dieepithelzellen18zu bestimmen.

Neben der Tumorbiologie weist das duktale Epithel der normalen Rattenbrustdrüse eine höhere Verzweigung auf und wird von einer dickeren Stromaschicht flankiert als die Maus. Die Bedeutung der Stroma ist in Brustepitheltransplantationsstudien gut dokumentiert. Das Brustepithel muss mit fettem Stroma und idealerweise seinem eigenen Mesenchym interagieren, um seine charakteristische Morphogenese19,20zu durchlaufen. Das Verpflanzen von Gewebe in eine Empfänger-Brustdrüse bietet eine optimale Umgebung; das Vorhandensein von endogenem Epithel kann jedoch die Ergebnisse beeinträchtigen. Die Vorreinigung der Brustdrüse von endogenem Epithel wird häufig in Maustransplantationstests durchgeführt und erfordert eine chirurgische Exzision des endogenen Brustgewebes und/oder die Entfernung der Brustwarze1,21,22. Obwohl möglich, ist die Vorreinigung des Brustepithels bei nach entwöhnenden Ratten nicht so weit verbreitet, vor allem aufgrund der Unwirksamkeit der Räumung des wachsenden Brustbaums bei nach entwöhnenden Ratten. Da gezeigt wurde, dass Regionen von Fettgewebe an anderer Stelle im Körper das Wachstum des transplantierten Brustepithels21,23,24unterstützen könnten, kann der Prozess der Vorräumung bei Ratten leicht vermieden werden, indem Gewebe in das interscapuläre weiße Fettpolster transplantiert wird.

Die in diesem Papier beschriebene Transplantationsmethode beinhaltet die Injektion von enzymatisch dissoziierten Brustdrüsenorganoiden (Fragmente von Brustduktalepithel und anderen Zelltypen, die morphogenestisch geeignet sind) oder monodispergierten Zellen in das interscapuläre Fettpolster in inzucht, isogenen oder kongenen Stämmen von Laborratten2. Da das interskapuläre Fettpolster normalerweise frei von Brustgewebe ist, bietet es eine geeignete Umgebung für mehrere Transplantationsstellen, ohne dass endogenes Epithel vorgeklärt werden muss. Infolgedessen sind die endogenen, abdominalen Bauch-Leisten-Brustdrüsen des Wirtstiers keiner chirurgischen Manipulation ausgesetzt, entwickeln sich normal und können die Interpretation der Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Zusätzlich können die intakten Brustdrüsen zum Vergleich verwendet werden, um Wirts- und Spendereffekte auf die Entwicklung des Brustepithels und die Tumorgenese18,25zu bewerten. Obwohl die Repopulation der Brustdrüse aus einer einzigen Stammzelle für Mäuse verfügbar ist, wurde sie noch nicht für Ratten entwickelt, hauptsächlich aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit von Antikörpern zur Auswahl für Bruststammzellen der Ratte25,26,27. Trotzdem kann die Transplantation von monodispersen Epithelzellen der Brust zur Quantifizierung des Wiedervolksungspotenzials erfolgreich durchgeführt werden, und diese Zellen entwickeln sich normal, wenn sie in das entsprechende Gerüst eingepfropft werden2,3,4. Während Organoide für viele Zwecke gut sind, sind monodisperse Zellen für quantitative Anwendungen erforderlich, um beispielsweise die Anzahl der Brustepithelzellen zu bestimmen, die für die Krebsinitiierung nach ionisierender Strahlenbehandlung28 oder zum Vergleich der Merkmale der zytometrischen Zytometrie-Epithelzellpopulationen benötigt werden29.

Bis heute ist das hier beschriebene Verfahren die robusteste Methode zur Durchführung von Brustdrüsentransplantationen bei ratten mit dem übergeordneten Ziel, die Entwicklung der Brustdrüse und die Mechanismen, die der Entwicklung von Brustkrebs zugrunde liegen, zu untersuchen. Häufig sind spender- und/oder Empfängertiere vor, während oder nach der Epitheltransplantation unterschiedlichen Variablen ausgesetzt. Beispiele sind einzelne Genstudien mit chemischer Karzinogenese30, Strahlung28,31,32, genetische Manipulation des Wirts-/Spendergenoms18und hormonelle Manipulation12. Ein großer Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen enzymatischen Dissoziation ist die Möglichkeit, epitheliale Organoide oder monodisperse Zellen für komplementäre Experimente mit Durchflusszytometrie, 3D-Kultur, Genbearbeitung und mehr zu isolieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden zusätzliche Manipulationen von Spender- und/oder Wirtsgewebe mit Gentechnik umfassen. Beispielsweise können Spenderzellen ex vivo an jedem ausgewählten genomischen Ort mit dem CRISPR-Cas9-Genbearbeitungssystem genetisch verändert werden. In ähnlicher Weise können Empfängerratten auch genetisch verändert werden, um die Wechselwirkung zwischen spender- und empfängertechnischen genetischen Faktoren zu untersuchen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tiere wurden in einer von AAALAC zugelassenen Einrichtung untergebracht und gepflegt, und die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden vom MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) genehmigt. Tiere, die bei der gegenseitigen Transplantation verwendet werden, sollten ein inzuchtierter oder iserogener Stamm sein, dessen kongene Stellung für mindestens 6 Generationen bevorzugt oder nach hinten gekreuzt wird.

