Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine robuste und detaillierte Methode der Mikrotubuli-Dynamikanalyse in Zellen vor, die in der Prometaphase mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokaler Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung synchronisiert werden.

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Modifikation einer etablierten Methode zur Bestimmung der Mikrotubuli-Dynamik in lebenden Zellen. Das Protokoll basiert auf der Expression eines genetisch kodierten Markers für die positiven Enden von Mikrotubuli (EB3 mit tdTomato fluoreszierendem Protein) und hochgeschwindigkeits-, hochauflösender Live-Zell-Bildgebung mittels konokaler Spinnenvon-Mikroskopie. Die Zellzyklussynchronisierung und die erhöhte Dichte von Mikrotubuli werden durch Hemmung der zentrosomalen Trennung in mitotischen Zellen erreicht, und die Analyse des Wachstums wird mit Open-Source-U-Track-Software durchgeführt. Die Verwendung eines hellen und rot verschiebbaren fluoreszierenden Proteins in Kombination mit der geringeren Laserleistung und der reduzierten Belichtungszeit, die für die Spinnendere benötigt wird, reduziert die Phototoxizität und die Wahrscheinlichkeit lichtinduzierter Artefakte. Dies ermöglicht die Abbildung einer größeren Anzahl von Zellen in der gleichen Zubereitung unter Beibehaltung der Zellen in einem Wachstumsmedium unter Standardkulturbedingungen. Da die Analyse in einer überwachten automatischen Weise durchgeführt wird, sind die Ergebnisse statistisch robust und reproduzierbar.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) sind hochdynamische Strukturen, die in praktisch allen eukaryotischen Zellen und in einigen Bakterien gefunden werden¹. Zusammen mit Aktin und Zwischenfilamenten formen sie das Zytoskelett^2,3. Zellteilung⁴, Molekültransport⁵, Flagellar schlagen⁶, das Gefühl der Umgebung durch primärecilium⁷, Hören (Kinocilium)^8,9, Embryogenese^10,11,

Protokoll

1. Aussaat von HeLa-Zellen

1. Bereiten Sie 2 ml mit 5 g/ml Fibronectin-Lösung in Phosphatgepufferter Saline (PBS) vor und fügen Sie 450 l davon in jeden Brunnen eines 4 gut gekammerten Deckellips (#1.5) ein. Inkubieren Sie den Schlitten 15 min bei 37 °C und 5%_CO2.
2. Asynchron wachsende HeLa-Zellen mit Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (DPBS) abspülen und mit Trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) 5 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch die Zugabe von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kalbsserum (FCS) bei 3:1 (v:v) Verhältnis von hinzugefügten Trypsin-EDTA.....

Ergebnisse

Nach dem in Abbildung 1Abeschriebenen Protokoll wurde das pEB3-tdTomato-Plasmid vorübergehend in asynchron wachsenden HeLa-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion bei Prometaphase durch DME-Behandlung synchronisiert (Abbildung 1B). Dieser Schritt sorgte dafür, dass die Messung der MT-Dynamik immer in der gleichen Phase des Zellzyklus durchgeführt wurde. Die Zeitrafferfilme wurden mit U-Track v2.2.0, wie in der Ergänzenden Dokumentation

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Modifikation einer Methode, die zuerst von Ertych et al.⁴⁴etabliert wurde. Zusammen mit einigen anderen Modifikationen kombinieren wir diese Technik der MT-Dynamikanalyse mit der konfokalen Bildgebung der Doppelspinnscheibe. Die Verwendung der Doppelspinnscheibe verbessert die Auflösung wachsender MTs und reduziert gleichzeitig die Phototoxizität³⁶. Wir reduzieren die Photobleaching- und Laserlichtschäden der Zellen weiter, indem wir zu einem fluor.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM ohne Phenolrot	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fötales Rinderserum	Biochrom	S0415
Fibronektin Rinderplasma	Merck	F4759	Steriles Pulver
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stabiles Glutamin-Substitutivum
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	Plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA-Lösung	Biochrom	L2143	0,05%/0,02 % ohne Calcium und Magnesium
&Mikro;- Objektträger	Ibidi	80426	4-Well-Objektträger mit #1,5 Deckglas
Eclipse Ti Inverses Mikroskop	Nikon	NA
Objektiv	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100xC Öl
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laserbox. 405, 458, 488, 514, 561 und 647 nm
Spinning Disk Modul	Andor	CSU-W
Kamera	Andor	iXon Ultra 888
Klimakammer	Okolab		Dunkle Kammer ausgestattet mit CO2Versorgung, Temperaturregelung und Luftbefeuchter
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk Mikroskop. Erfassungssoftware
MATLAB	Mathworks		Computing-Umgebung
Prism 8	GraphPad		Software für statistische Analysen und Anzeigen