Ein Protokoll wird für die Synthese von informationscodierten Peptoid-Oligomeren und für die sequenzgesteuerte Selbstmontage dieser Peptoide in molekulare Leitern unter Verwendung von Ainen und Aldehyden als dynamische kovalente Reaktantenpaare und Lewis-saure Seltenerd- Metalltriflate als Mehrzweckreagenzien.
Dieses Protokoll stellt die Verwendung von Lewis sauren Multi-Rollen-Reagenzien vor, um kinetisches Fallen zu umgehen, das während der Selbstmontage von informationscodierten oligomeren Strängen beobachtet wird, die durch gepaarte dynamische kovalente Wechselwirkungen vermittelt werden, und das thermische Radfahren nachahmt, das üblicherweise für die Selbstmontage komplementärer Nukleinsäuresequenzen verwendet wird. Primäre Aminmonomere mit Aldehyd und Aminanhänger-Moieties werden mit orthogonalen Schutzgruppen funktionalisiert und als dynamische kovalente Reaktantenpaare verwendet. Mit einem modifizierten automatisierten Peptid-Synthesizer werden die primären Aminmonomere durch Festphasen-Submonomersynthese in Oligo-Stränge (Peptoid) kodiert. Bei der Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Charakterisierung durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) werden sequenzspezifische Oligomere einer hohen Belastung eines Lewis-sauren Seltenerdmetalltriflats ausgesetzt, das sowohl die Aldehyd-Moieties schützt als auch das Reaktierungspaargleichgewicht so beeinflusst, dass sich die Stränge vollständig dissoziieren. Anschließend wird ein Bruchteil der Lewis-Säure extrahiert, wodurch das Glühen komplementärsequenzspezifischer Stränge zu informationscodierten molekularen Leitern entsteht, die durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationsmassenspektrometrie (MALDI-MS) gekennzeichnet sind. Das in diesem Bericht beschriebene einfache Verfahren umgeht kinetische Fallen, die häufig auf dem Gebiet der dynamischen kovalenten Montage auftreten, und dient als Plattform für die zukünftige Gestaltung robuster, komplexer Architekturen.
Der Fortschritt in der Selbstmontage, dem Prozess, durch den kleine Untereinheiten größere Architekturen durch thermodynamisch angetriebene Pfade erzeugen, hat eine verbesserte Kontrolle über makro- und supramolekulare Nanostrukturen ermöglicht, typischerweise durch die Nutzung intermolekularer Wechselwirkungen wie Z-Stacking und Wasserstoffbindung1,2,3,4. Insbesondere Nukleinsäuren (d.h. Polynukleotide) haben sich als bemerkenswert vielseitige Nanokonstruktionsmedien herausgebildet, da die hohe Informationsdichte durch Watson-Crick-Basispaarung die Montage komplexer, sequenzselektiver Strukturenermöglicht 4,5. Während die inhärent geringe Festigkeit dieser transienten intermolekularen Bindungen eine Umlagerung und Fehlerkorrektur der Untereinheit ermöglicht, sind die resultierenden Strukturen oft anfällig für thermischen und mechanischen Abbau6. Im Gegensatz dazu, dynamische kovalente Wechselwirkungen7,8,9, eine Klasse von kovalenten Bindungsbildenden Reaktionen, die reversibel oder reansorierbar unter milden Bedingungen sind und vor kurzem verwendet wurden, um komplizierte Makromoleküle wie Leitern10,11,12,13, Käfige14,15,16und Stapel17, bieten erhöhte Bindungsstärken und robuste Strukturen. Leider wird die Fähigkeit zur Umlagerung und Fehlerkontrolle durch die relativ niedrigen Umlagerungsraten dieser kovalenten Arten verringert, wodurch ihre Fähigkeit zur Selbstmontage in gewünschte Produkte eingeschränkt wird18. Um diesem kinetischen Fallen zu begegnen, werden Katalysatoren oder raue Reaktionsbedingungen oft in Verbindung mit einfachen Bausteinen eingesetzt. Hier berichten wir über einen Prozess, der das kinetische Fangen umgeht, um die Selbstmontage molekularer Leitern von sequenzspezifischen Oligomeren zu ermöglichen, bei denen die Hybridisierung durch die in den Oligomerrückstandssequenzen kodierten Informationen gesteuert wird.