1. Ernte Spender Ratte Brustdrüsenepithel

  1. Bestimmen Sie die Anzahl der Spenderratten, die für die Transplantation benötigt werden.
    HINWEIS: Im Allgemeinen kann 1 Spenderratte (4 Wochen alt) genügend Zellen für die Transplantation in 4 Empfängertiere bereitstellen. Bestimmte Anwendungen dieses Protokolls erfordern zusätzliche Anzahl von Zellen, und es kann dehnungsspezifische Unterschiede in der Gesamtausbeute geben.
  2. Beschriften Sie alle Vorräte und sorgen Sie für eine zugängliche Platzierung für den Chirurgen (Tabelle 1).
  3. Zeichnen Sie das Körpergewicht jeder Spenderin auf. Befolgen Sie die institutionellen Leitlinien, um die Spenderratte vollständig zu beäschen oder einzuschläfern. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf die Zehenprise.
  4. Bewegen Sie das Tier in den sterilen Operationsbereich. Legen Sie das Tier auf den Rücken und sprühen Sie die gesamte ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.
  5. Machen Sie einen sagittalen, X-förmigen Schnitt, der den Zugang zu Brustdrüsen, Bauch- und Leistendrüsen ermöglicht. Sezieren Sie das gesamte Brustdrüsengewebe der Spenderratte mit einer Schere (Abbildung 1). Entfernen Sie alle sichtbaren Lymphknoten.
  6. Extrahieren Sie das Brustgewebe mit Zangen und legen Sie es in eine beschriftete 60 mm Schale auf Eis. Fügen Sie der 60-mm-Schale 500 L serumfreies DMEM/F12-Medium hinzu. Passen Sie die Platzierung des Brustdrüsengewebes so an, dass es vollständig nass bleibt.
  7. Das Brustgewebe mit einer Schere fein zerkleinern. Schneiden Sie dazu das Gewebe in Stücke von 1-2 mm3 in der Größe(Abbildung 1C). Halten Sie die Drüse auf Eis, bis das gesamte Spendergewebe geerntet wurde (nicht mehr als 60 min).
    HINWEIS: Zusätzliches Personal kann Brustdrüsen zerkleinern und zusätzlich Kollagenaselösung vorbereiten, während der Chirurg mit Gewebeextraktionen fortfährt.

2. Extrahieren Sie Hirngewebe von eingeschläferten Spendern

  1. Drehen Sie den Körper des Spendertiers vorsichtig um, um ihn in eine anfällige Position zu bringen. Sichern Sie sich mit Stiften. Den Kopf und den oberen Rücken mit 70% Ethanol besprühen.
  2. Suchen Sie die Basis des Schädels und machen Sie einen Schnitt unter den okzipitalen Kondylen. Legen Sie eine scharfe Schere unter die Haut und schneiden Sie die Haut vom Schädel weg, einschließlich der Seiten des Kopfes.
  3. Verwenden Sie Knochenschneider oder starke Scheren, um den Schädel entlang der Mittellinie zu schneiden, von der okzipitalen bis zur frontalen Knochen. Halten Sie die Klinge so oberflächlich wie möglich und Winkel nach oben, um die Zerstörung des darunter liegenden Gehirngewebes zu verhindern.
  4. Schälen Sie den Knochen mit Rongeurs oder starken Zangen. Setzen Sie das Werkzeug seitlich in das Kleinhirn ein, um den Knochen auf beiden Seiten zu brechen und den knöchernen Gehörgang freizulegen. Trennen Sie die Verbindungen zu den Meningen.
  5. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit gekrümmten, feinen Zangen an. Legen Sie das Gehirn auf ein Stück Folie und erfassen Sie das Gewicht, und übertragen Sie dann sofort auf ein 15 ml Rohr mit einer gleichen Menge (w:v) von Medien, auf Eis gespeichert.
    1. Optional verwenden Sie Feinspitzenzange, um die Hypophyse (unter dem Gehirn) für den zusätzlichen Einsatz im Transplantationsverfahren zu entfernen, falls erforderlich.
  6. Verwenden Sie einen mechanischen Homogenisator, um das Gewebe zu stören. Homogenisieren Sie das Gehirn für 10-15 s bei niedriger Geschwindigkeit. Die Mischung mindestens 1 min auf dem Eis sitzen lassen und dann wieder homogenisieren. Die Homogenisierung ist ausreichend, wenn die endgültige Mischung frei von großen Stücken ist.
  7. Filtern Sie das Homogenat, indem Sie es durch einen 100-mm-Filter passieren. Bewahren Sie das Filtrat bis zum Gebrauch (weniger als 4 h) auf Eis auf.

