Methodenartikel

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

DOI:

10.3791/60503

⸱

18. Dezember 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt lasercapture microdissection for the isolation of knorpel and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Knorpel und Knochen können durch Kresylviolettfärbung schnell visualisiert und präzise gesammelt werden, um hochwertige RNA für die transkriptomische Analyse zu liefern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laser capture microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um bestimmte Zelltypen oder Interessengebiete von heterogenen Geweben zu isolieren. Die zelluläre und molekulare Komplexität von Skelettelementen nimmt mit der Entwicklung zu. Gewebeheterogenität, wie z.B. an der Schnittstelle von knorpeligen und ossösen Elementen untereinander oder mit umgebenden Geweben, ist ein Hindernis für die Untersuchung der Entwicklung von Knorpel und Knochen. Unser Protokoll bietet eine schnelle Methode der Gewebeverarbeitung und Isolierung von Knorpel und Knochen, die eine qualitativ hochwertige RNA für die Genexpressionsanalyse liefert. Frische gefrorene Gewebe von Mausembryonen werden geschnitten und kurze kresylviolette Färbung wird verwendet, um Knorpel und Knochen mit Farben zu visualisieren, die sich von umgebenden Geweben unterscheiden. Die Rutschen werden dann schnell dehydriert, Knorpel und Knochen werden anschließend von LCM isoliert. Die Minimierung der Exposition gegenüber wässrigen Lösungen während dieses Prozesses bewahrt die RNA-Integrität. Maus Meckels Knorpel und Unterkieferknochen bei E16.5 wurden erfolgreich gesammelt und die Genexpressionsanalyse zeigte die differenzielle Expression von Markergenen für Osteoblasten, Osteozyten, Osteoklasten und Chondrozyten. Hochwertige RNA wurde auch aus einer Reihe von Geweben und embryonalen Zeitaltern isoliert. Dieses Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung für LCM, einschließlich Kryoembedding, Schnitt, Färbung und Dehydrierung von frischem gefrorenem Gewebe, und eine präzise Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM, was zu einer qualitativ hochwertigen RNA für die transkriptomische Analyse führt.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Muskel-Skelett-System ist ein Mehrkomponentensystem, bestehend aus Muskel, Bindegewebe, Sehne, Band, Knorpel und Knochen, innerviert durch Nerven und durch Blutgefäße vaskularisiert1. Das Skelettgewebe entwickelt sich mit zunehmender zellulärer Heterogenität und struktureller Komplexität. Knorpel und Knochen entwickeln sich aus der gleichen Osteochondroprogenitor-Linie und sind stark verwandt. Embryonaler Knorpel und Knochen entwickeln sich in Verbindung mit Muskeln, Nerven, Blutgefäßen und undifferenziertem Mesenchym. Knorpel kann auch von Knochen umgeben sein, wie Meckels Knorpel und Kondylarknorpel innerhalb des Unterkieferknochens. Diese Gewebe sind anatomisch assoziiert und interagieren während der Entwicklung durch extrazelluläre Signale miteinander. Bei der Untersuchung der Genexpression bei der Entwicklung von Knorpel und Knochen ist ein Hindernis die Heterogenität von Skelettstrukturen, die aus mehreren Gewebetypen bestehen. Eine präzise Isolierung des spezifischen Gewebes von Interesse ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Transkriptionsanalyse.

Lasercapture Microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zelltypen oder Relevante Regionen innerhalb heterogener Gewebe zu isolieren, ist reproduzierbar und empfindlich gegenüber der Einzelzellebene2. Es kann Zellen von Interesse für eine breite Palette von nachgelagerten Assays in Transkriptomik, Genomik und Proteomik präzise zielen und erfassen3,4. Die Qualität der isolierten RNA, DNA oder Protein kann mit einem Bioanalysator oder einer gleichwertigen Plattform beurteilt werden. Beispielsweise wird die RNA-Qualität durch die RNA-Integritätsnummer (RIN)5angezeigt.

Hier bieten wir ein Protokoll zur schnellen Färbung und Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM aus frisch gefrorenem Gewebe. Wir verwenden den Mausembryon, um zu zeigen, dass dieses Protokoll qualitativ hochwertige RNA für nachfolgende transkriptomische Analysen liefert, wie z. B. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gewebe von Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gewonnen, und Studienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai genehmigt.

