Summary
この方法は、R26R-Confetti(Confetti)マウスモデルを使用してミネラル化された組織を研究し、繁殖戦略から画像取得に至るすべてのステップをカバーすることを説明します。含まれているすべての軟部組織に適用することができる一般的なプロトコルおよびミネラル化されたティッシュに適用することができる改変されたプロトコル。
Abstract
体内の個々の細胞にラベルを付けて、どの細胞型が生物を生み出し、その移動を追跡したり、その寿命を決定したりすることは、組織の発達と維持のメカニズムを明らかにする強力な方法です。生体内のセルを監視するために現在利用可能な最も重要なツールの 1 つは、Confetti マウス モデルです。Confettiモデルは、細胞型特異的な方法で様々な蛍光タンパク質を有する生きているマウスの個々の細胞を遺伝的に標識し、その運命、ならびに時間の経過とともに子孫の運命を、クローン遺伝的追跡と呼ばれるプロセスで監視するために使用することができる。クローン系統トレース。このモデルはほぼ10年前に生成され、特に成体組織の幹細胞生物学、開発、および更新に関連する多くの生物学的プロセスの改善に貢献してきました。しかしながら、画像収集および様々な蛍光シグナルの同時捕捉まで蛍光シグナルを保持することは、特に無機化組織では技術的に困難である。本書では、Confetti モデルを使用して、任意の鉱化組織または非鉱化組織に適用できる成長プレート軟骨を分析するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。
Introduction
細胞の挙動を監視する改善された方法は、動物モデルを使用する際の実験効率を高める方が望ましい。生体内の細胞挙動を監視する最も有益なアプローチの1つは、広く使用されているR26R-Confetti(Confetti)マウス2を含む、多色レポーターマウス株1を用いてクローン系統トレースです。個々の細胞を蛍光タンパク質で遺伝的に標識し、時間をかけてそれらの細胞を追うことで、多くの分野の研究者はConfettiマウスを使用して、多数の異なる生物学的システムに関する洞察を明らかにしました。
Confettiマウスは、Cre依存性DNA組換えが確率的方法でいくつかの可能な蛍光タンパク質の1つの永久発現を引き起こすloxPベースのレポーターシステムです2。R26R-Confettiアレルは、loxPフランクネオR-カセット2の直上流にあり、そのポリアデニル化配列が転写3を終了し、続いて、ユビキタスに表現されたCAGGプロモーターが含まれています。ブレボンボー2.1は4を構築します。したがって、クレ媒介の組み換えは同時にネオR-カセットを切除し、Brainbow 2.1構築物のどの部分が切除されるかに応じて特定の蛍光タンパク質の産生につながる。この機能により、Confetti マウスは、特定の Cre 株が使用可能なマウスの細胞集団をターゲットにするために使用できるため、非常に適応性があります。R26R-Confetti株との組織特異的Cre株の交差は、標識の特異性を提供する。しかし、Cre株はまた、特定の時点で標識を達成できるように、核に入り、DNA組み換え5を誘導するためにタモキシフェン結合を必要とする、CreERTまたはCreERT2)も誘導可能であるべきである。したがって、細胞集団は、得られたCreERT陽性/Confetti陽性の子孫を所望の時点でタモキシフェンと注入し、目的の組織を分析のために収集できる特定の年齢まで追跡することによって標識することができる。組織処理後、蛍光標識細胞を共焦点顕微鏡で直接可視化できるため、初期標識された各細胞の子孫を、その特異的蛍光に基づいて他の標識細胞によって生成された子孫から分離することができる。それによって、クローン性を評価することができる(すなわち、クローン遺伝的トレース)。