3. Verdauung und Verarbeitung von Brustdrüsenextrakten

  1. Tauoder oder warme Reagenzien wie angegeben (Tabelle 1). Befolgen Sie die entsprechenden Schritte zur Wiederherstellung von Organoiden oder monodispersen Zellen.
  2. Bereiten Sie 10 ml serumfreie Verdauungsmedien (ohne Kollagenase) für jedes Spendertier vor (Ergänzungsdatei 1).
    HINWEIS: Das Volumen der verwendeten Verdauungsmedien kann angepasst (nach oben oder unten skaliert) werden, um gegebenenfalls das gruppierte Gewebe aufzunehmen.
    1. Für Organoide springen Sie auf 3.3.
    2. Für monodisperse Zellen, bereiten frische Monodispersion Mischung und Inactivation Lösung (Ergänzungsdatei 2, Ergänzungsdatei 3) zusätzlich zu den serumfreien Kollagenase Verdauungsmedien. Fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.
  3. Wenn das gesamte Brustgewebe von Spendern extrahiert und gehackt wurde, fügen Sie das Kollagenase-Enzym zu den warmen (oder Raumtemperatur) Verdauungsmedien hinzu (Supplemental File 1). Mix durch Invertieren.
  4. Übergeben Sie das Kollagenase-Verdauungsmedium durch einen 20-mm-Filter. 10 ml gefilterte Medien in die beschrifteten 50 ml-Rohre für die Verdauung geben.
  5. Verwenden Sie für jede Probe eine neue Pipette-Spitze von 1.000 l und übertragen Sie das gehackte Spendergewebe von jeder 60-mm-Schale in das Kollagenase-Verdauungsrohr. Schneiden Sie 1 cm vom Ende einer 1.000-L-Spitze ab und legen Sie sie vor Gebrauch manuell auf das Gerät. Mischen Sie das gehackte Gewebe vorsichtig, indem Sie 1-2 Mal nach oben und unten pfeifen.
    HINWEIS: Wenn das Gewebe während der Übertragung schwierig zu pipette ist, verwenden Sie eine kleine Menge des Kollagenase-Verdauungsmediums aus dem 50-ml-Rohr, und übertragen Sie es dann zurück.
  6. Legen Sie die Proben in der horizontalen Position in einen Schüttelinkubator und lassen Sie die Proben 1,5-2 h bei 37 °C, 200-220 Rpm verdauen.
    1. Für Organoide springen Sie auf 3.7.
    2. Für monodisperte Zellen fügen Sie DNase I (0,2 g/ml) in die Mischung für die letzten 10 min der Verdauung. Inkubieren wie zuvor, mit kräftigem Schütteln. Fahren Sie mit Schritt 3.7 fort.
  7. Wenn das Gewebe vollständig verdaut ist, pellet die Suspension mit kalter Zentrifugation (4 °C) für 10 min bei 1.200 x g (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Halten Sie Rohre zwischen jedem Schritt auf Eis, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen.
  8. Stellen Sie sicher, dass sich ein Pellet gebildet hat, und gießen Sie dann vorsichtig die Überstand- und Fettschicht ab. Das Pellet in 10 ml frischen DMEM/F12-Medien vorsichtig wieder aufhängen.
  9. Kurz drehen bei 68 x g für ca. 10 s. Die Länge der Drehung (aber nicht die Geschwindigkeit) kann erhöht werden, wenn es keine klare Trennung der Zellen gibt. Überprüfen Sie das Pellet visuell, bevor Sie fortfahren (Abbildung 1D).
  10. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und hinterlassen Sie ein kleines Volumen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, je nach Benötigtwerden von Organoiden oder monodispergierten Zellen.
    HINWEIS Es ist wichtig, ein kleines Medienvolumen im Rohr zu lassen, da das Pellet sehr locker ist. Das Restvolumen der Medien wird durch Waschschritte verdünnt.
    1. Für Organoide, fügen Sie ein weiteres 10 ml Volumen von DMEM / F12 Medien und wiederholen Sie die Wäsche / Spin. Nach der zweiten Wäsche die Zellen in einem kleineren Volumen (1-2 ml) DMEM/F12-Medien zur Filtration wieder aussetzen. Fahren Sie mit Schritt 3.11 fort.
    2. Für monodisperse Zellen in 2 ml vorgewärmter HBSS mit 0,025% (w/v) Trypsin und 6,8 mM EDTA auflösen. 3-5 min bei 37 °C verdauen. Sofort inaktivieren.
      1. Fügen Sie 4 ml DMEM/F12 mit 10% FBS hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren.