1. Zubereitung von Frischgefrorenen Exemplaren

  1. Sezieren Sie den Embryo oder das Gewebe von Interesse. Einbetten der Probe in eine Einweg-Einbettform mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Passen Sie die Ausrichtung der Probe mit einer Spitze oder Nadel an.
  2. Die Proben in einem Trockeneis/Methyl-2-Butanbad schnell einfrieren. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie ihn bei -80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Kryosektion für Laser Capture Microdissection

  1. Kryostat auftauen und Innenflächen mit 70% Ethanol reinigen. Behandeln Sie die Anti-Roll-Platte und ein Paar Zangen mit RNase-Dekontaminationsmittel. Stellen Sie den Kryostat auf die gewünschte Schnitttemperatur (-18 bis -22 °C) ein. Bereiten Sie einen Deckelbehälter mit Trockeneis vor und legen Sie eine Aluminiumfolie auf das Trockeneis, um die geschnittenen Probenschlitten während des Kryosektions vorübergehend zu lagern.
    ACHTUNG: Trockeneis ist extrem kalt. Behandeln Sie Trockeneis immer mit Sorgfalt und tragen Sie isolierte Handschuhe, wenn Sie damit umgehen.
  2. Das frisch gefrorene Exemplar in einen Eimer Trockeneis geben. Legen Sie eine Schicht OCT-Verbindung auf einen Kryostat-Probenhalter und legen Sie die Probe sofort mit sanftem Druck auf das OCT. Wenn OCT vollständig eingefroren ist, befestigen Sie den Halter mit der Probe in den Kryostat-Schneidarm.
  3. Lassen Sie die Probe 15 min im Kryostat, um sie der Schnitttemperatur gleichzusam zu machen.
  4. Schneiden Sie das Gewebe und sammeln Sie die Scheiben auf Polyethylennaphthalate (PEN) Membran gleitet mit einer Dicke von 12 m. Richten Sie aufeinander folgende Abschnitte auf der Membran aus. Lassen Sie nach Abschluss einer Rutsche die Abschnitte für einige Minuten trocknen und übertragen Sie die Rutsche auf die Folie im Trockeneisbehälter, bis alle erforderlichen Rutschen gesammelt sind.
  5. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C in einer Schiebebox auf.
    HINWEIS: Abschnitt steile wird gewählt, um die Menge des gesammelten Gewebes zu maximieren, während effizientes Schneiden des Gewebes ermöglicht wird, und kann je nach Gewebe von Interesse variieren. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Halten Sie Dias frei von RNase-Kontamination. Vermeiden Sie Temperaturänderungen. Obwohl die RINs von RNA aus Dias, die bis zu 6 Monate lang gespeichert sind, immer noch auf eine hohe Qualität der RNA hinweisen können, empfehlen wir, Dias so schnell wie möglich zu verwenden.

3. Probenvorbereitung für Laser Capture Microdissection

  1. Bereiten Sie Lösungen für Färbung und Austrocknung vor.
    1. 45 ml 80% Ethanol in jeweils drei 50 ml Zentrifugenrohre auf Eis legen. Beschriften Sie sie als #1, #2 und #3. Ethanol mit RNase/DNase freiem Wasser verdünnen.
    2. 45 ml 95% Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenrohr auf Eis legen.
    3. 45 ml 100% Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenrohr auf Eis legen.
    4. 45 ml Xylol in ein 50 ml Zentrifugenrohr bei Raumtemperatur geben.
      ACHTUNG: Xylol sollte in einer Dunstabzugshaube verwendet werden.
  2. Eine PEN-Membran kurz auftauen, indem Sie sie gegen eine handgeliebte Hand legen, dann zweimal für 30 s in 45 ml 80% Ethanol (#1 und #2) mit Rührung in 50 ml Zentrifugenrohren waschen, um das OCT zu entfernen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, OCT vor der Färbung zu entfernen, um zu verhindern, dass OCT während der Färbung die Abschnitte verdunkelt. Zangen können verwendet werden, um die Entfernung von OCT zu erleichtern, die nicht durch Agitation abgewaschen wird.
  3. Schieben Sie den Schlitten auf ein Blatt Aluminiumfolie. Pipette 0,8 ml 0,1% Kresylviolett in 50% Ethanol auf den Schlitten und Fleck für 30 s. Waschen Sie das Dia in 45 ml 80% Ethanol (#3) für 30 s, und dehydrieren Sie dann durch Durchgang für je 30 s durch 45 ml 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol in 50 ml Zentrifugenröhren.
  4. Stand gleitet auf einem empfindlichen Aufgabenwischer für 5 min, um Xylol und trockene Abschnitte abtropfen zu lassen.
    HINWEIS: Die Dias müssen vor LCM vollständig getrocknet werden.

4. Laser Capture Mikrodissektion

HINWEIS: Tragen Sie bei der Ausführung von LCM pulverfreie Nitrilhandschuhe.

  1. Schalten Sie das LCM-Mikroskop, den Laser und den Computer ein. Melden Sie sich am Computer an und starten Sie die Software. Drehen Sie den Schlüssel in die Position "Ein", um den Laser zu starten. Wenn das grüne Licht (Laser) eingeschaltet ist, drücken Sie die rote Taste, um den Laser zu aktivieren, und dann wird das Licht (Laser) rot, was darauf hinweist, dass der Laser einsatzbereit ist.
    HINWEIS: Der Laser benötigt ca. 10 min zum Aufwärmen.
  2. Richten Sie die Sammelrohre ein.
    1. Setzen Sie die Kappe eines 0,5 ml Polymerase-Kettenreaktionsrohrs (PCR) in den Kollektor ein.
      HINWEIS: Wählen Sie den passenden Kollektor für die gewünschten PCR-Röhren (0,2 oder 0,5 ml).
    2. Pipette 50 l Extraktionspuffer (bereitgestellt durch RNA-Isolationskit in der Tabelle der Materialien) in die Kappe des 0,5 ml Sammelrohrs.
    3. Legen Sie das Sammelgerät in das Mikroskop ein.
    4. Klicken Sie im Fenster "Collector Device ändern" auf die Schaltfläche Zum Referenzpunkt verschieben, um den Kollektor zum Referenzpunkt (RP) zu verschieben. Passen Sie den Fokus an, um das RP klar anzuzeigen. Klicken Sie auf die Pfeile, um die RP in die Mitte der Ansicht zu verschieben.
  3. Laden Sie Probenschlitten.
    1. Klicken Sie auf die linke Schaltfläche Entladen in der Symbolleiste, um den Folienhalter zu senken.
    2. Legen Sie die Rutsche in den Halter, wobei der Gewebeabschnitt nach unten zeigt.
      HINWEIS: Diese Ausrichtung stellt sicher, dass die erfassten Gewebeabschnitte durch die Schwerkraft in die Kappe des Sammelrohrs fallen.
    3. Setzen Sie den Halter wieder in die Bühne ein.
  4. Richten Sie die Laserparameter ein.
    1. Wählen Sie die Steuerungsoption des Lasermenüs aus oder klicken Sie auf das Lasersymbol.
    2. Passen Sie diese Parameter wie gewünscht an: Leistung, die Leistung des Lasers; Blende, die Breite des Lasers; und Geschwindigkeit, die Geschwindigkeit des Schneidens im Draw- und Cut-Modus.
      HINWEIS: Testen Sie den Laser in einem Bereich aus Interesse. Höhere Leistung oder größere Blende erleichtert das Schneiden, verursacht aber mehr Schäden an den Zellen. Passen Sie die Kombination aus Leistung, Blende und Geschwindigkeit an, um ein effizientes Schneiden und minimale Schäden am Gewebe zu erzielen. Zum Beispiel Power = 40, Aperture = 5 und Speed = 7 für Knorpelgewebe auf einem 12-mm-Abschnitt.
  5. Wählen und schneiden Sie Interessenbereiche aus.
    1. Beginnen Sie mit 5x Objektiv und finden Sie die Interessengebiete, und wechseln Sie dann zum Ziel (5x, 10x oder 40x), das den Interessenbereich am besten anzeigt.
      HINWEIS: Nach der Kresylviolettfärbung sind Knorpel magenta gefärbt und mineralisierte Gewebe erscheinen braun oder schwarz, von anderen Geweben zu unterscheiden. Bilder können mit Bild speichern als aus dem Menü Datei gespeichert werden.
    2. Wählen Sie die Röhre für die Sammlung (A, B, C, D), indem Sie auf die Markierung am Kollektor klicken.
    3. Wählen Sie Verschieben und Schneiden oder Zeichnen und Schneiden. Im Bewegungs- und Schnittmodus wird die Probe manuell geschnitten, indem die Maus oder der Touchscreen-Stift verwendet wird, um Formen freihändig zu zeichnen. Im Draw- und Cut-Modus können Formen freihändig mit der Maus oder dem Touchscreen-Stift für das nachfolgende Schneiden gezeichnet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnitt starten", um das Laserschneiden zu initiieren.
    4. Sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Zielgewebe mit PEN-Membran durch Schwerkraft in die Kappe des Sammelrohrs. Wiederholen Sie 4.5, um bei Bedarf mehrere Interessenbereiche zu bündeln.
      HINWEIS: Wiederholte Schnitte oder eine Erhöhung der Kraft oder Blende können erforderlich sein, wenn das Gewebe nicht in die Kappe des Sammelrohrs aufgrund unvollständigen Schneidens fällt. Mineralisierte Knochen (braun oder schwarz) können nicht direkt per Laser geschnitten werden.
  6. Entladen Sie den Kollektor und schließen Sie das PCR-Rohr vorsichtig. Legen Sie das mikrosezierte Gewebe in Trockeneis. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie ihn bei -80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wiederholen Sie 4.2 bis 4.6 für die nächste Probe.