Confettiモデルの柔軟性のために、それは健康および病気2、6、7、8、9の多くの異なった組織の開発そして維持を研究するために適用された 10、11.モデルを使用する一般的な方法の 1 つは、特定の細胞集団にラベルを付け、それら(および/またはその子孫)が寄与した組織を決定することです。このアプローチを用いてそのような発見の1つは、成体歯がグリア起源6を持つ細胞で構成されている点であった。モデルの別の応用は、幹細胞恒常性を研究することです。例えば、Confettiモデルは、幹細胞間の競合中に一部の幹細胞クローンが支配的であるため、腸の暗号中の幹細胞ニッチが徐々にモノクローナルになることを明らかにした。このモデルは、細胞の増殖を評価するためにも使用することができ、これはゆっくりと分裂した細胞を研究するのに特に有用である。例えば、関節軟骨12におけるクローン形成を評価し、5週齢マウスにおける成長プレート軟骨細胞に対するヘッジホッグアンタゴニストの短期的な影響を13に研究した。
Confettiモデルの相対的な単純さにもかかわらず、蛍光信号は、特にミネラル化された組織を分析する際に、画像収集まで保存することは技術的に困難な場合があります。ここでは、出生後の骨(生後6ヶ月まで)でConfettiマウスを使用するように最適化されたモデルを説明し、免疫検出を必要とせずに共焦点顕微鏡で蛍光タンパク質を直接可視化することを可能にする。この簡素化されたプロトコルは、非無鉱物組織に適用することができる。さらに、少なくとも3年間にわたって蛍光シグナルを保存するために試料を保存する方法の説明が含まれている。プロトコルの概要を図 1 に示します。
Protocol
すべてのマウスの研究は、動物実験に関する倫理委員会(ストックホルム北部委員会/ノラ・ジュルフェルソクセツカ・ネムド)によって承認され、スウェーデン動物庁の動物実験に関する規定とガイドラインに従って実施されました。
1. マウスの繁殖
- 歪みを生成するには、R26R-Confettiマウスを対象のCreラインと交差させます。生後21歳の子犬を引き抜く。
注:マウスは、約8週間の生後8週間から、または地元のガイドラインに従って繁殖するために使用することができます。ジェノタイピング(ここでは説明しない)は、離離で収集された生検から行うことができる。引き取り時の年齢は、地域のガイドラインに応わせて調整することができます。
2. 紙吹雪のラベリング
注:この標識戦略は、タモキシフェン誘導性クレ株に適しています。
- ガラス瓶にトウモロコシ油で最大2.5mg/mLタモキシフェンの溶液を準備します。オーブンで37°Cに60分間加熱して溶解し、粉末が溶解するまで渦を使用して5分ごとに攪拌する。
注:タモキシフェンの用量の増加のために、 20 mg/mLまでの溶液は、この方法を使用して調製することができます。 - 光から保護された最大3ヶ月間、4°Cで保管してください。
- 産後最初の日にトウモロコシ油に溶解した2.5mg/mLタモキシフェンの50 μLを経口投与して組換えを誘導する(P1)。
注:原則として、タモキシフェンは、F1世代の早い時期に、任意の年齢で投与することができます。タモキシフェンの用量は、Cre発現、マウス年齢、および実験用途に基づいて変化させるべきである。詳細については、ディスカッション セクションを参照してください。同じ方法で処理されたクレ陰性マウスは、Confetti蛍光シグナルに対する陰性対照として用いることができる。
注意:動物ハンドラーがタモキシフェンの使用について警告を受け、ケージ材料が地元の環境および安全ガイドラインに従って処分されていることを確認してください。
3. ティッシュコレクション
- 出生後27日目(P27)にマウスを安楽死させるには、少なくとも80%の体積で二酸化炭素を含む空間を徐々に充填し、この濃度を3分間維持して子宮頸部転位を行う。他の動物の解剖中に氷の上にマウスを保つ。
- 目的の組織を解剖する。以下に概説は、6ヶ月までの出生後マウスに適した膝の近位脛骨および遠位大腿骨成長プレートおよび関節軟骨を収集するためのプロトコルである。
- 鋭いはさみと歯の鉗子を使用して、足まで後肢の周りの皮膚を取り除きます。
- 鋭いはさみで脚から筋肉と脂肪組織を大まかにトリミングします。
注:周囲の組織は断面時に構造的なサポートを提供しますが、すべての皮膚が除去されていることを確認するため、骨を完全にきれいにしないでください。 - メスを使用して、大腿骨の頭部が見えるまで脚の上部が体と出会う柔らかい組織を切り取り、その後、股関節の靭帯を切断して脚を取り除きます。