Aufgrund ihrer synthetischen Zugänglichkeit werden Poly(N-substituiertes Glycin)s (d.h. Peptoide) als oligomere Vorläufer eingesetzt, aus denen die molekularen Leitern zusammengesetzt sind19. Peptoide sind strukturelle Isomete von Peptiden, in denen Anhängergruppen auf dem durch das Rückgrat übertragenen Stickstoff angebracht werden, anstatt mit dem Kohlenstoff20gekoppelt zu werden. Mit der Solid-Phasen-Synthese wird eine exakte Platzierung dynamischer kovalenter Pendelgruppen entlang der Peptoidkette problemlos erreicht, was die Konstruktion von Vorläufer-Oligomeren ermöglicht, die sich zu komplexen supramolekularen Strukturen zusammensetzen können21.
Die dynamische kovalente Neuanordnung der Imine-Konnektivität wird in diesem Verfahren eingesetzt, da die imine-erzeugende Kondensationsreaktion ein bequemes Mittel bietet, um die Selbstmontage durch Massenspektrometrie zu charakterisieren, da jede gebildete Bindung zu einer Massenreduktion von 18 g/mol22führt. Darüber hinaus kann das Gleichgewicht zwischen den Amin- und Aldehyd-Reaktanten und dem Iminprodukt durch Veränderung der Säurekonzentration variiert werden. Insbesondere werden Seltenerdmetalltriflate verwendet, um das Gleichgewicht zu beeinflussen und zusätzlich Ethylen-Acetal-geschützte Aldehyde23,24,25zu deprotecten. Zu beachten, dass Scandium triflate bereits häufig im Bereich der dynamischen kovalenten Selbstmontage verwendet wird, einschließlich seines jüngsten Erfolgs bei der Unterstützung der Synthese von kovalenten organischen Gerüsten (COFs) bei Raumtemperatur26,27. Zusätzlich ermöglicht die kontrastierende Löslichkeit der Oligo-(Peptoid-)Sequenzen und des Seltenerdmetalltriflates eine Gleichgewichtskontrolle durch Flüssigkeits-Flüssig-Extraktion. Der gemeldete Prozess nutzt diese Kontrolle, um die kinetischen Barrieren zu umgehen, die eine informationsgesteuerte Selbstmontage verhindern.
Die hierin enthaltene Technik beschreibt die dynamische kovalente Montage von informationstragenden Peptoidenoligomeren, bei der Informationen in der Reihenfolge ihrer Pendelgruppen kodiert werden. Die Verwendung eines Alloc-geschützten Aminmonomers in Verbindung mit einem Ethylen-Acetal-geschützten Aldehydmonomer ermöglicht einen orthogonalen Deprotection, der den Schutz von Alloc auf Perle und Acetal in situ während der Selbstmontagereaktion ermöglicht und somit sicherstellt, dass die synthetisierten Sequenzen nicht vor der Oligomerreinigung und -charakterisierung vorzeitig reagieren. Wichtig ist, dass die Festphasensynthese mit einem photolabilen Harz durchgeführt wird, um die Oligomerspaltung aus der Perle unter UV- oder violetter Lichtbestrahlung zu ermöglichen, was einen vorzeitigen Deprotection der säurelabilen, ethylenacetalbasierten Schutzgruppe ausschließt. Es könnten mehrere alternative Deschutzsysteme in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel haben wir zunächst zwei säure-labile Schutzgruppen (Boc-Amin und Ethylenacetalaldehyd) mit der Absicht eingesetzt, in situ deprotection durch eine starke Säure gefolgt von Neutralisation, um die Selbstmontagereaktion zu ermöglichen; dieser Ansatz führte jedoch zur sofortigen Entstehung von Niederschlag bei