      2. Drehen Sie die Zellen bei 270 x g für 5 min, und setzen Sie dann in DMEM/F12 mit 10% FBS wieder ab. Fahren Sie mit Schritt 3.11 fort, um die Zellen zu filtern.
  11. Filtern Sie die Zellen mit einem 40 m Zellsieb, das in einem neuen 50 ml-Rohr platziert ist. Das Sieb vorbefeuchten, indem man 1 ml des gleichen Basismediums, das zum Aufhängen der Zellen verwendet wird, vorbefeuchten und dann die Zellsuspension mit einer Pipette durch den Filter leiten, um duktale Fragmente/Organoide zu sammeln.
    HINWEIS: Die ungefähre Ausbeute des gefilterten Epithels aus dem Brustdrüsengewebe einer einzelnen, 4 Wochen alten Spenderratte beträgt 1 x 106 Zellen.
    1. Bei Organoiden das Filtrat entsorgen. Mamma-Organoide bleiben im Korb des Zellsiebes und kleinere, unerwünschte Zellen werden eliminiert. Invertieren Sie das Zellsieb über ein neues 50 ml-Rohr, und spülen Sie mit jedem Volumen, das notwendig ist, um die Zellen zu sammeln. Fahren Sie mit Schritt 3.12 fort.
    2. Bei monodispersen Zellen entsorgen Sie das Zellsieb und behalten sie das Filtrat, da die Epithelzellen der Brust den Filter durchlaufen, zusammen mit kleineren Stromal- und Immunzellen. Spülen Sie das Rohr, das für die Verdauung/Zentrifugation verwendet wurde, mit einem anderen Volumen von DMEM/F12 mit 10% FBS und durchlaufen Sie dasselbe Zellsieb. Pellet die monodispersen Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 x g für 5 min. Fahren Sie mit Schritt 3.12 fort.
      HINWEIS: Die resuspendierten Zellen sind für nachfolgende Anwendungen bereit.
  12. Pulsdrehen Sie die Lösung und stellen Sie die Bildung eines Zellpellets sicher, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Pulsdrehung, falls erforderlich, wieder.
  13. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Setzen Sie das Pellet in einem kleinen Volumen (1.000-2.000 l DMEM/F12) wieder auf, um die Zellen zum Zählen zu konzentrieren.
  14. Zählen Sie Zellen und verdünnen Sie bei Bedarf. Setzen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen für die Transplantation in 20 L DMEM/F12-Medien für jedes Tier aus. Halten Sie die Zellen immer auf Eis.
    HINWEIS: Spenderzellzahlen im Bereich von 1 x 105 - 1 x 106 Zellen werden für jede Transplantatstelle auf der Grundlage des Endpunkts der Studie benötigt. Beispielsweise erfordern Carcinogenese-Experimente im Vergleich zu anderen Anwendungen oft eine größere Anzahl transplantierter Zellen. Die Anzahl der benötigten Zellen muss für jeden Stamm experimentell bestimmt werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren nutzte 250.000 Spenderzellen in 20 L-Medien pro Transplantatstelle vor dem Mischen mit Hirnhomogenat, wie in Schritt 3.16 beschrieben.
  15. Bereiten Sie alle Aliquot(s) von Zellen vor, die für andere Experimente benötigt werden (z. B. FACS-Isolation3,26,27,30,33).
    1. Für Organoide fahren Sie mit Schritt 3.16 fort.
    2. Für monodisperse Zellen, quantifizieren Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypan oder Methylen blau Färbung, und dann fortfahren.
  16. Bereiten Sie einzelne Chargen von Spendermaterial für alle Transplantationsempfänger vor. Kombinieren Sie gleiche Volumina der Zellsuspension (20 l) mit 50% Gehirnhomogenat (20 l) für jeden Ort der Transplantation.
    HINWEIS: An jedem Standort werden insgesamt 40 L pro Standort injiziert, es wird jedoch empfohlen, mindestens 25 % zusätzliches Volumen für Abfälle aufzunehmen.
  17. Gehen Sie sofort zur Transplantation oder einfrieren Sie Zellen für die Transplantation später (potenzieller Haltepunkt).
    HINWEIS: Gefrorene Zellen wurden nicht mit diesem Protokoll getestet und müssen im Vorfeld einer Tierkohorte für Transplantationsexperimente optimiert werden. Es wird dringend empfohlen, frische Zellen zu transplantieren.