注:あるいは、大腿骨の頭部を見つけ出することができない場合は、強いはさみで股関節に近い大腿骨を切り取る。 - メスや鋭いはさみを使って脚の残りの部分から足を解剖します。
4. 組織の固定と処理
注:目的の組織に基づいて、以下に説明する2つのプロトコルのいずれかに従ってください(軟部組織の場合は4.1、または4.2は、以下に詳述するように、約45日間のミネラル化マウス組織の場合)。いずれの方法でも、残りの動物を解剖しながら、3.7%ホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食生(PBS)溶液に解剖したサンプルを氷上に保存します。
- 約P45の年齢までの軟部組織およびミネラル化された脛骨およびフェモラのために、6時間の予冷化された3.7%ホルムアルデヒド/PBSの組織を固定し、4°Cで回転子に穏やかに転がす。組織の10倍以上の体積を使用してください。手順 4.3 に直接進む。
- 約P45の年齢にわたって脛骨およびフェモラを含むミネラル化組織のために、脱石化ステップが必要である。
- 水酸化ナトリウムを用いて8.05に調整したpHで10%EDTA/dH2O溶液の1Lを調出します。次に、この溶液を使用してホルムアルデヒドを3.7%に希釈する。EDTAの稼働率は9%となります。
- 一晩3.7%ホルムアルデヒド/PBSを予冷させ、4°Cで回転子をゆっくりと転がして組織を固定します。
- 組織を予冷させた3.7%ホルムアルデヒド/9%EDTA/dH2O溶液(pH 8.05)に入れ、組織の10倍以上の体積で4°Cで穏やかに回転させます。骨を新鮮な予冷化 3.7% ホルムアルデヒド/9% EDTA/dH2O に次の 48 時間にわたって 3 倍に置いて、この手順を繰り返します。
注:この短いデカール化は、生後6ヶ月までのマウスの大腿骨と脛骨の骨の切除を可能にするのに十分です。より密にミネラル化された組織のために、さらに脱石化は組織学を改善するために必要とされてもよい。
- 組織を予冷させた30%ショ糖/dH2O.に移し、容器をつばに充填し、4°Cで一晩ゆっくりと回転させます。組織の10倍以上の体積を使用してください。組織は、最初にこの溶液に入れたときにしばしば浮かび、朝までにボトルの底に沈みます。
- 残留スクロース溶液を除去するには、スクロース溶液から鉗子で取り出し、サンプルを約5mlの最適切断温度化合物(OCT)で数秒間完全に覆って洗浄します。
- OCTであらかじめラベル付けされたクライモルドを塗り、下部に組織を配置します。サンプルが室温に長時間座りすぎないように素早く作業してください。
注: 断面ステップに適した向きでサンプルを配置することが重要です。Col2CreERT:Confettiでトレースした後、成長板の柱全体を通して断面する可能性を高めるために、大腿骨の頭部をガイドとして下向きに中間側を配置し、サンプルを可能な限り金型の底に平らに配置します。 - ドライアイスの上に金型を置き、OCTが完全に固化するのを待つことによってサンプルを埋め込みます。金型内の組織の動きや滑りを避けるために、クライモルドをできるだけ平らに置きます。完成したら、すぐに使用しない場合は-20°Cで保存してください。
注:年齢とともにブロックがセクションに困難になるので、12週間以内に使用してください。
5. 断面
注:硬い組織に適した使い捨てブレードを持つクライオスタットを使用して凍結切除を行います。任意の標準的なクライオスタットが適しています。
- ブロックを金型から取り出し、ブロックの上部とチャックの間にOCTを塗布し、少なくとも5分間-20°Cでクライオスタットで冷却して、OCTが完全に固化するようにチャックに固定します。
- サンプルホルダーとブレードホルダーの両方を-20°Cに予冷させ、サンプル/チャックをチャックホルダーに入れ、ブレードホルダーにブレードを入れ、数分間平衡させます。
注:指定された温度は、クライオスタットおよび目的の組織に応じて数度変化してもよい。 - クライオスタットを使用して、適切な厚さのブロックをトリミングし、目的の組織内のクローンの視覚化を可能にする組織セクションを切断します。