Addition der Basis. Alternativ wurde ein Schutz des Amins mit einer photolabilen Schutzgruppe, 2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), vorgesehen, da das Aldehyd bei der Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) vor der Reinigung selektiv degeschützt werden konnte. Leider bot die In-situ-Photolyse der Schutzgruppe mit UV-Licht keinen quantitativen Deschutz, auch nicht in Gegenwart von Photosensitoren und nach längeren Bestrahlungsperioden25. Trimethylsilylethoxycarbonyl (d. h. Teoc) kann als Aminschutzgruppe eingesetzt werden und unterliegt bei der Behandlung mit Seltenerdmetalltriflates der Spaltung; Der quantitative Teoc-Deprotection erfordert jedoch wesentlich höhere Triflate-Belastungen aus Seltenerdmetall als die für den Thynastalabbau erforderlichen Belastungen. Für dieses Protokoll können Teoc-Amine verwendet werden, aber die Lewis-Säurekonzentration muss entsprechend angepasst werden, da sich der subquantitative Aminschutz für größere selbstzusammengesetzte Strukturen als problematisch erweisen könnte. Aliphatische funktionelle Gruppen wurden kurz in Betracht gezogen, aber der Deschutz aliphatischer Aldehyde erfordert harte Bedingungen, die Peptoidsequenzenabschneiden 32,33.
Die Einbindung von Neee und Nma als inerte Abstandsrückstände dient der Verbesserung der Oligomerlöslichkeit und ermöglicht eine einfache Massenmarkierung der Vorläufer-Oligomere, um eine fertige Identifizierung der erzeugten Arten durch Massenspektroskopie zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen Sequenzen mit abwechselnd englösendynamischen kovalenten und inerten Abstandsrückständen, bei denen benachbarte Backbone-Segmente entgegengesetzte Rotationszustände annehmen, ein lineares, drehfreies Oligomer34,35, Sequenzen mit abwechselnd dynamischen kovalenten und inerten Abstandsrückständen eine Struktur, in der reaktive Pendelgruppen in die gleiche Richtung ausgerichtet sind. Angesichts der Vielseitigkeit der Submonomermethode kann eine große und vielfältige Bibliothek von primären Aminen verwendet werden, um die Peptoidenoligomere weiter zu modifizieren, kann aber Anpassungen des Protokolls erfordern, um eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten.
Während Oligo(Peptoide) manuell in einem Glasreaktionsgefäß19synthetisiert werden können, verringert die Automatisierung des Prozesses die Zeit für jede Rückstandszugabe von mehreren Stunden auf eine halbe Stunde. Darüber hinaus verringert die Automatisierung die Menge an Monomer- und Waschlösungsmittelabfällen, besonders wünschenswert bei der Verwendung von primären Aminmonomeren, die nicht kommerziell erhältlich sind. Obwohl Die Alloc-Spaltung aus den geschützten Aminrückständen eine effiziente Reaktion ist, kann die Palladiumoxidation zu einem unvollständigen Deprotection führen. Daher wird vorgeschlagen, einen Teil des Harzes zu testen und das Ausmaß des Deschutzes mit ESI-MS zu charakterisieren. Bei Testspaltungen setzen 30 min unter 405 nm Bestrahlung ausreichend Peptoid für die Massenspektrometrie frei. Teilweiser Deschutz kann durch die Verwendung von anaeroben Bedingungen oder die Wiederholung der Deprotection-Reaktion eingeschränkt werden.