4. Transplantationsverfahren (Empfängerratten im Alter von 4-5 Wochen)

  1. Wiegen Sie jede Empfängerratte und berechnen Sie die richtige Dosis des zugelassenen Analgetikums, das im Verfahren verwendet wird.
    HINWEIS: Körpergewichte können bis zu 24 h vor dem Eingriff gemessen werden. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien, um jedes Tier für die Dauer der Rasur zu befolgen oder kurz zu beanstanden.
  2. Rasieren Sie den Operationsbereich auf jedem Tier mit elektrischen Clippern. Identifizieren Sie die Basis des Schädels und den Beginn der Wirbelsäule. Etwa ein Drittel des Weges nach unten die Wirbelsäule, rasieren Sie eine 3 cm x 2 cm Fläche auf dem oberen brustförmigen Teil des Rückens.
    HINWEIS: Das Rasieren kann auch unter Anästhesie am Tag der Transplantation durchgeführt werden, muss aber außerhalb des sterilen Feldes durchgeführt werden. Bringen Sie die Ratte in ihren Heimischen Käfig zurück, bis sie benötigt wird.
  3. Suchen Sie alle für die Transplantation benötigten Vorräte (Tabelle 1).
  4. Bewerten Sie das Labortieranästhesiesystem vor der Anwendung. Top off alle Flüssigkeiten und ersetzen Sie alle Tanks oder Teile, die benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Gasleitung zur Anästhesiekammer geöffnet ist und alle peripheren Leitungen geschlossen sind, so dass Isoflurananästhesie und Sauerstoff frei zum Tier fließen können, sobald es in die Kammer gelegt wird.
  5. Warme Heizkissen zur Unterstützung der Körpertemperatur der Empfängertiere.
  6. Generieren Sie das sterile Feld, das für die Operation verwendet wird. Ordnen Sie die Lieferungen wie in Tabelle 1beschrieben an.
  7. Verabreichen Sie präoperatives Schmerzmittel an Empfängerratten, wie durch das institutionell zugelassene Tierpflegeprotokoll angegeben.
  8. Spülen Sie die Hamilton-Spritzen mit sterilen DMEM/F12-Medien, um Zellverlust zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Nadel am Körper der Spritze befestigt ist, legen Sie die Nadel in die Flüssigkeit ein und ziehen Sie den Kolben zurück. Füllen Sie auf das maximale Volumen. Drücken Sie den Kolben nach unten und vertreiben Sie den Inhalt in ein Abfallsammelrohr. Wiederholen Sie dies 3-5 Mal.
  9. Laden Sie das gesamte Volumen des Spendermaterials (in Schritt 3.16) in eine separate Spritze für jede Bedingung (z. B. Kontrolle, behandelt, Wildtyp, Knockout usw.). Setzen Sie die Spitze der Nadel in die Flüssigkeit ein, ziehen Sie den Kolben zurück und halten Sie die Nadel unter der Oberfläche des Gemischs, wenn das Volumen im Rohr abnimmt.
    HINWEIS: Fügen Sie mindestens 10 % zusätzliches Volumen in jede Spritze ein. Entsorgen Sie das restliche Gemisch nicht, schließen Sie das Rohr und halten Sie es auf Eis, falls mehr benötigt wird.
  10. Invertieren Sie die Spritze, nachdem sie vollständig geladen ist, und drücken Sie den Kolben leicht, um Luftblasen an der Spitze der Nadel zu entfernen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn alles vorbereitet ist.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Nadel niemals eine andere Oberfläche berührt, auch nicht innerhalb des sterilen Feldes. Es ist hilfreich, den Körper der Spritze über einen kleinen Behälter mit Eis zu ruhen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu fördern.
  11. Legen Sie das Empfängertier in die Anästhesiekammer und schalten Sie die Maschine ein.
  12. Wenn das Tier vollständig entspannt ist (reagiert nicht auf Klopfen oder sanfte Bewegung der Kammer), richten Sie die Anästhesie auf den Nasenkegel und übertragen Sie das Tier auf das sterile Feld.
    HINWEIS: Die verlängerte Dauer der Anästhesie wird von Ratten nicht gut vertragen. Führen Sie das Verfahren für jedes Tier in 10 min oder weniger aus.