- 出生後の成長プレート分析では、30−160 μmのセクションを準備し、スライド上で収集します。一部のクライオスタットモデルでは、トリム設定を使用して厚いセクションの収集のみを許可する場合があります。
- 完全に乾燥するまで、スライドを室温で乾燥させます。
注:このステップの持続時間は、組織の特性と断面の厚さに基づいて変化する可能性があります。部屋の温度はまた、このステップの速度に影響を与える可能性があります。 - スライドを -20 °C に最大 36 か月間保管するか、すぐに処理する場合は、手順 6.2 に進みます。
6. スライドの準備と取り付け
- 冷凍庫からスライドを取り外し、スライドホルダーで水平に室温まで持ち上げます。任意の結露が蒸発することを許可します。
- パストゥールピペットを使用して、室温でPBSをスライドに静かに塗布してOCTを取り除きます。断面が厚いほど、時間が長くなります。160 μmの厚さのセクションの場合は、2つのすすりを行います:15分間インキュベートし、液体を除去し、5分間新鮮なPBSを適用し、液体を除去します。
注:このステップは、OCTを除去するものであり、必要に応じて組織特性およびセクションの厚さに基づいて変化させることができる。部屋の温度は、このステップの速度に影響を与える可能性があります。 - 60 mm の長いカバー スリップを持つ室温で 75% 2,2 チオジエノール/dH2O の溶液にスライドを取り付けます。
注:スライドは、イメージングの直前に準備することができますが、蛍光信号は4°Cで加湿室内の光の外に保たれた場合、1〜2週間安定しています。
7. 共焦点顕微鏡によるイメージング
- 顕微鏡を設置します。
- 顕微鏡の電源を入れ、ソフトウェアを開きます。[システムの開始]ボタンをクリックします。
- [取得]タブの [スマート セットアップ]をクリックし、赤色蛍光タンパク質 (RFP)、黄色蛍光タンパク質 (YFP)、シアン蛍光タンパク質 (CFP) の下にある 3 つのチャネルを選択して、チャネルを選択します。染料の見出し。[最適信号]をクリックし、[適用]をクリックしてレーザーを選択します。
注: [取得]タブの内容は、補足ファイル 1Aに表示されます。必要なチャネルが存在しない場合は、[色分け] 見出しの下にある [+' ボタンを使用して追加します。レーザー、励起波長、および記録された発光波長の範囲に関する必要な情報は、補足ファイル1B-Dの3つのConfetti蛍光タンパク質について示されている。 - [取得モード]タブで[目的見出し]の下にある20倍の対物レンズを選択します。
- 成長板または目的の他の組織を見つけます。
- 個別のビューを提供するには、まず[チャネル]タブでその名前をクリックして RFP チャンネルを選択します。これにより、RFP チャネルの詳細が[ライト パス]タブに表示されます。
注:T-PMTチャネルは、組織の非蛍光部を可視化するために使用される非反射レーザー光を示す。 - スライドホルダーにスライドを配置し、光路と対物レンズの間に直接成長板または他の組織を配置します。
- 組織のローカライズを簡略化するには、[チャンネル] タブの [トラック]タブの下にあるチェック ボックスを使用して、YFP チャネルと CFP チャネルの選択を解除します。
- トラック見出しで T-PMT チャンネルの名前をクリックして、T-PMT チャンネルを選択します。[取得]タブで[ライブ]をクリックし、T-PMT チャネルのゲイン (マスター)を増やして、画面上のティッシュ セクションをグレースケールで表示します。
- ジョイスティックを使用してスライドの位置を移動して目的の領域を特定し、適切な顕微鏡ノブを使用してフォーカスします。
- [取得]タブの [停止]をクリックして、レーザーの露出をオフにします。
- 個別のビューを提供するには、まず[チャネル]タブでその名前をクリックして RFP チャンネルを選択します。これにより、RFP チャネルの詳細が[ライト パス]タブに表示されます。
- イメージング パラメータを定義します。