5. Lyse von mikrosezierten Geweben und RNA-Isolation

  1. Das mikrosezierte Gewebe bei Raumtemperatur auftauen. Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie die Proben für 30 min bei 42 °C.
  2. Nach der Inkubation drehen Sie den Lysepuffer in das 0,5 ml PCR-Rohr. Führen Sie die DNase-Behandlung und die RNA-Extraktion mit einem RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle) nach den Anweisungen des Herstellers durch.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koronale Abschnitte von frisch gefrorenem Mausgewebe bei E16.5 wurden verwendet, um die Isolierung und Sammlung von Meckels Knorpel (MC), Kondylarknorpel und Unterkieferknochen durch LCM zu demonstrieren. Mausembryonen bei E16.5 wurden seziert und in kryogene Formen mit OCT-Verbindung eingebettet. Proben in Formen wurden schnell in einem Trockeneis- und Methyl-2-Butanbad eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Um die kresylviolette Färbung von Knorpel und Knochen zu demonstrieren, wurde eine Kryo...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM ermöglicht die Isolierung angereicherter oder homogener Zellpopulationen aus heterogenen Geweben. Zu seinen Vorteilen gehört die schnelle und präzise Erfassung von Zellen in ihrem In-vivo-Kontext, während mögliche Nachteile darin bestehen, dass sie zeitaufwändig, teuer und durch die Notwendigkeit begrenzt ist, dass der Benutzer unterschiedliche Subpopulationen innerhalb einer bestimmten Stichprobe30erkennt. Dieses Protokoll enthält Details zu LCM von embryonalem Knorpel und Knochen de...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233) unterstützt. Die Autoren danken dem Biorepository und Pathologie-Kern für den Zugang zur Leica LMD 6500 Plattform an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MethylbutanThermoFisher ScientificO3551-4
BioanalysatorAgilentG2939BA
ZentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific339653Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, 50 mL
CresylviolettacetatSigma-AldrichC5042
KryostatLeica BiosystemsCM3050 S
FeinfühlerThermoFisher Scientific06-666
Einweg-EinbettungsformThermoFisher Scientific1220
Destilliertes WasserInvitrogen10977-015DNase/RNase-freies
Ethanol, absolut (200 proof)ThermoFisher ScientificBP2818Molekularbiologischer
Glas-PEN-MembranträgerLeica Microsystems11505158
LCM-SystemLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Mikroskop-DeckglasThermoFisher Scientific12-545FP
ObjektträgerThermoFisher Scientific12-550-15
OCT CompoundElektronenmikroskopieSciences 102094-106
PCR-Röhrchen mit flacher Kappe, 0,5 mLAxygenPCR-05-CLCM-Entnahmeröhrchen
Permanentes EinbettmediumVector LaboratoriesH-5000
RNA-IsolationskitThermoFisher ScientificKIT0204
RNase-DekontaminationsmittelSigma-AldrichR2020RNase-Dekontaminationsmittel zur Reinigung von Oberflächen
XylolSigma-Aldrich214736

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17(2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Isolierung von KnochengewebeCresylviolett F rbungErhaltung der RNA Integrit tKryosektionstechnikProtokoll zur GewebedehydrierungMeckel KnorpelUnterkieferknochen

Verwandte Artikel