  13. Legen Sie das Tier in eine anfällige Position (auf dem Bauch), so dass der Hinterkopf und die obere Wirbelsäule zugänglich ist.
    HINWEIS: Sorgen Sie für eine ausreichende Wärmeunterstützung für das Tier und bewerten Sie regelmäßig die Tiefe der Anästhesie mit einer festen Zehenprise.
  14. Optional, ophthalmologische TierarztSalbe anwenden, um das Trocknen der Augen zu verhindern.
  15. Reinigen Sie den frisch rasierten Bereich, um überschüssiges Haar zu entfernen. Verwenden Sie eine kreisförmige Bewegung und wenden Sie 70% Ethanol (oder ein anderes Reagenz, nach institutionellen Richtlinien) auf die Haut, gefolgt von einem Antiseptikum (wie Jod), und wiederholen. Legen Sie ein Handtuch über das Tier, so dass nur die Region für den rasierten Bereich ausgesetzt ist.
  16. Stellen Sie sicher, dass das Tier mit einer festen Zehenzange nicht auf tiefe Reize reagiert, und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
  17. Machen Sie einen kleinen (2 cm) Zwischenschnitt mit einer scharfen chirurgischen Klinge.
    HINWEIS: Der Schnitt muss oberflächlich sein, da sich das Fettpolster direkt unter der Haut befindet.
  18. Suchen Sie das mediale Blutgefäß zur Orientierung (Abbildung 2B).
  19. Heben Sie die Haut auf einer Seite des Schnittes mit Zangen und halten Sie sie vom Fettpolster weg, während die Transplantation durchgeführt wird (Abbildung 2B). Setzen Sie die Nadel in die Transplantatstelle ein.
    1. Optional bewegen Sie die Spitze der Nadel innerhalb des Gewebes und erstellen Sie eine kleine Tasche, um die Zellen zu sammeln. Verwenden Sie eine kleine, sich wiederholende Bewegung. Entfernen Sie die Nadel nicht.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird für Erstbenutzer des Protokolls empfohlen. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie eine Tasche erstellen, da das interscapuläre Fettpolstergewebe sehr empfindlich ist.
  20. Injizieren Sie vorsichtig 40 l des Zellgemisches in das interscapuläre Fettpolstergewebe. Entfernen Sie die Nadel langsam.
  21. Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle und lassen Sie die transplantierten Zellen für 3-5 s zu begleichen. Verwenden Sie ein zusätzliches Paar Zangen, wenn nötig.
  22. Entfernen Sie die Nadel. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang (Schritte 4.18-4.21) am zweiten Ort der Transplantation.
    HINWEIS: Das Epithel einer Spendergruppe kann in die gleiche Seite des Fettpolsters bei jedem Tier oder abwechselnde Seiten injiziert werden, um Chargeneffekte durch die Handdominanz des Chirurgen zu verhindern.
  23. Schließen Sie die chirurgische Wunde mit Wundclips oder Nähten, und brechen Sie dann die Anästhesie ab.
  24. Bereitstellung postoperativer Analgetika gemäß institutionellen Protokollen angegeben.
  25. Das Tier sofort mit der Wärmeunterstützung in einen Bergungskäfig bringen. Überwachen Sie Anzeichen von Not wie Blutungen durch den Schnitt oder Atembeschwerden.
    HINWEIS: Das Tier sollte sich innerhalb von 5-10 min vollständig erholen. Siehe institutionelle Richtlinien für die Rückführung von Tieren in die Kolonie und die postoperative Überwachung nach Überlebensprozeduren.
  26. Optional führen Sie Carcinogenese-Studien an der/den Transplantationsstelle(n) durch, indem Sie den Empfängerratten 3-4 Wochen nach der Transplantation Karzinogenese-Studien verabreicht.
    HINWEIS: In der Regel wird die Karzinogenese der Ratten mit einer chemischen karzinogenen Behandlung im Alter von 50-57 Tagen durchgeführt. Diese Behandlung diktiert das Alter der Transplantationsoperation (die zwischen 29-36 Tagen durchgeführt werden muss), um genügend Zeit für die transplantierten Zellen zu lassen, um das Wachstum der Brustdrüse zu initiieren.