- [チャンネル]タブのチェック ボックスを使用してチャンネルの 1 つを選択し、[取得]タブで[ライブ]をクリックして、そのチャンネルの画像を画面に表示します。次に、マウスの左クリックボタンを使用して、スライドバーを調整して、収集された発光信号の範囲、レーザーパワー(レーザー針路の下のスライドバー)、ゲイン(マスター)、デジタルオフセット[チャンネル]タブを使用して、画面上の [紙吹雪] ラベル付きセルを視覚化します。これらのパラメーターのガイドライン値は、RFP、YFP、および CFP の補足ファイル 1B-Dで提供されます。すべてのチャネルに対して、1 つずつこの手順を完了します。
注:可視化された信号が自己蛍光でないことを確認するために、Cre陰性動物のセクションをこのステップの間に負のコントロールとして使用することができます。T-PMT は RFP レーザー(ステップ 7.2.1)と組み合わされ、RFP のレーザーパワーを調整すると、T-PMT 信号に影響します。 - 必要に応じて、ピンホールサイズを調整して蛍光検出を増やします。
注:ピンホールサイズが大きいほど、Z方向に蛍光信号が検出されます。このガイドラインは、ピンホールインジケータの下に自動的に表示される結果のAiryユニット(AU)で、1 AUはイメージング品質に最適です。AU を大きくしすぎると、Z 方向の個々のセルを区別することが難しくなるため、後で分析が損なわれます) - 設定を確認して、記録された信号が重複していないことを確認します。
- [チャネル]タブのチェックボックスをクリックして3つのチャンネルをすべて選択し、[取得]タブの[スナップ]ボタンを押します。
- 結果の画像では、[ディメンション]タブに表示されている各チャンネルの上にある青いハイライト表示されたボックスをクリックして、表示されたチャンネル間をスクロールします。信号が重なっている場合(例えば、すべての赤いセルも黄色の場合)、ステップ7.3の先頭に戻り、重なり合うチャネルのパラメータを互いに区別できるまで調整します。ラベルごとに(RFP、YFP、または CFP)ごとに、ラベルの 1 つだけを含む少なくとも 1 つのクローンを視覚化できることを確認します。
- [チャンネル]タブのチェック ボックスを使用してチャンネルの 1 つを選択し、[取得]タブで[ライブ]をクリックして、そのチャンネルの画像を画面に表示します。次に、マウスの左クリックボタンを使用して、スライドバーを調整して、収集された発光信号の範囲、レーザーパワー(レーザー針路の下のスライドバー)、ゲイン(マスター)、デジタルオフセット[チャンネル]タブを使用して、画面上の [紙吹雪] ラベル付きセルを視覚化します。これらのパラメーターのガイドライン値は、RFP、YFP、および CFP の補足ファイル 1B-Dで提供されます。すべてのチャネルに対して、1 つずつこの手順を完了します。
- 画像を取得します。
- [取得モード]タブを選択して、[フレームサイズ]、[速度]、および[平均数]値を使用して画質を指定します。
注: これらの実験の一般的な設定は、補足ファイル 1Aに示されています。[取得]タブ内の[スキャン領域]見出しの下のズームを小さくすると、画像取得に必要な時間を変更せずに視野を拡大できます。 - [取得]タブで、[寸法取得]見出しの下にある Zスタックチェック ボックスをクリックします。Zスタックタブを開き、Z 方向の画像間の間隔を 2.5 μm に設定します。
- 正しい位置を設定するには、[チャンネル]タブで RFP/T-PMT のみを選択し、[ライブ]をクリックして、組織の輪郭が表示された赤いクローンを視覚化します。対応するスライスの [最初に設定]をクリックし、[最後に設定]をクリックして、顕微鏡ノブを使用してフォーカスを調整して、最初と最後のスライスを設定します。
- [取得]タブの [タイル スキャン]タブをクリックし、それぞれのボックスに水平方向と垂直方向のタイルの合計数を入力します。
- 画像キャプチャの場合は、[チャンネル]タブで目的のチャンネルをすべて選択し、[スナップ]ボタンをクリックして単一の画像を収集するか、[実験開始]ボタンをクリックしてZスタック/タイルスキャンを収集します。
