Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

Zusammenfassung

Das vorgestellte Protokoll verwendet Diedurchflusszytometrie, um die Anzahl der sich ausbreitenden und abgestorbenen Zellen in kultivierten Mausenteroiden zu quantifizieren. Diese Methode ist hilfreich, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Organoidproliferation und das Überleben zu bewerten.

Zusammenfassung

Das Darmepithel wirkt als Barriere, die verhindert, dass Luminalgehalte wie pathogene Mikrobiota und Toxine in den Rest des Körpers gelangen. Die Epithelbarrierefunktion erfordert die Integrität von Darmepithelzellen. Während die Epithelzellproliferation eine kontinuierliche Schicht von Zellen aufrechterhält, die eine Barriere bildet, führt Epithelschädigung zu Barrierestörungen. Dadurch können luminale Inhalte über einen unbeschränkten Weg über die Darmbarriere hinweg. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit vielen Darmerkrankungen verbunden, wie entzündliche Darmerkrankungen. Isolierte Maus-Darmkrypen können als krypto-villus-ähnliche Strukturen kultiviert und gepflegt werden, die als Darmorganoide oder "Enteroide" bezeichnet werden. Enteroide sind ideal, um die Proliferation und den Zelltod von Darmepithelzellen in vitro zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode, um die Anzahl der proliferativen und abgestorbenen Zellen in kultivierten Enteroiden zu quantifizieren. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) und Propidiumiodid werden verwendet, um wulässige und abgestorbene Zellen in Enteroiden zu kennzeichnen, und der Anteil der vermehrenden und abgestorbenen Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Dies ist ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Proliferation von Darmepithelzellen und das Überleben von Zellen zu testen.

Einleitung

Eine grundlegende Funktion der Darmepithelzellen ist es, den Eintrag von leuchtdichtem Inhalt wie pathogenen Bakterien und Toxinen^1,2zu schützen. Um eine solche Funktion auszuführen, vermehren sich Darmstammzellen kontinuierlich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Epithelzellen, einschließlich Enterozyten und Sekretoretenzellen, die eine Barriere bilden, indem sie enge Verbindungen bilden³. Die schnelle Erneuerung der Darmepithelzellen erfordert eine strikte Koordination der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und zelltodige^{Zellabnutzung 4,}....

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) an der Soochow University genehmigt.

1. DarmorganoidIsolation und Kultur

1. Isolierung von Darmkrypten und enteroiden Kulturen
   1. Euthanisieren Sie eine 8 Wochen alte Wild-Typ-Maus mit CO2-Inhalation. Verwenden Sie TissueZangen und feine Irisschere, um ca. 8 cm Ileum zu sezieren.
   2. Mit einer Spritze mit gavage Fütterungsnadel mit ca. 40 ml eiskaltem Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) ausspülen, dann längs mit einer Schere schneiden und das Ileum öffnen.
   3. Das Ileum in kleine (0,5 x 1,....

Ergebnisse

Kleine Darmkrypten wurden isoliert und als Enteroide in der Kellermembranmatrix kultiviert. Enteroide begannen 2 Tage nach der Isolation Knospen zu bilden. Am 6. Tag hatten Enteroide viele Knospen mit vielen Schutt (tote Zellen) im Lumen. Enteroide waren in diesem Stadium für den Durchgang bereit (Abbildung 3).

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass entzündliche Zytokine für die Aufrechterhaltung der Darmepithelhomöostase unerlässlich sind. Abnormale Expression vo.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für die Kultur der Enteroide in vitro und die Quantifizierung von EdU- und PI-positiven Zellen in den Enteroiden durch Durchflusszytometrie erforderlich sind. Diese Strategie hat mehrere Vorteile. Erstens wird die EdU-Kennzeichnung verwendet, um vermehrende Zellen in Enteroiden zu erkennen. Im Vergleich zum herkömmlichen BrdU-Test ist die EdU-Kennzeichnungsmethode schneller, empfindlicher und genauer. EdU ist sehr ähnlich zu Thymin (T), das Thymin in der DNA-Synthese während .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 ml Zentrifugenröhrchen	Corning	430791
22 G Sondennadel	VWR	20068-608
24-Well-Platte	Nunc	142475
40 mm steriles Zellsieb	BD	352340
50 ml Zentrifugenröhrchen	Corning	430829
70 mm steriles Zellsieb	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Akustisches Fokussierungszytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Ergänzung	GIBCO	17504044
Puffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Puffer 2			54,9 mM D-Sorbit, 43,4 mM Saccharose in DPBS
C57/B6 Mäusen	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing
University Zelldissoziationsenzyme (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Zentrifuge	Eppendorf	5424
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Lebensdauer technologies	C10639
CO2-Inkubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO
D-Sorbit	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR Medien			Minigut Medien, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-Spondin
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	10270-106
Feine Irisschere	Tansoole	2037454
Fluoreszenzmikroskop	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut-Medien			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 Einheiten/ml), 10 mM Hepes, N2-Ergänzung (1:100), B27-Ergänzung (1:50)
N2-Ergänzung	R& D	AR009
Nichtionisches Tensid (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operationsschere (12,5 cm)	Tansool	2025785
Paraformaldehyd (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phasenkontrastmikroskop	Nikon	TS1000
Propidiumiodid	Sigma	P4170-25MG
Rekombinante EGF	PeproTech	315-09
Rekombinante Maus Noggin	PeproTech	250-38
Rekombinante Maus R-Spondin 1	R& D	3474-RS-050
Rekombinante Maus IL-22	PeproTech	210-22-10
Saccharose	BBI	SB0498
Gewebezange	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049

Zentrifuge Eppendorf 5810R 14190144