Methodenartikel

Erhöhung der Haltbarkeit dissoziierter neuronaler Zellkulturen unter Verwendung biologisch aktiver Korallenmatrix

DOI:

10.3791/60443

⸱

3. Juni 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die dissoziierte Hippocampus-Zellkultur ist ein zentrales experimentelles Werkzeug in den Neurowissenschaften. Das Überleben und die Funktion von Nervenzellen in Kultur werden aufgrund ihrer neuroprotektiven und neuromodulativen Rolle verbessert, wenn Korallenskelette als Matrizen verwendet werden. Daher zeigen Nervenzellen, die auf korallenartiger Matrix gezüchtet wurden, eine höhere Haltbarkeit und sind daher besser für die Kultivierung geeignet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kulturen dissoziierter neuronaler und glialer Zellen im Hippocampus sind ein wertvolles experimentelles Modell zur Untersuchung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Funktion, da sie eine hohe Zellisolierung und eine kontrollierte Umgebung bieten. Das Überleben von Hippocampuszellen in vitro ist jedoch gefährdet: Die meisten Zellen sterben in der ersten Woche der Kultivierung ab. Es ist daher von großer Bedeutung, Wege zu finden, um die Haltbarkeit von Nervenzellen in Kultur zu erhöhen.

Calciumcarbonat in Form von kristallinem Aragonit, der aus dem Skelett von Korallen gewonnen wird, kann als überlegene, aktive Matrix für neuronale Kulturen verwendet werden. Durch die Pflege, den Schutz und die Aktivierung von Gliazellen verbessert das Korallenskelett das Überleben und Wachstum dieser Zellen in vitro besser als andere Matrices.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung von Hippocampuszellen auf einer korallenartigen Matrix. Diese Matrix wird erzeugt, indem Körner von Korallenskeletten an Kulturschalen, Flaschen und Glasdeckgläsern befestigt werden. Die Körner tragen dazu bei, die Umgebung der Zellen zu verbessern, indem sie sie in eine feine dreidimensionale (3D) Umgebung einführen, in der sie wachsen und gewebeähnliche Strukturen bilden können. Die 3D-Umgebung, die durch das Korallenskelett eingeführt wird, kann durch Schleifen für die Zellen optimiert werden, was die Kontrolle über die Größe und Dichte der Körner (d. h. die Matrixrauheit) ermöglicht, eine Eigenschaft, die nachweislich die Aktivität der Gliazellen beeinflusst. Darüber hinaus erleichtert die Verwendung von Körnern die Beobachtung und Analyse der Kulturen, insbesondere bei der Lichtmikroskopie. Daher enthält das Protokoll Verfahren zur Erzeugung und Optimierung der korallenartigen Matrix als Werkzeug zur Verbesserung der Erhaltung und Funktionalität von Nervenzellen in vitro.

Einleitung

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Kulturen dissoziierter neuronaler Zellen, in diesem Fall Hippocampuszellen, sind ein wertvolles experimentelles Modell für die Untersuchung des neuronalen Wachstums und der neuronalen Funktion, da sie eine hohe Zellisolierung und -zugänglichkeit bieten 1,2,3. Diese Art von Kultur wird häufig in den Neurowissenschaften, in der Arzneimittelentwicklung und im Tissue Engineering verwendet, da eine große Menge an Informationen gesammelt werden kann, wie z. B. Wachstums- und Lebensfähigkeitsraten, Neurotoxizität, Neuritenwachstum und -vernetzung, synaptische Konnektivität und Plastizität, morphologische Modifikationen, Neuritenorganisation und -verdrahtung usw.1,4,5,6,7.

Trotz der Bedeutung der Kulturen werden die kultivierten Zellen in der Regel gezwungen, auf Glasdeckgläsern in einer zweidimensionalen Monoschicht zu wachsen. Diese strengen Umweltmodifikationen verringern die Überlebensfähigkeit von Nervenzellen im Laufe der Zeit erheblich, da Glasdeckgläser nicht nährende Substrate mit einer geringen Haftfestigkeit sind, die eine geringere Fähigkeit aufweisen, das Zellwachstum zu unterstützen 8,9,10,11.

Da kultivierte Nervenzellen gezwungen sind, unter schwierigen Bedingungen zu wachsen, wäre ein wesentlicher Ansatz, um ihr Überleben zu verbessern, ihre natürliche Umgebung so weit wie möglich zu imitieren12,13. Dies könnte durch die Verwendung von Biomaterialien erreicht werden, die als Matrizen fungieren und die extrazelluläre Matrix der Zellen nachahmen, so dass sie eine gewebeähnliche Struktur bilden und ihre Ernährung unterstützen können14.

Die Verwendung von Biomaterialien ist ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung von Zellkulturen, da sie als biokompatible Gerüste fungieren, mechanische Stabilität bieten und eine Vielzahl von Zelleigenschaften verbessern, darunter Adhäsion, Überleben, Proliferation, Migration, Morphogenese und Differenzierung15,16,17. Verschiedene Arten von Biomaterialien werden verwendet, um die Bedingungen der Zellen in vitro zu verbessern. Dazu gehören Biopolymere, also biologische Komponenten, die in der Regel Teil der extrazellulären Matrix der Zellen sind. Diese Biomaterialien werden meist als Form von polymerisierten Beschichtungsmitteln oder Hydrogelen verwendet18,19,20. Einerseits bieten die oben genannten Matrizen den Zellen eine vertraute 3D-Umgebung, in der sie wachsen können, fördern ihre Adhäsion an der Schale und geben ihnen mechanische Unterstützung21,22. Andererseits stört ihre polymerisierte Form und der Einschluss der Zellen in Hydrogele den Zugang der Zellen zu den in den Wachstumsmedien vorhandenen nährenden Bestandteilen und erschwert auch die Nachverfolgung der Zellen durch mikroskopische Methoden23.

Korallen-Exoskelette sind biologische, aus dem Meer stammende Matrices. Sie bestehen aus Kalziumkarbonat, sind mechanisch stabil und biologisch abbaubar. Frühere Studien, in denen das Korallenskelett als Matrix für das Wachstum von Nervenzellen in Kultur verwendet wurde, haben im Vergleich zu Glasdeckgläsern eine viel größere Haftung gezeigt24,25. Darüber hinaus zeigten Nervenzellen, die auf dem Korallenskelett gezüchtet wurden, ihre Fähigkeit, das Kalzium aufzunehmen, aus dem das Skelett besteht, was die Nervenzellen unter Bedingungen des Nährstoffmangels schützt26. Darüber hinaus ist das Korallenskelett eine unterstützende und nährende Matrix, die das Überleben von Nervenzellen erhöht, die Bildung neuronaler Netzwerke fördert, die Rate der synaptischen Konnektivität erhöht und die Bildung gewebeähnlicher Strukturen ermöglicht27,28. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Oberflächentopographie der Korallenskelettmatrix eine entscheidende Rolle bei der Verteilung und Aktivierung von Gliazellen spielt 8,29. Das Korallenskelett eignet sich auch als Matrix für die Kultivierung anderer Zelltypen wie Osteozyten30, 31, Hepatozyten und Kardiomyozyten in Kultur (unveröffentlichte Daten).

Daher ist das Korallenskelett eine vielversprechende Matrix für die Kultivierung von Zellen in vitro. Daher beschreibt das unten beschriebene Protokoll die Technik der Kultivierung von Nervenzellen auf Korallenskeletten, um stabilere und erfolgreichere neuronale Kulturen zu erzeugen, als dies mit bestehenden Methoden erreicht wird. Dieses Protokoll kann auch für die Kultivierung von Kardiomyozyten, Hepatozyten und anderen Zelltypen nützlich sein.

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Protokoll

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Die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde vom National Animal Care and Use Committee genehmigt.

HINWEIS: Korallenskelette mit Kalziumkarbonat sollten in der kristallinen Form von Aragonit verwendet werden. Die Korallenarten, die bisher für neuronale Kulturen getestet wurden , sind Porites Lutea, Stylophora Pistillata und Trachyphyllia Geoffroyi. Die Skelette können ganz oder gemahlen gekauft werden.

1. Reinigung der Korallenskelettteile

VORSICHT: Die folgenden Schritte sollten in einer Chemikalienhaube bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da die unten beschriebenen Lösungen gefährlich sind und Verbrennungen und Reizungen verursachen können.

  1. Brechen Sie das Korallenskelett mit einem Hammer auf und teilen Sie es in 0,5–2 cm große Fragmente. Um organische und anorganische Rückstände aufzulösen, weichen Sie die Korallenskelettfragmente 10 Minuten lang in 10%iger Natriumhypochloritlösung ein und waschen Sie sie dann einmal mit doppelt destilliertem Wasser (DDW).
  2. Um die verbleibenden organischen Rückstände zu entfernen, weichen Sie die Fragmente 5 Minuten lang in einer 1M NaOH-Lösung ein und waschen Sie sie dann einmal mit DDW. Fahren Sie mit der Entfernung der organischen Ablagerungen fort, indem Sie die Fragmente 10 Minuten lang in 30%igerH2O2-Lösungeinweichen und die Fragmente dann 3x mit DDW waschen.
  3. Entfernen Sie so viel überschüssiges DDW wie möglich und lassen Sie die Korallenfragmente in der Haube trocknen (1–8 h).

2. Reinigung der Glasdeckgläser

  1. Übertragen Sie die Glasdeckgläser in eine 100 mm Glas-Petrischale. Fügen Sie 10 ml 95%iges Ethanol für 15 Minuten hinzu.
  2. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie es 3x mit DDW, wobei Sie zwischen jedem Waschgang 10 Minuten warten. Stellen Sie die Form auf eine 80 °C vorgewärmte Heizplatte, bis die DDW verdunstet ist. Rühren Sie die Deckgläser während des Trocknens mehrmals vorsichtig um, damit sie nicht aneinander kleben.
  3. Autoklavieren Sie die Deckgläser.

3. Aufbereitung von Korallenskelettkörnern

  1. Mahlen Sie die Korallenskelettfragmente mit einem Mörser und Stößel (manuelles Mahlen), bis sie vollständig zerfallen. Das Ergebnis ist eine Mischung von Körnern mit Größen von 20 μm bis 200 μm.
  2. Alternativ schleifen Sie die Korallenskelettfragmente mit einer elektrischen Schleifmaschine bei einer Geschwindigkeit von 1.000 U/min für 30 s (Klingenlänge = 6 cm; Breite = 0,5 cm–1,0 cm). Die resultierende Korngröße ähnelt dem Größenbereich, der durch die manuelle Vermahlung entsteht.

4. Reinigung von Körnern eines bestimmten Größenbereichs

Anmerkungen: Wenn die Größe der Körner in einer Matrix kontrolliert werden soll, verwenden Sie das folgende filtrationsbasierte Getreidereinigungsverfahren.

  1. Übertragen Sie die Körner auf ein manuelles oder elektrisches 40-μm-Filtersieb.
  2. Teilen Sie die Körner in zwei spezifische Bereiche ein, indem Sie die Körner durch das Sieb sieben (bei Verwendung eines elektrischen Siebs werden die folgenden Bedingungen empfohlen: Schütteln = 600 Amplituden/min, Hüpfen = 6/s). Bei diesem Verfahren werden zwei Gruppen von Korngrößen erzeugt, eine <40 μm und die zweite >40 μm.
    Anmerkungen: Die beiden Größen können mithilfe von Sieben mit unterschiedlichen Maschen bestimmt werden. Wenn ein eingeschränkterer Bereich gewünscht wird, sieben Sie jede Gruppe aus Schritt 4.2 durch Siebe mit unterschiedlichen Maschen erneut.
  3. Autoklavieren Sie die Körner.

5. Zubereitung von mit Korallenkörnern überzogenen Schalen oder Deckgläsern

  1. Zum Beschichten von Kolben, Platten oder Petrischalen
    Anmerkungen: Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
    1. Geben Sie die Korallenskelettkörner in eine 20 μg/ml Poly-D-Lysin (PDL)-Lösung, die in Hanks' Lösung gelöst ist. Die empfohlene Konzentration beträgt 5 mg/10 mg Getreide pro 1 ml PDL-Lösung.
    2. Die Lösung wird in Kolben und Schalen (ca. 2 ml/25cm2) gefüllt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Körner sinken ab und bleiben am Boden haften.
    3. Waschen Sie am nächsten Tag die Flaschen und das Geschirr einmal mit sterilem DDW. Lassen Sie die Flaschen und das Geschirr in der Haube trocknen.
      Anmerkungen: Es ist vorzuziehen, frisch beschichtete Flaschen und Schalen zu verwenden. Die beschichteten Kolben und Schalen können bis zu einer Woche nach dem Beschichten verwendet werden, wenn sie bei 4 °C aufbewahrt werden. Die Wirksamkeit der Matrix kann jedoch beeinträchtigt werden.
  2. Beschichtung von Glasdeckgläsern (12 mm Durchmesser, 0,17 mm Dicke)
    1. Fügen Sie Korallenskelettkörner in jeder gewünschten Konzentration zu DDW hinzu. Die üblichen Dichten, die für Nervenzellen verwendet werden, sind 5 mg/ml und 10 mg/ml. Gießen Sie 40 μl der Getreidelösung auf die Mitte des Deckglases (Abbildung 4).
    2. Legen Sie die Deckgläser auf eine auf 80 °C vorgewärmte Heizplatte und warten Sie, bis sie vollständig verdunstet sind (in der Regel 15 min). Unter diesen Bedingungen haften die Körner am Deckglas. Autoklavieren Sie die beschichteten Deckgläser. Unter sterilen Bedingungen lagern.
    3. Legen Sie die Deckgläser einen Tag vor der Kultur auf den Deckel einer sterilen 24-Well-Platte. Geben Sie 100 μl 20 μg/ml PDL-Lösung zu jedem Deckglas. Verwenden Sie die Spitze, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit den gesamten Kornbereich und den Rest der Deckglasoberfläche bedeckt.
    4. Decken Sie den Deckel mit dem Boden des Tellers ab. Wickeln Sie die Seiten der Teller mit Paraffinfolie ein. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    5. Am nächsten Tag einmal mit DDW waschen und in der Kapuze trocknen.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frisch beschichtete Deckgläser zu verwenden.

6. Kultivierung von dissoziierten Zellen des Hippocampus auf korallenskelettartigen, kornbeschichteten Glasdeckgläsern

ANMERKUNG: Das Verfahren zur dissoziierten Zellkultur im Hippocampus wurde gegenüber den zuvor veröffentlichten Verfahrenmodifiziert 24,27. Die Präparation der Kultur wird für vier Rattenwelpen beschrieben. Die erwartete Ausbeute jedes Hippocampus beträgt 1–1,5 x 106 Zellen.

  1. Einrichtung
    1. Bereiten Sie eine leere 60-mm-Petrischale vor. Gießen Sie 2 ml minimales essentielles Medium (MEM) in eine 60-mm-Petrischale und legen Sie es auf Eis.
    2. Gießen Sie 2 ml MEM in eine 35-mm-Schale und geben Sie sie in einen Inkubator bei 37 °C, 5–10 % CO2. Gießen Sie 2 ml MEM in ein 15-ml-Röhrchen und halten Sie es bei 4 °C.
    3. Gießen Sie 1 ml First Day Medium in ein 15-ml-Röhrchen und geben Sie es in einen Inkubator bei 37 °C, 5-10% CO2.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des Ersttagsmediums ist in der Materialtabelle beschrieben.
    4. 200 μl einer 2,5%igen Trypsinlösung auftauen und bei 37 °C inkubieren.
    5. Bereiten Sie drei Pasteurpipetten aus Glas mit Köpfen mit einem Durchmesser von 0,5 mm, 0,75 mm und 1,0 mm mit einer Flamme vor.
    6. Bereiten Sie geeignete chirurgische Werkzeuge vor: eine große Schere, zwei kleine Scheren, eine große Pinzette, vier kleine Pinzetten und ein Skalpell.
    7. Bereiten Sie ein Stereomikroskop in der Haube vor.
  2. Opfern Sie 0–3 Tage alte Sprague-Dawley-Rattenwelpen mit einer großen Schere, indem Sie ihre Köpfe von ihrem Körper in eine leere 60-mm-Petrischale trennen (Schritt 6.1.1). Entsorgen Sie die Leichen.
  3. Heben Sie den Kopf auf, indem Sie ihn mit einer großen Pinzette vom Mund halten. Schneiden Sie die Haut, die den Schädel bedeckt, mit einer kleinen Schere ab.
  4. Gehen Sie mit einer sauberen Schere unter den Schädel (seitlich des Kleinhirns) und schneiden Sie den Schädel rechts und links ab, um ihn entfernen zu können. Ziehe den Schädel mit einer kleinen Pinzette vom Gehirn ab.
  5. Trennen Sie das Gehirn mit einer sauberen Pinzette vom Kopf und geben Sie es in eine 60-mm-Petrischale mit 2 ml kaltem MEM (siehe Schritt 6.1.2).
  6. Sezieren Sie das Nilpferd mit zwei kleinen Pinzetten unter einem Stereomikroskop. Übertragen Sie die Hippocampus in die vorbereitete 35-mm-Schale (aus Schritt 6.1.2), die MEM enthält.
    Anmerkungen: Die Schritte 6.3–6.6 sollten für jeden Welpen wiederholt werden.
  7. Schneiden Sie das Nilpferd mit dem Skalpell in ca. 1 mm dicke Scheiben. 200 μl der Trypsinlösung (verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,25 %) zugeben. Schonend mischen und bei 37 °C, 5–10 % CO2 30 min inkubieren.
  8. Nach der Inkubation werden 2 ml kaltes MEM (Schritt 6.1.2) in die Schale gegeben, um das Trypsin zu deaktivieren. Übertragen Sie das trypsinisierte Gewebe mit der Pasteurpipette aus Glas mit dem größten Durchmesser (Schritt 6.1.5) in ein 15-ml-Röhrchen mit 1 ml First Day Medium, das auf 37 °C vorgewärmt ist (Schritt 6.1.3).
    HINWEIS: Das beste Verhältnis von Medium zu Gewebe (v:v) für die weitere Verarbeitung des Gewebes beträgt 1 ml/8 Hippocampus. Vermeiden Sie es so weit wie möglich, das Medium mit dem Gewebe zu übertragen.
  9. Reiben Sie das Gewebe, indem Sie es 10–15 Mal durch die Glaspipette mit dem größten Durchmesser führen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann mit der Glaspipette mit mittlerem Durchmesser. Setzen Sie das Verreiben mit der Pipette mit dem kleinsten Durchmesser fort. Vermeiden Sie Blasenbildung, um den Zelltod zu reduzieren.
  10. Lassen Sie die restlichen Gewebestücke 2–5 Minuten einsinken und überführen Sie dann den Überstand in ein weiteres 15-ml-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    HINWEIS: Die bevorzugte Zelldichte beträgt 200.000–400.000 Zellen/ml. Verwenden Sie First Day Medium zum Verdünnen oder Zentrifugieren bei 470 x g , um die Zellen zu konzentrieren.
  11. Säen Sie 100 μl Zellen auf jedes Glasdeckglas. Achten Sie bei der Aussaat darauf, das gesamte Deckglas mit Zellen zu bedecken. Inkubation bei 37 °C, 5–10 % CO2.
  12. Geben Sie am nächsten Tag 500 μl Neuronales Wachstumsmedium in die Vertiefungen.
    HINWEIS: Die Zusammensetzung des neuronalen Wachstumsmediums ist in der Materialtabelle beschrieben.
  13. Legen Sie jedes Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette in die entsprechende Vertiefung, während Sie das First Day Medium durch Kippen des Deckglases entfernen. Saugen Sie das restliche Medium aus dem Deckel.
  14. Inkubation bei 37 °C, 5–10 % CO2. Vermeiden Sie es, das Medium während der Inkubation auszutauschen. Kulturen können unter diesen Bedingungen bis zu 1 Monat gepflegt werden. Die größte Sorge ist die Feuchtigkeit. Achten Sie daher darauf, den Inkubator maximal befeuchtet zu halten.

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Ergebnisse

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Zur Herstellung der Korallenskelettmatrix wurde das gesamte Korallenskelett (Abbildung 1A) mit einem Hammer in 0,5–2 cm große Fragmente zerbrochen (Abbildung 1B) und in drei Schritten (Schritt 1 im Protokoll) mit 10%iger Hypochloritlösung, 1M NaOH-Lösung und 30%igerH2O2-Lösung(Abbildung 1C) gründlich von organischen Rückständen gereinigt. Korallenfragmente wurden gut gereinigt, wenn die Skelettfarbe von braun (...

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Diskussion

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Die hier vorgestellte Technik beschreibt einen Weg, um den Erhalt und die Funktionalität von Nervenzellen in Kultur zu verbessern. Dies wird erreicht, indem die Zellen an eine Matrix aus Korallenskelettkörnern geklebt werden, die die Zellen nährt und ihr Wachstum und ihre Aktivität fördert. Die Verwendung dieser Technik erhöht die Fähigkeit des neuronalen Kulturmodells, die Umgebung der Zellen im Gehirn nachzuahmen.

Die Einführung der Matrix als Kultursubstrat hat mehrere Vorteile gegenüber an...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das KAMIN-Programm des israelischen Handels- und Arbeitsministeriums und durch Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, USA, finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-PlattenGreiner#60-662160
B-27Gibco#17504-044
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma#A4503
; GlukoseSigma#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)Sigma#D5796
Elektrisches SiebAri Levy#3700
Fötaler Rinderserun (FBS)Biologische Industrie#04-007-1A
Mittlerer Ersttag Mittel85,1% Minimum Essential Eagle' s Medium (MEM), 11,5 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 1,2 % L-Glutamin und 2,2 % D-Glucose.
TrinkflaschenGreiner#60-69016025cm^2, Gewebekultur behandelt
Fluordesoxy-UridinSigma#F0503
GlasdeckgläserMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2O2Romical#007130-72-19
Gefährlicher Schinken F-12 NährstoffmischungSigma#N4888
HANK'S LösungSigma#H6648
KynurensäureSigma#K3375
L - GlutaminSigma#G7513
Manuelles Sieb (40&Mikro; m)VWR#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)Sigma#M2279
Mörser und StößelDe-Groot4-P090
NaClO (Natriumhypochlorit)Sigma#425044Gefährliches
NaOHSigma#S8045Gefährliches
neuronales Wachstumsmedium45 % MEM, 40 % Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM), 10 % Nährstoffmischung F-12 Schinken, 0,25 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,75 % D-Glukose, 0,25 % L-Glutamin, 0,5 % B-27-Ergänzung, 0,1 % Kynurensäure, 0,01 % 70 % Uridin und 30 % Fluordesoxyuridin.
PetrischaleGreiner#60-628160, #60-62716060mm, 35mm, jeweils.
Poly D – LysinSigma#P7280
Smart Dentin GrinderKometaBio#GR101
TrypsinGibco#15-090-046
UridinSigma#U3750
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Referenzen

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