- [取得モード]タブを選択して、[フレームサイズ]、[速度]、および[平均数]値を使用して画質を指定します。
- 画像を取得したら、[ファイル] をクリックし、[名前を付けて保存]をクリックし、顕微鏡の設定に関する情報をできるだけ多く保持するファイルタイプに画像を保存し、後で確認して再利用できるようにします。
- 画像解析ソフトウェアを使用してさらなる解析を行います。
Representative Results
エピフィシール軟骨に軟骨細胞を標識し、P1のタモキシフェン投与を用いて経齢とともにクローン膨張を可視化するために、Col2CreERT:Confettiマウスに標識を付け、後肢をP27に採取した。中央部は、近位脛骨成長板における十字靭帯(図2A)を可視化して決定した(図2B)。これらのデータは、P1上でCol2陽性であり、タモキシフェンを投与した際にConfetti蛍光タンパク質で標識された個々の細胞がクローン膨張を受け、その後P27まで成長プレートに残っていることを示している。同様の発達時点からのクローン拡張の初期変化は、最近の出版物13の図1に見られる。
長期保存後の蛍光シグナルの一例を挙げると(ステップ5.5)、収集したセクションを3年以上保存して作成して画像化した(図2C、ビデオ1)。.
プロトコルに関して一般的な問題を示すために、凍結切除ステップのステップ中に壊れたセクションを図 3Aに示します。図3Bで拡大されたセクション(成長板と関節軟骨との間)の領域は、タモキシフェンのこの用量が、クローナル分析を妨げるであろうこの領域におけるこのような高レベルの組み換えにつながることを示している。
図 1: 実験の概要。メソッドの主要な段階を要約したフロー チャート。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Col2CreERT:紙吹雪マウスからの紙吹雪画像。(A)Col2CreERTのサンプル:紙吹雪マウスは、デカル化または長期保存工程なしで処理した。中央部は、マーカーとして十字靭帯を用いて位置していた。この画像は、T-PMT(スケールバー= 300 μm)でRFPを検出した後、タイルスキャンを使用して視覚化されました。(B)クローンカラムは、(A)に見える成長板の近位脛内に、3D再構成後に示される。(C)(A)及び(B)に示す隣接スライドを3年以上長期保存に保持し、撮像および3D再構成のために処理した。RFP、YFP、および CFPは(B)および(C)(スケールバー= 50 μm)に示されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: この方法を使用する際の課題。(A)白い破線は、Col2CreERT:Confettiマウス(スケールバー= 50 μm)の成長プレートを通してセクション内の分割を概説します。白いボックス内の領域は(B)(スケールバー= 25 μm)に示されています。RFP、YFP、およびCFPは両方のパネルに示され、非反射レーザー光(T-PMT)チャネルも(A)に示され、組織を可視化する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:Col2CreERTからの成長プレートの3次元再構成:紙吹雪マウス。Col2CreERTから作成されたスライド:Confettiマウスは、3年以上の断面後に長期保存に保持され、その後、イメージングのために処理されました。画像解析ソフトウェアで自動的に立体再建を行い、映像としてエクスポートした。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:共焦点顕微鏡の典型的なセットアップ。(A)取得タブに存在する主なコントロール (B-D)レーザーパラメータ、励起波長、および記録された発光波長の範囲は、3つのConfetti蛍光タンパク質について示されています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
Confettiモデルは、ミネラル化された軟骨組織12、13、14を研究し、最適化されたプロトコルを記述するために広く使用されました。R26R-Confetti対立遺伝子の1コピーまたは2つのコピーを有する紙吹雪マウス2は、繁殖および実験に使用することができる。Brainbow 2.1コンストラクトの1つの対立遺伝子を持つマウスの組み換えは、赤色蛍光タンパク質(RFP、細胞質)、黄色蛍光タンパク質(YFP、細胞質)、シアン蛍光タンパク質(CFP、膜局在)、および緑色の4つの潜在的な標識を与えます。蛍光タンパク質(GFP、核局在)、ホモ接合紙吹雪マウス(すなわち、Brainbow 2.1コンストラクトの2つのコピーを含む)の組み換えは、10の可能な色出力(RFP+RFP、RFP+YFP、RFP+CFP、RFP+GFP、YFP+YFP、YFP+CFP)を与えます。GFP、CFP+CFP、CFP+GFP、GFP+GFP)。しかし、DNA切除および反転事象は確率的な方法で起こるので、GFPを産生するための組み換えは、以前に報告された2として、細胞のほんの一部で起こり、2を使用する細胞型またはCreラインによって一見異なっているように見える。12、13.したがって、GFP式につながる組換えイベントの発生が少ない場合、6色の出力がホモ接合性のConfettiマウスで最も一般的です。
Confetti マウスで実験を計画する際の重要な考慮事項は、適切な Cre 株を見つけることです。まず、ConfettiアレルにはいくつかのloxPサイトがあるため、1つの組み換えイベントは2番目の4を妨げるものではありません。つまり、セルにラベルが付け、1 つの色のクローンを生成するために分割すると、その娘セルの 1 つで 2 番目の組み換えイベントが異なる色を生成し、真のクローン展開をマスキングします。したがって、非誘導性Cre株は、対応するプロモーターが活性である場合に酵素が常に活性である場合、お勧めできません。第二に、Cre recombinaseの発現は、しばしば内因性タンパク質を犠牲にして来るいくつかの株では、それ自身の表現型を作成する(例えば、マウスが2つのCreアレル15を抱えるPrg4-GFPCreERT2ノックインマウス株)。したがって、クレアレルの単一のコピーが望ましいです。記載された実験の全てにおいて、Col2CreERT16の単一コピーは、Col2CreERT:Confettiマウスを生成するために雄または女性の親のいずれかによって運ばれた:Confettiマウス、記載されている13。次に、目的の細胞型に対するCre線の特異性が重要な考慮事項である。例えば、Col2CreERTは軟骨細胞特異的であるが、出生後早期軟骨17における軟骨細胞のいくつかの異なる集団にラベルを付けている。最後に、異なるCre株の活性は、Cre発現に利用されるプロモーターの内因性活性が変化するにつれて、同じタイプの細胞においても(例えば、Prg4-GFPCreERT2、増加を必要とすることができる)、動物の年齢とともに大きく変化する可能性がある。表在性ゾーン細胞をマウス15歳として標識するタモキシフェン用量の数)。
標識細胞の数は与えられたタモキシフェンの量によって反映されるので、クローンを互いに区別することは困難であるかもしれないので、常に最大用量を与えるのが望ましいとは限らない。Cre発現は、年齢とともに異なるプロモーターの規制の下で変化するので, タモキシフェン投与量は、ラベリングを最適化するために調整する必要があります。.組換えが起こるには時間が必要であり、得られた蛍光タンパク質がイメージングのために十分に蓄積するので、細胞は組換えのトリガ時にすぐに蛍光を発しないことに注意することが重要です。クレライン、細胞型、動物の年齢の影響を受けるように見える広い範囲の時間(24-72 hの間)が必要です。タモキシフェンは投与後長く生物学的に活性でありることができるので、各モデルにおける組み換え効率を徹底的にチェックすることが常に推奨される。