5. Bewertung des epitheliaalen Auswuchses

  1. Überwachen Sie den Estrus-Zyklus von Ratten durch die tägliche vaginale Spülung und untersuchen Sie die Zytologie auf einem Mikroskop-Dia. Beginnen Sie 8-12 Tage vor dem Ende der Studie. Opfern Sie alle Ratten in der gleichen Stufe. Dies ist ein optionaler Schritt.
    HINWEIS: Der Ratten-Estrus-Zyklus beträgt 4-5 Tage. Wenn das Tier durch 1-2 volle Zyklen gehen kann, wird die Interpretation erleichtert, da Lavage-Dias aus früheren Zyklen zum Vergleich verwendet werden können.
  2. Opfern Sie Transplantationsempfängerratten 6-8 Wochen nach der Transplantation, gemäß den institutionellen Richtlinien.
    HINWEIS: Das Auswachsen ist in der Regel 3-6 Wochen nach der Transplantation nachweisbar, aber es kann zusätzliche Zeit erforderlich sein.
  3. Setzen Sie das Tier in eine anfällige Position und reinigen Sie den Körper mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit Dereins und machen Sie einen Schnitt entlang der Wirbelsäule, um das mittelskapulierkuläre Fettpolster freizulegen. Sezieren Sie die Haut weg vom Gewebe, so dass der Großteil des Fettpolsters sichtbar ist.
  4. Identifizieren Sie das mediale Blutgefäß, das die Transplantatstellen im interscapularen Fettpolster trennt. Schneiden Sie das gesamte Pad als ein einzelnes Stück Gewebe oder schneiden Sie entlang des Blutgefäßes und entfernen Sie die Seiten einzeln.
  5. Legen Sie das Gewebe auf ein positiv geladenes Mikroskopschlitten für die gesamte Halterung. Verwenden Sie 2 Paare von stumpfen Zangen und sanft das Gewebe zu verteilen, um seine ursprüngliche Konformation auf dem Dia wiederherzustellen.
    HINWEIS: Rattenbrustgewebe ist extrem empfindlich. Die Ränder des Gewebes können sich unter sich selbst krümmen. Behandeln Sie immer mit Sorgfalt und halten Sie an Ort und Stelle, bis das Gewebe an der Rutsche haftet (ein paar Sekunden).
  6. Ganzberg mindestens eine der endogenen Abdominal-Leisten-Brustdrüsen (mit Lymphknoten zur Orientierung) zum Vergleich.
  7. Legen Sie die Dias in 70% Ethanol für 7-10 Tage, um das Gewebe zu entschärfen. Ethanol so oft wie nötig auffüllen, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet.
  8. Bereiten Sie Alum-Caramin-Färbung vor und verarbeiten Sie die Dias, wenn das Gewebe ausreichend undurchsichtig ist. Lassen Sie den Fleck vor der Verwendung abkühlen (Zusatzdatei 4).
    HINWEIS: Der Fleck kann bis zu einem Tag vor den Fixations- und Rehydrierungsschritten vorbereitet werden. Die Lösung kann bei 4 °C gelagert werden und hat ein begrenztes Wiederverwendungspotenzial.
  9. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie die Dias in 25% Eisessigsäure platzieren: 75% Ethanol für 60 min.
    1. Rehydrieren Sie das Gewebe durch eine Reihe von 3 Wässen in einer Reihe von abnehmenden Konzentration von Ethanol: 70% Ethanol für 15 min, 50% Ethanol für 5 min und dH2O für 5 min.
  10. Mit Alum-Carmine für 4-8 Tage färben. Überprüfen Sie jeden Tag die Rückseite der Dias, um festzustellen, ob der Fleck vollständig in das Gewebe eingedrungen ist. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Färbung abgeschlossen ist.
    HINWEIS: Die Färbung ist abgeschlossen, wenn die dicksten Teile der Drüse einen violetten Farbton haben und nicht mehr weiß erscheinen.
  11. Das Gewebe zu entwässern und zu dehydrieren, indem die Dias durch eine Reihe von zunehmenden Ethanolkonzentrationen übertragen werden: 70% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min und 100% Ethanol für 30 min.
  12. Legen Sie dehydrierte Dias in Xylol für 3+ Tage, um das Gewebe zu löschen. Transfer zu Mineralöl zur Langzeitlagerung.
  13. Nachdem die Dias gelöscht wurden, verwenden Sie Low-Power-Lichtmikroskopie oder hochauflösende digitale Fotografie, um Bilder der Dias für die Analyse zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass die Bildaufnahmeparameter für alle Folien konsistent sind.
    HINWEIS: Epithelwachstum muss deutlich unterscheidbar sein.
  14. Behandeln Sie das Vorhandensein von Wachstum als binäres Ergebnis.
  15. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der transplantierten Epithelzellen, die in 50 % der Transplantatstellen unter Verwendung der aufgenommenen Bilder ein Brustwachstum von 1 € produzierten. Quantifizierung anderer physischer Merkmale bei Bedarf.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Spender und Empfänger Brustdrüsen
Die Schritte zur Isolierung und Vorbereitung von Ratten-Mamma-Epithelzellen für die Transplantation sind in Abbildung 1Adargestellt. Im Alter von 4 Wochen hat die endogene Brustdrüse der Spenderratte mit der Reifung begonnen und Epithel kann auf ganzen montierten Dias visualisiert werden, die mit Alumcarmine gefärbt sind (Abbildung 1