Während sich dieser Artikel auf Sc(OTf)3 als Multi-Rollen-Reagenz konzentriert, haben andere Seltenerdmetalltriflate, wie Ytterbium triflate, nachweislich erfolgreich die informationsgesteuerte Montage molekularer Leitern vermittelt. Bemerkenswert ist, dass Sc(OTf)3 die Lewis-Sauerste der Seltenerdmetalltriflates ist; Aufgrund der reduzierten katalytischen Fähigkeit anderer Seltenerdmetalltriflates24,36können daher größere Äquivalente erforderlich sein, um eine vollständige Ethylen-Acetal-Deprotection- und Strangdissoziation zu bewirken. Die Anzahl der benötigten Äquivalente kann mit der MALDI-Massenspektrometrie ermittelt werden, indem der Punkt beobachtet wird, an dem sich die Stränge vollständig trennen. Die Dissoziation ist im Selbstmontageprozess entscheidend und entspricht dem Schmelzen von Nukleinsäuresträngen bei erhöhter Temperatur. Die anschließende Extraktion des Katalysators ermöglicht die Bildung und Störung dynamischer kovalenter Paarungen, die die Montage sequenzspezifischer Duplexe antreiben. Dieses allmähliche Glühen der oligomeren Stränge umgeht das kinetische Fallen (das bei molekularen Leitern zu nicht registerfreien Arten führen kann oder fälschlicherweise Sequenzen paart), die durch andere Methoden erfahren werden.
Chloroform ist ein ausgezeichnetes Lösungsmittel, da die Phasentrennung im hier verwendeten Chloroform/Acetonitril/Wasserseesystem die partielle Extraktion von Lewis-Säure fördert, ohne dass selbst zusammengesetzte Strukturen ausgefällt werden37. Darüber hinaus ist Chloroform eines der wenigen Lösungsmittel, das die Iminbildung fördert und gleichzeitig die molekulare Leiterlöslichkeit aufrechterhält. Aufgrund der dynamischen Natur des Systems können oft Rückverfolgungsmengen von out-of-Registry und falsch gekoppelten Duplexen beobachtet werden. Obwohl dieses System durch geringe Schwankungen der Triflate-Konzentrationen von Seltenermetallen bei der Extraktion weitgehend unbeeinflusst bleibt, erzeugt eine unzureichende Katalysatorextraktion gelegentlich einen erheblichen Teil der unvollständigen Hybridisierung und unspezifischen Oligomerkupplungen. In diesem Fall ist es in der Regel vorzuziehen, zuerst mit weiteren 1,5 Äquivalenten des Katalysators wieder zu dissoziieren und dann ein zweites Mal zu extrahieren, anstatt sofort wieder zu extrahieren, da die vollständige Dissoziation einzelner Stränge für den Prozess von entscheidender Bedeutung ist. Um mehrere einzigartige informationscodierte molekulare Leitern gleichzeitig zusammenzubauen, kann es notwendig sein, die Konzentration der Seltenerdmetall-Triflate-Lagerlösung zu erhöhen, die zur Aufrechterhaltung von Äquivalenten und gesamtem Reaktionsvolumen verwendet wird.
Während diese Selbstbaugruppen in erster Linie durch Massenspektrometrie gekennzeichnet sind, sind andere Techniken wie Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) möglich. Zu den Einschränkungen gehören die erforderliche Materialmenge, die Erschwinglichkeit von Monomeren und das Signal-Rausch-Verhältnis. Techniken, die Lösungsmittel erfordern, wie z.B. 1 H NMR, können zusätzlich unter der Unlöslichkeit selbst zusammengesetzter Strukturen leiden. Darüber hinaus können Seltenerdmetall-Triflate-Konzentrationen nach der Extraktion mit Methoden wie ICP-MS oder 19F NMR mit einem internen Standard bestimmt werden.
Im Laufe der Fortschritte bei der Verbesserung der Kontrolle über makro- und supramolekulare Nanostrukturen und Materialien stellt sich die Herausforderung, regelmäßige, aber veränderbare Baugruppen zu entwerfen und herzustellen. Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll bietet einen Weg, solche Nanostrukturen durch sequenzselektive Baugruppen durch dynamische kovalente Wechselwirkungen zu erreichen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science, Basic Energy Sciences, unter dem Award #DESC0012479 unterstützt. S.C.L. unterstützt das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program und A.F.A. die Unterstützung der Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |