Methodenartikel

Chemisch-induzierte Hautkarzinogenese Modell mit Dimethylbenz[a]Anthracen und 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetat (DMBA-TPA)

DOI:

10.3791/60445

⸱

19. Dezember 2019

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die zweistufige Hautkarzinogenese wird durch zwei topisch aufgetragene Chemikalien induziert. Ein Mutagen7,12-Dimethylbenz[a]anthracen) verursacht Mutationen in den epidermalen Zellen und eine kontinuierliche Anwendung des allgemeinen Wachstumsstimulators 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-Acetat beschleunigt die Bildung von Hautpapilloma.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krebs ist eine der verheerendsten menschlichen Krankheiten. Experimentelle Krebsmodelle sind wichtig, um Einblicke in das komplexe Zusammenspiel verschiedener Zelltypen und Gene bei der Förderung der Tumorprogression zu gewinnen und eine Plattform zu bieten, um die Wirksamkeit verschiedener therapeutischer Ansätze zu testen. Eines der am häufigsten verwendeten experimentellen entzündlichen Krebsmodelle ist das zweistufige Modell der zweistufigen Hautkarzinogenese DMBA-TPA. Die Tumorbildung wird in diesem Modell durch die topische Anwendung von zwei verschiedenen Chemikalien induziert, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) und 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA), die zusammen eine Papillomabildung in der Haut verursachen. Da das primäre Ergebnis die Papillomabildung in der Haut ist, ist das Modell eine ideale, zuverlässige und reproduzierbare Möglichkeit, sowohl die Tumorinitiierung (tumorfreies Überleben) als auch die Tumorprogression (Anzahl und Größe der sichtbaren Tumoren) anzugehen. Die Wirkung der DMBA-TPA-Behandlung wird über einen Entzündungsmechanismus übertragen, wodurch sich dieses Modell besonders für die Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Tumorbildung eignet. Dieses Modell ist jedoch auf die Haut und andere Oberflächen beschränkt, auf denen die Chemikalien aufgetragen werden können. In diesem Artikel finden Sie ein detailliertes Protokoll, um das Modell erfolgreich zu verwenden.

Einleitung

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Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen in der Welt. Daher besteht die Forderung, zuverlässige experimentelle Krankheitsmodelle zu entwickeln, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu erhalten und mögliche therapeutische Ansätze zu erforschen. Eines der am häufigsten verwendeten experimentellen In-vivo-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung von Hautkrebs ist das chemisch induzierte zweistufige Hautkarzinogenesemodell1,2. Das Modell bietet ein Werkzeug, um Tumorinitiierung, Förderung und Progression zusätzlich zu bestimmten Ereignissen wie Immunzellinfiltration und Angiogenese zu untersuchen.

Um das zweistufige Hautkarzinogenesemodell zu verwenden, wird die Rückenhaut von Mäusen mit zwei verschiedenen Chemikalien behandelt, die zusammen eine Tumorbildung induzieren. Das Modell wird mit einer niedrigen Dosis der Mutagene, DMBA, gefolgt von einer längeren Exposition gegenüber dem Tumorpromotor, TPA3 (Abbildung 1) initiiert. DMBA mutiert DNA nach dem Zufallsprinzip, indem sie kovalente Addukte mit der DNA von epidermalen Zellen und primären Keratinozytenstammzellen4,5,6,7bildet. Einige dieser zufälligen Mutationen finden in einem Proto-Onkogen statt, wie Hras1 (Mutationen in Kras und Nras werden ebenfalls nachgewiesen) und die Umwandlung von Proto-Onkogenen in Onkogene treibt die Tumorbildung unter richtigen Reizen an. TPA wiederum ist das am häufigsten verwendete tumorwachstumsfördernde Mittel. Sein molekulares Ziel ist die Proteinkinase C (PKC)8. TPA aktiviert auch die Wnt/-Catenin-Signalisierung, die für die Tumorbildung im Modell9entscheidend ist. Wiederholte und längere Exposition gegenüber dem fördernden Mittel führt zu einer verbesserten Zellsignalisierung, erhöhter Produktion von Wachstumsfaktoren und einer lokalen Entzündungsreaktion, die aufgrund einer erhöhten DNA-Synthese und entzündlicher Zellinfiltration in der behandelten Haut offensichtlich sind.

Die wichtigsten Entzündungsmediatoren im DMBA-TPA-Modell wurden identifiziert10. Interleukin-17A (IL-17A) ist im DMBA-TPA Modell11,12als besonders tumorigen bekannt. Es arbeitet in Synergie mit Interleukin 6 (IL-6) und nimmt an Makrophagen und Neutrophilrekrutierung13,14. Darüber hinaus haben sich im DMBA-TPA-Modell gezeigt, dass CD4+ T-Zellen und Neutrophile tumoriogen sind. Schließlich können Makrophagen auch die Tumorgenese im Modell15,16,17fördern.

Während der Promotionsphase wird die Zellproliferation der mutierten Zellen verbessert und eine anhaltende Hyperplasie der Epidermis beibehalten1. Dies führt zu einer Papilloma-Entwicklung in der Haut in 10-20 Wochen, nach dem die Papillome beginnen, in bösartige Tumoren, Plattenepithelkarzinome (SCCs)2umzuwandeln. Allerdings kommen weniger als 10% der Papillome zu maligner Art, obwohl dieser Prozentsatz auch vom genetischen Hintergrund der Mäuse abhängt2,18. Jahrzehntelang war nicht bekannt, welche Art von Zellen zunächst in den Tumoren mutiert wurden, was zu Malignität führte, obwohl einige Studien deutlich ausgeprägte Merkmale in den bösartigen Tumoren im Vergleich zu gutartigen Papillomen19,20berichtet hatten. Neuere Studien haben jedoch unser Verständnis über den klonalen Ursprung der Tumorbildung im DMBA-TPA-Modell21starkverbessert. 22. 23. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl knochenmarkabgeleitete Epithelzellen als auch Haarfollikelstammzellen zur Tumorbildung beitragen22. Stufenspezifische Linienverfolgungsstudien haben enthüllt, dass gutartige Papillome monoklonalen Ursprungs sind, aber sie rekrutieren neue Epithelzellpopulationen21,23. Allerdings fungiert nur einer der Zellklone als Fahrer für die Karzinogenese; es enthält eine Hras-Mutation23. Der Verlauf der Karzinombildung ist mit einem klonalen Sweepverbunden 23.

Das karzinogene DMBA initiiert die Papillomabildung und TPA fördert das Tumorwachstum. Daher kann die Tumorinitiation getrennt von der Förderung untersucht werden, indem das Experiment vor der TPA-Behandlungsphase unterbrochen wird. Da die Tumorprogression wöchentlich untersucht wird, bietet es eine große Chance für eine detaillierte Tumorwachstumsanalyse während der gesamten Studie. Da die Tumoren durch externe Chemikalien erzeugt werden, ist eine onkogene Mutation in der Keimbahn unnötig. Daher ist die Untersuchung der Auswirkungen eines genetischen Hintergrunds (z.B. Knockout/Transgen vs. Wildtyp) auf die Tumorgenese einfach2. Zusammenfassend ist das DMBA/TPA-Hautkrebsmodell ein besonders nützlicher Ansatz zur Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Tumorprogression sowie zur Bewertung von Tumorinitiations- und Förderschritten unabhängig oder voneinander abhängig.

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Abbildung 1: DMBA-TPA-induzierte Hautkarzinogenese Modell umriss. Das karzinogene DMBA wird topisch angewendet, um DNA-Mutationen in der Initiationsphase des Modells zu induzieren. Das wachstumsfördernde Mittel TPA wird 2x pro Woche verabreicht, um die Zellproliferation während der Promotionsphase zu verbessern, was zur Entwicklung von Papillomen in der Haut führt. Tiere werden geopfert, nachdem die Papilloma-Reaktion ein Plateau erreicht hat, in der Regel innerhalb von Wochen 15–20, abhängig vom genetischen Hintergrund der Mäuse. Ein kleiner Teil der Papillome kann sich innerhalb von 20 bis 50 Wochen zu SCCs weiterentwickeln. Um frühe Ereignisse in der Initiations- und Frühförderungsphase zu untersuchen, können Proben entnommen werden (z. B. kurz nach der zweiten TPA-Anwendung). Ein repräsentatives Foto und Hämatoxylin und Eosin gebeizten Querschnitt von Papillomen auf einer C57BL/6 Maushaut nach 19 Wochen Behandlung werden gezeigt. Maßstabsleiste = 0,1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

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Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Finnischen Tierschutzkommission (Protokollnummer ESAVI/23659/2018) genehmigt.

1. Versuchstiere, Reagenzien und Ausrüstung

  1. Verwenden Sie Alter und geschlechtsspezifische Mäuse. Beginnen Sie die Studie im Alter von 7-9 Wochen, da die Haut bei den meisten Mäusen in Telogen (der Ruhephase) um dieses Alter2ist.
  2. Beobachten Sie das Verhalten der Tiere während des Studiums und wenn sie kämpfen, was oft bei Männchen geschieht, beherbergen sie getrennt. Kämpfe können Schnitte in der Haut verursachen, die die Tumorbildung fördern. Weibliche Mäuse werden aufgrund ihres weniger aggressiven Verhaltens bevorzugt. Die typische Versuchsgruppengröße variiert zwischen 8–20 Tieren pro Gruppe24,25,26,27.
    ANMERKUNG: Leistungsberechnungen auf der Grundlage der biologischen Varianz, die in früheren Studien beobachtet wurde, helfen, eine ausreichend große Gruppengröße zu wählen. Die Stämme, die in diesem Artikel als Beispiele verwendet werden, sind Balb/c und C57BL/6. Allerdings wurden viele andere Mausstämme wie SENCAR und FVB mit dem DMBA-TPA-Modell sowie Wistar und Sprague-Dawley Ratten2,28,29verwendet. Vor Beginn der Studie ist eine Genehmigung des nationalen oder lokalen Ausschusses für Tierarbeit erforderlich. Neben allgemeinen Wohlfahrtserwägungen sind die modellspezifischen Endpunkte typischerweise Plattenepithelkarzinom (SCC) und eine Infektion der Haut. Kratzer in der Haut durch Juckreiz nach anwendung der tumorigenchemischen Chemikalien in Aceton ist typisch, aber ansonsten sollten die Tiere keine Anzeichen von Beschwerden zeigen. Regelmäßiges Wiegen (z.B. 2x pro Monat) hilft, das Wohlergehen der Tiere zu bewerten.
  3. Verwenden Sie die DMBA und TPA, beide in Aceton verdünnt. Die Arbeitskonzentration von DMBA beträgt 250 g/L. Eine Dosis für ein Tier beträgt 50 g DMBA in 200 l Aceton. Die Lagerkonzentration von TPA beträgt 125 g/L und die Behandlungskonzentration 25 g/l. Eine TPA-Dosis für ein Tier beträgt 5 g in 200 l Aceton.
    VORSICHT: DMBA ist schädlich, wenn es geschluckt wird und Kann Krebs verursachen. Aceton verdunstet schnell und ist entzündlich. Es kann Schwindel verursachen und die Augen reizen. Verwenden Sie eine Atemmaske und/oder arbeiten Sie unter einem Vakuumstrom. Wechseln Sie die Handschuhe nach dem Umgang mit einer dieser Chemikalien. Individuell belüftete Käfige verhindern die Ausbreitung der Chemikalien während der Unterbringung der Mäuse. Nach dem Auftragen die Pipettenspitzen für den Umgang mit dem DMBA sammeln und als gefährlichen Abfall entsorgen.
    HINWEIS:Der DMBA muss vor Licht geschützt sein. Das verdünnte TPA wird in -20 °C gelagert, vorzugsweise lichtgeschützt.
  4. Beschaffen Sie sich folgendes Gerät: eine Waage, ein gewöhnlicher Rasierer für das Fell, Pipetten und Spitzen einer entsprechenden Größe, ein gewöhnliches Lineal, eine Digitalkamera, einen Notizblock und einen Stift oder einen Computer zur Aufnahme der Papillome, ein inhaliertes Anästhesiesystem oder ein Maus-Restrainer mit einer Öffnung auf der Rückseite und einem Kohlendioxid-Narkosesystem zum Opfern von Mäusen.

2. Haut Papilloma Induktion und Förderung

  1. Rasieren Sie die Rückenhaut und wiegen Sie das Tier. Später rasieren Sie die Haut, wann immer nötig, aber nicht zum Zeitpunkt der chemischen Exposition.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie sich um die Papillome rasieren und vermeiden Sie Schnitte auf der Haut. Wiegen Sie jedes Tier alle 2 Wochen, um mögliche Gewichtsverlust zu bemerken.
  2. Mit einer Pipette 48 h nach dem Rasieren des Fells 50 g DMBA in 200 l Aceton topisch auf die rasierte Fläche auftragen. Halten Sie das Tier bei Bedarf mit einer leichten Inhalationsanästhesie oder einem Maus-Restrainer zurück.
  3. Geben Sie nach 7 Tagen die erste TPA-Dosis. Tragen Sie 5 g TPA in 200 l Aceton topisch mit einer Pipette 2x pro Woche auf, vorzugsweise Montag und Donnerstag oder Dienstag und Freitag.
  4. Zählen, aufzeichnen und fotografieren Sie die Papillome jede Woche. Eine fühlbare Masse von mehr als 1 mm Durchmesser gilt als Papilloma, wenn sie länger als 1 Woche bleibt. Markieren Sie jedes einzelne Papilloma auf einer Karte und listen Sie seine Größe jede Woche auf. Speichern Sie digitale Fotos.

3. Tieropfer und Probensammlung

  1. Setzen Sie die Behandlung fort, bis die Tumorreaktion ein Plateau erreicht. Im Allgemeinen wird erwartet, dass die Papillomabelastung 10 bis 20 Wochen nach der Initiation zunimmt, abhängig von der verwendeten Mausdehnung. Das Plateau wird in 15 bis 20 Wochen erwartet. Ein kleiner Teil der Papillome (unter 3%) kann sich innerhalb von 20–50 Wochen zu SCCs entwickeln2.
  2. Opfern Sie die Tiere 24 h nach der letzten TPA-Anwendung. Verwenden Sie Kohlendioxid-Narkose mit Zervixdislokation oder einer anderen geeigneten Methode.
  3. Je nach Forschungsfrage, sammeln Sie geeignetes Probenmaterial von den Tieren30,31.
    1. Nehmen Sie beispielsweise Blutproben vor dem Opfern und trennen Sie das Plasma.
    2. Schneiden Sie Hautstücke für die Immunhistochemie (IHC) Färbung (z. B. Hämatoxylin und Eosin, vermehrende oder entzündliche Zellen).
    3. Verwenden Sie Biopsie-Punchs, um Hautstücke mit Papillomagewebe oder Nicht-Papilloma (behandelte) Haut für die Genexpression (z. B. qPCR) und/oder Proteinanalysen (z. B. Western Blot oder ELISA) zu sammeln.
    4. Sammeln Sie ein Stück der Milz und hautabtropfenden Lymphknoten für die Analyse der Durchflusszytometrie, wenn eine detailliertere Analyse der Immunzellpopulationen gewünscht wird. Sie können auch epidermale und dermale Schichten für weitere Analysen trennen.

4. Statistik

  1. Zeichnen Sie eine Kaplan-Meier-Überlebenskurve der papillomafreien Zeit und verwenden Sie den Mantel-Cox-Log-Rank-Test für das Überleben. Zeichnen Sie eine lineare Kurve der Anzahl der Papillome pro Woche. Da es sich um Zähldaten handelt, verwenden Sie ein nichtlineares Regressionsmodell. Wenden Sie sich bei Bedarf an einen Statistiker.

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Ergebnisse

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Das Hauptergebnis ist das Überleben (d.h. Papilloma frei) Zeit zwischen der Behandlung oder Genotyp-Gruppen. Das sekundäre Ergebnis ist die Anzahl der Papillome pro Woche in jeder Gruppe (Abbildung 2). Die erwarteten Ergebnisse sind ein statistisch signifikanter Unterschied in der Papilloma-Freizeit und in der Anzahl der Papillome zwischen den experimentellen (zwei oder mehr) Gruppen. Es wird empfohlen, die Anzahl der Papillome zu zählen und während der Promotion-Phase (TPA) eine Kurve zu ze...

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Diskussion

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DMBA-TPA-induzierter Hautkrebs ist eines der am häufigsten verwendeten Krebsmodelle, da er sehr reproduzierbar ist und Informationen über die Tumorprogression von der Initiation bis zur Malignität liefert. Die wichtigste Ergebnismaßnahme, die Papillomabildung, ist einfach und zuverlässig quantitativ. Das Modell befasst sich sowohl mit der Tumorinitiation (tumorfreies Überleben) als auch mit der Progression (Tumorzahlen und -größen) gleichzeitig. Das Modell eignet sich zur Untersuchung verschiedener Verbindungen, wie z. B...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands (Stipendien 25013080481 und 25013142041 (I.J.), 286377 und 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki und Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), Päivikki and Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finanzierung des Expertenverantwortungsbereichs des Universitätsklinikums Tampere (Zuschuss 9V049 und 9X044 (M.P.), 9X011 und 9V010 (T.J.)), The Competitive State Research Financing of the Expert Responsibility Area of Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), die Finnish Cultural Foundation (M.V.), die Paulo Foundation (T.P.), Die Cancer Society of Finland (M.P.) und die Emil Aaltonen Foundation (T.P.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1000 ul RPT XL Verlaufsfilterspitze (steril), NachfüllungStarlabS1182-1730-C
300 ul RTP Verlaufsfilterspitze (steril), NachfüllungStarlabS1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA)SigmaD3254-100MGGesundheitsschädlich beim Verschlucken und kann Krebs verursachen. Lichtgeschützt lagern.
AcetonSigma1000141011Verdunstet schnell und ist brennbar.
Attane vet 1000 mg/gPiramal Critical Care LimitedFlüssiges Isofluran zur Inhalation
Batteriebetriebener Clipper IsisAlbert Kerlb GmbHGT421Zum Rasieren des Fells
CONTRAfluran-RestgasfilterZeoSys GmbHFür die Anästhesie
Linex Nature N1030 Lineal 30 cmStaples Business Advantage60383Zum Messen von
PapillomenMedium CO2 Kammer 300 x 200 x 200mm - RotVetTech Solutions LtdAN045ARZum Opfer
MekasoftMekalasi23008Tischabdeckung
Mäuse (Balb/c JRj)Janvier LabsAndere Stämme auch möglich
Mäuse (C57BL/6JRj)Janvier LabsAndere Stämme auch möglich
Panasonic Lumix DMC-FS5 DigitalkameraPanasonic
ParaformaldehydMerck30525-89-4Für Histologieproben
Phorbol 12-Myristat-13-acetat aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)EnzoBML-PE160-0001
Präzisionswaage PLJ-C/PLJ-GKERN & SOHN GmbHPLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S GehäuseVetTech Solutions LtdAN044BXFür
Opfer-RNAlaterQiagen76104Für Nukleinsäureproben
Tacta-Pipette 100-1000 ulSartoriusLH-729070
Tacta-Pipette 20-200 ulSartoriusLH-729060
UNO Anaesthetic Key FillerScintica Instrumentation Inc.Für die Anästhesie
UNO Gesichtsmaske für MausScintica Instrumentation Inc.Für Anästhesie
UNO FM2200 DurchflussmesserScintica Instrumentation Inc.Für die Anästhesie
UNO Gas Exhaust UnitScintica Instrumentation Inc.Für die Anästhesie
UNO Induction BoxScintica Instrumentation Inc.Für die Anästhesie
UNO200VAP VaporizerScintica Instrumentation Inc.Für die Anästhesie

Referenzen

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