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Brustepithelzelltransplantationstechnik, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist. Isolierte Epithelorganoide von Spenderratten (3-5 Wochen alt) werden in das interskapulierliche weiße Fettpolster der Empfängerratten (ebenfalls 3-5 Wochen alt) eingepfropft. Die Ergebnisse können nur 4-6 Wochen später interpretiert werden, mit Hilfe der Lichtmikroskopie, um das transplantierte Gewebe zu untersuchen; Allerdings muss vor der Durchführung eines vollständigen Experiments die optimale Zeit z...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Forschungsfinanzierungsmittel des Hollings Cancer Center es Cancer Center Support P30 CA138313 von den National Institutes of Health (https://www.nih.gov/) und Mittel des Department of Pathology & Laboratory Medicine der Medical University of South Carolina finanziert. Wir danken Marijne Smiths für die Aufzeichnung der Interview-Aussagen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 &Mikro; M SpritzenvorsatzfilterFisher Scientific09-715Gfiltrierende Kollagenase-Aufschlussmedien
1,5 - 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen (steril)Fisher Scientific05-408-129mit resuspendierten Zellen und/oder Gehirnhomogenatgemisch
100 & Mikro; M-Zell-SiebeCorning431752filtrierende Homogenisierung
Gehirns 100 μl gasdichte Spritzen mit 25 Gauge-NadelnHamilton81001 & 90525Zur Injektion von Transplantatmischung in Empfängertiere (1 pro Spendergenotyp/-zustand)
1000 μl Pipettenspitzen + Pipette-Transfer von Zellen/Gemischen/Gewebe
15 ml Polypropylen-RöhrchenFalcon (Corning)352196Lagerung der Gehirn-Homogenat-Mischung oder Zelle : Homogenat-Mischung für die Transplantation
40 & Mikro; M ZellsiebeCorning431750filtrierende Organoide nach dem Waschen des Zellpellets
50 mL Polypropylen-RöhrchenFisher Scientific05-539-6für den Kollagenaseverdau von Spender-Brustdrüsengewebe
60 mm SchalenThermo Scientific130181zum Zerkleinern von Gewebe
Alaun-KaliumsulfatSigma-Aldrich243361/237086Färben der Brustdrüse ganze Halterung Objektträger
Anästhesie-Vaporizer für veterinärmedizinische Zwecke-befolgen Sie das institutionelle Protokoll
Beta-Dine oder Jod-
Borosilikatglas-Kulturröhrchen für die HomogenisierungFisher Scientific14-961-26für die Homogenisierung des Gehirns (verwenden Sie ein geeignetes Röhrchen für den Homogenisator)
KarminSigma-AldrichC6152/1022Färbung der Brustdrüse Ganzes Reittier Objektträger
Zellzählgerät-
Tierkäfige für die Genesung-befolgen Sie das institutionelle Protokoll
Kollagenase Typ 3Worthington Biochemical Corp.LS004183enzymatische Verdauung von zerkleinertem Brustdrüsengewebe von Spenderratten
deionisiertes Wasser-für chemische Lösungen
DMEM/F12GIBCO11320033zum Zerkleinern von Gewebe, Kollagenase-Aufschlussmedien und resuspendierende Epithelzellgemische
EDTA-Monodispersionsgemisch
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701Fixiermittel für Brust-Whole-Mount-Objektträger, Waschen von Whole-Mount-Objektträgern, Reinigung von chirurgischen Inzisionsstellen (verdünnt)
Fötales Rinderserum (FBS)Hyklone-Inaktivierungslösung
Gaze--
EisessigsäureFisher ScientificA38-212zur Verwendung als Fixiermittel für Mamma-Whole-Mount-Objektträger (1:4 Eisessigsäure in 100 % Ethanol)
HBSSGIBCO-Monodispersionsmischung
Heizkissen-befolgen Sie das institutionelle Protokoll
Eiskübel (x2)-
Inkubator mit orbitaler Rotation-müssen in der Lage sein, 37° zu halten; C, Schütteln bei 220-225 U/min (für die Kollagenaseverdauung von Brustgewebe)
Isofluran-Anästhesie-befolgen Sie das institutionelle Protokoll
Lichtmikroskop oder Digitalkamera-Visualisierung des gesamten montierten Brustepithels und/oder Aufnahme von Bildern
Mechanischer HomogenisatorFisher Scientific-TissueGeizhalsoder alternative Modelle
Mineralöl, reinSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5Langzeitlagerung von gereinigten ganzen Halterungen der Brustdrüse
Sauerstofftanks für den Anästhesieverdampfer-befolgen Sie das institutionelle Protokoll
Papiertücher oder empfindliche Arbeitstücher-
Positiv geladene ObjektträgerThermo ScientificP4981-001Brustdrüsengewebe ganze Halterungen
Postoperativ Analgetikum-Institutionelles Protokoll
WaageKörpergewichtsmessungen von Tieren, richtige Dosierung von Schmerzmitteln
Rasierer-elektrische Schermaschinen oder andere
Färbegläser-mindestens 1 pro chemischer Wäsche, Größe entsprechend der Anzahl der Objektträger, Glas bevorzugt
Sterile FeldabdeckungenIMCO4410-IMCzur Verwendung während der
Transplantation Sterile Scheren und Pinzetten x3 (autoklaviert)-autoklavierte chirurgische Instrumente für Spender und Empfänger
Spritzen: 5 ml (oder mehr)-für die sterile Filtration von Kollagenase-Aufschlussmedien
Trypsin-Worthington-Monodispersionsgemisch
Abfallsammelbehälter für Flüssigkeiten (gegossen oder aspiriert) -
Wundclip-Applizierer, Clips und EntfernungswerkzeugFine Science Tools12020-00Schließen des Hautschnitts über dem interscapularen weißen Pad-Pad
XyloleFisher ScientificX3S-4Reinigung der Brustdrüse ganze Halterungsobjektträger nach dem Färben
steril des Reinigen Sie -

Referenzen

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343(1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173(1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7(2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634(1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002(2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Rattenmilchdr seIsolation von Milchdr sengewebeKollagenase VerdauZellsieb FiltrationMischen mit Gehirnhomogenatchirurgische TransplantatinjektionWhole Mount F rbungEntwicklung der Milchdr se
Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.