Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Zusammenfassung

Die Proliferation von Cardiomyozyten nach einer Verletzung ist ein dynamischer Prozess, der eine Symphonie extrazellulärer Hinweise aus Nicht-Myozyten-Zellpopulationen erfordert. Mit Lineage-Tracing, passiven CLARITY und dreidimensionalen konfokalen Mikroskopie-Techniken mit ganzer Montage können wir den Einfluss einer Vielzahl von Zelltypen auf die Herzreparatur und -regeneration analysieren.

Zusammenfassung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen übertreffen alle anderen Todesursachen und sind für unglaubliche 31 % der Todesfälle weltweit verantwortlich. Diese Krankheit manifestiert sich bei Herzverletzungen, in erster Linie in Form eines akuten Myokardinfarkts. Mit wenig Resilienz nach Verletzungen wird das einst gesunde Herzgewebe durch faseriges, nicht kontraktiles Narbengewebe ersetzt und ist oft ein Vorspiel zu Herzinsuffizienz. Um neue Behandlungsmöglichkeiten in der regenerativen Medizin zu identifizieren, konzentrierte sich die Forschung auf Wirbeltiere mit angeborenen regenerativen Fähigkeiten. Ein solcher Modellorganismus ist die Neonatalmaus, die auf Herzverletzungen mit robuster Myokardregeneration reagiert. Um eine Verletzung bei der neonatalen Maus zu induzieren, die klinisch relevant ist, haben wir eine Operation entwickelt, um die linke vordere absteigende Arterie (LAD) zu verdecken, die einen Myokardinfarkt widerspiegelt, der durch Arteriosklerose im menschlichen Herzen ausgelöst wird. In Verbindung mit der Technologie, um Veränderungen sowohl innerhalb von Kardiomyozyten als auch innerhalb von Nicht-Myozytenpopulationen zu verfolgen, bietet uns dieses Modell eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die die Herzregeneration leiten. Einblicke in Veränderungen der Herzzellpopulationen nach Verletzungen stützten sich einst stark auf Methoden wie Gewebeschnitt und histologische Untersuchung, die sich auf zweidimensionale Analysen beschränken und dabei oft das Gewebe schädigen. Darüber hinaus ist es diesen Methoden nicht in der Lage, Veränderungen in Zelllinien nachzuverfolgen, anstatt lediglich eine Momentaufnahme der Verletzungsreaktion bereitzustellen. Hier beschreiben wir, wie technologisch fortschrittliche Methoden in Linienverfolgungsmodellen, ganzer Organreinigung und dreidimensionaler (3D) Vollmontagemikroskopie eingesetzt werden können, um Mechanismen der Herzreparatur aufzuklären. Mit unserem Protokoll für die Operation an Myokardinfarktoperationen der Neonatalen Maus, die Gewebereinigung und die 3D-Gesamteorganbildgebung können die komplexen Wege, die die Kardiomyozytenproliferation induzieren, entwirrt werden, was neue therapeutische Ziele für die Herzregeneration enthüllt.

Einleitung

Das Herz gilt seit langem als ein post-mitotisches Organ, aber neuere Beweise zeigen, dass Kardiomyozyten-Erneuerung tritt im erwachsenen menschlichen Herzen bei etwa 1% pro Jahr¹. Jedoch, Diese niedrigen Raten der Kardiomyozyten Umsatz sind nicht ausreichend, um den massiven Verlust von Gewebe, die nach Verletzungen auftritt wieder aufzufüllen. Ein Herz, das einen Myokardinfarkt erlitten hat, wird etwa eine Milliarde Kardiomyozyten verlieren, die oft als Vorspiel zu Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod dienen^2,3. Mit über 26 Millionen Menschen, die weltweit von Herzinsuffizienz bet....

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Guide for the Use and Care of Laboratory Animals und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee in der School of Medicine and Public Health der University of Wisconsin-Madison durchgeführt. Alle Methoden wurden auf Wildtyp C57BL/6J (B6) und transgenen Mauslinien von Jackson Laboratories durchgeführt.

1. Koronare Arterienokklusion (Myokardinfarkt) Induziert durch Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) in 1-Tage-alten Neonatalen Mäusen⁶

1. Trennen Sie die ein Tage alten neugeborenen Welpen von der Mutter, indem Sie si....

Ergebnisse

Oft führen die beiden anspruchsvollsten Schritte das Herz aus der Brusthöhle und ligan den LAD. Um diese Schritte zu beheben, können Anpassungen bei der Platzierung der anfänglichen Punktion zwischen den vierten interkostalen Muskeln vorgenommen werden; Wenn die Punktion und die stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen (Abbildung 1A).

Zusätzlich kann ein erhöhter Druck auf den linken B.......

Diskussion

Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Myozytenpopulationen sind ein entscheidender Faktor dafür, ob das Herz nach verletzungen fibrosis oder repariert wird. Es wurden Entdeckungen gemacht, die zeigen, dass eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Nerven¹⁴, Epikardialzellen²⁴, Peritonealmakrophagen²⁵, Arteriole^12,13und lymphatische Endothelzellen²⁶

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Thioglycerol
6-0 Prolene Nähte	Ethicon	8889H	Polypropylen Nähte
Acrylamid
Borsäure
Gebogene Pinzette	Excelta	16-050-146	Halb gebogen, gezahnt, 4 Zoll
Verbandzange	Fisherbrand	13-812-39	Präparieren, 4,5-Zoll-Glasfläschchen
	Fisherbrand	03-339-26A	12 x 35 mm Fläschchen mit Kappe
Histodenz	Sigma-Aldrich		Dichtegradient mittel
Iridektomie-Schere	Fine Science Tools	15000-03	2 mm Schneide
Große Präparierschere	Fisherbrand	08-951-20	Gerade, 6 Zoll
Nadelhalter	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar, 6 Zoll
Paraformaldehyd-Phosphat-Puffer
Scharfe Pinzette	Sigma-Adrich	Z168777	feine Spitze, gerade, 4,25 Zoll
kleine Präparierschere	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm Schneide
Natriumazid
Natriumdodecyl Sulfat (SDS)
Gewebezange	Excelta	16050133	mittleres Gewebe, 1X2 Zähne
VA-044	Wako Chemicals		Wasserlöslicher Azoinitiator