共焦点顕微鏡検査段階では、Confetti蛍光タンパク質の励起は、レーザー光による組織の浸透を必要とする。異なる組織は異なる特性を有するので、レーザー光はすべての組織の160 μmの厚いセクションに浸透しない可能性があります。しかし、このような厚い切片は、図2、図3で使用するように、成長板軟骨に使用することができる。すべての顕微鏡は異なっており、説明された設定(補足ファイル1)が小さな調整なしで完全に動作する可能性は低いことに注意してください。主な課題の1つは、異なる蛍光タンパク質を区別して、あるチャネルから別のチャネルへの汚染がないことを確認することです。たとえば、GFP から来る蛍光によって引き起こされる YFP チャネル内の信号は、YFP チャネルと RFP チャネルの間で重複します。YFP および CFP チャネルも慎重にチェックする必要があります。これは、いくつかの方法で行うことができます。まず、各蛍光タンパク質について記録される蛍光光波長の発光範囲を狭めることができる。第二に、デジタルゲインと組み合わせてレーザーパワーを調整すると、信号を最適化することができます。この研究では、これらのステップは十分であったが、それらは強い蛍光シグナルに依存している。これは、理論的には、非効率的な組織処理が蛍光タンパク質の活性を低下させることができる、または弱いレーザー光源がチャネル分離を損なう可能性があることを意味する。
Confettiマウスの利点の1つは、クローンダイナミクスに対する特定の遺伝子の影響を研究できるように、利用可能な多数の遺伝的変異株と組み合わせることができることです10,11,12 、13,14,19,20,いくつかの制限があるが.たとえば、Clonal 系統トレースと組み合わせた Cre loxP ベースの変異体を使用する場合、Confetti アレルと目的遺伝子の組み換えは分離できません。それにもかかわらず、このような一致する組み換えイベントは、有効な 10、14、20.例えば、この可能性は、増殖プレート21におけるTSC1の出生後軟骨細胞特異的アブレーションに続くマウスの安静ゾーンにおける増加した細胞数を探索するために使用され、時間の経過に伴うこれらの細胞間のクローン関係を明らかにした。13.さらに、Confettiマウスを用いた組織特異的クローン分析は、非Cre loxPベースの変異マウス11と共に使用することができ、これらのアプローチを薬理学8、9と組み合わせることも可能である。 、13および/または外科的モデル8は、他の機能的摂動に対するクローン応答を可視化する。Confettiラベル付きセクションと免疫蛍光による内因性タンパク質の免疫検出を組み合わせると、さらなる機会が生じます。このような分析により、トレースされた細胞の同定と、既知のマーカーとの共局在が可能になります。ここに記載される固定方法を用いて、免疫蛍光を行い、紙吹雪蛍光タンパク質12,13からの蛍光を依然として可視化することができる。しかし、前述の論文では、抗原検索は必要なかった。クレートバッファーで沸騰するなどの過酷な抗原検索方法は、紙吹雪蛍光の完全な損失につながります。Confetti蛍光タンパク質は、抗体22を用いて検出することができるが、クローン同一性の喪失が生じ、起こりうる。
要約すると、Confetti モデルを使用して生体内のセルにラベルを付けるのは、時間の経過に見てそれらのセルの運命を分析するための有益なツールです。記載された方法は、ミネラル化された組織における蛍光タンパク質発現を直接可視化する迅速かつ効率的な方法を提供する。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
我々は、方法論的アドバイスのためにエフゲニー・イヴァシキン博士に感謝します。この研究は、スウェーデン研究評議会(A.S.C.)、ロシア科学財団(ASCへの#19-15-00241)、カロリンスカ研究所(A.S.C.)、ストラトレーゲンKI、スティフテルセン・コヌン・グスタフV:s 80-årsfond(A.S.C.)、スティフテルセンによって財政的に支援されました。フリムラ・バーンフセットとサルスカペット・バルナバード(P.T.N.)、中国奨学金評議会(B.Z.)。共焦点顕微鏡はクヌートとアリス・ウォーレンバーグ財団によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
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