Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc

Zusammenfassung

Der Zeitpunkt der Exposition gegenüber Liganden kann sich auf ihre Entwicklungsfolgen auswirken. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila-Knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) namens Dpp aus Zellen der Flügelscheibe abbilden kann.

Zusammenfassung

Die transformierende Überfamilie des Wachstumsfaktor-Betas (TGF-)ist für die frühe embryonale Musterung und Entwicklung von adulten Strukturen in mehrzelligen Organismen unerlässlich. Die TGF--Überfamilie umfasst TGF-, Knochenmorphogenetisches Protein (BMPs), Activine, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren und Nodals. Es ist seit langem bekannt, dass die Menge an Liganden, die Zellen ausgesetzt sind, für seine Wirkung wichtig ist. Es wurde angenommen, dass weiträumige Konzentrationsgradienten embryonale Muster aufstellen. In jüngster Zeit wurde jedoch deutlich, dass der Zeitpunkt der Exposition gegenüber diesen Liganden auch für ihre nachgelagerten Transkriptionsfolgen wichtig ist. Ein TGF--A-Superfamilienligand kann keine Entwicklungsfolge haben, bis es aus der Zelle, in der es hergestellt wurde, freigesetzt wird. Bis vor kurzem war es schwierig zu bestimmen, wann diese Liganden aus Zellen freigesetzt wurden. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila BMP namens Decapentaplegic (Dpp) aus den Zellen des Flügelprimordiums oder der Flügelscheibe misst. Diese Methode kann für andere Systeme oder Signalligaden geändert werden.

Einleitung

Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind für die frühe Embryogenese und Musterung von erwachsenen Strukturen unerlässlich. BMPs werden produziert und abgesondert, um die Transkription von Zielgenen zu beeinflussen, die für das Wachstum und die Zelldifferenzierung in reagierenden Zellen benötigt werden. Decapentaplegic (Dpp) ist ein Drosophila Homolog von BMP4, das für die Entwicklung von embryonalen und erwachsenen Strukturen wie dem Flügel^1,2,3,4wichtig ist. Mehrere Gruppen haben sich auf die Rolle von Dpp bei der Musterung von erwachsenen Fliegenflügeln konzentriert, da 1) die Flügel aus zwei transparenten Epithelia-Blättern mit einem konsistenten Venationsmuster bestehen, das leicht beurteilt werden kann; 2) die Flügelscheiben sind auch einigermaßen flach, können außerhalb der Larve kultiviert werden und sind einfach zu bilden und zu quantifizieren Unterschiede im Muster; und 3) die Flügelmusterentwicklung ist empfindlich gegenüber Dpp, so dass kleine Störungen im Weg flügelvenationsmuster beeinflussen.

Dpp wird in Zellen in der vorderen/hinteren Grenze der Flügelscheibe^5,6,7,8produziert. Dpp bindet an einen Komplex von Typ 1 und Typ 2 Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren^9,10. Bei Dpp-Bindung phosphorisiert der Typ-2-Rezeptor den Typ-1-Rezeptor, der dann Mütter gegen Dpp (Mad), einen Smad 1/5/8 Homolog, phosphoryliert. Phosphorylierte SMAD rekrutiert einen zusätzlichen Co-Smad (Medea), der es ermöglicht, in den Kern einzutreten, wo es Zielgene reguliert, was zu nachgelagerten Effekten wie Proliferation oder Differenzierung^4,11führt.

Kürzlich hat das Bates Lab gezeigt, dass die unsachgemäße Freisetzung von Dpp innerhalb der Flügelscheibe zu einer Abnahme der Mad-Phosphorylierung, einer Verringerung der Zielgenexpression und Flügelmusterdefekten^12,13führen kann. Mehrere Ionenkanäle beeinflussen die Entwicklung des Drosophila-Flügels und der zugehörigen Strukturen^14,15. Diese Ionenkanäle könnten auch an der Dpp-Veröffentlichung beteiligt sein. Bei der Bestimmung des Mechanismus der Morphogenfreisetzung ist es wichtig, dass es eine Methode gibt, um Freisetzungsereignisse zu visualisieren.

Drs. Aurelio Teleman und Stephen Cohen schufen ein Dpp-GFP-Fusionsprotein, das in der Lage ist, den Verlust von Dpp zu retten, was bedeutet, dass es biologisch aktiv ist und auf biologisch relevante Weise freigesetzt wird¹⁶. Hier beschreiben wir, wie wir Dpp-Release-Ereignisse mit diesem Dpp-GFP visualisieren. Dieses Fusionsprotein ist besonders nützlich, da GFP pH-empfindlich ist, so dass, wenn es in sauren Vesikeln ist, die Fluoreszenz abgeschreckt wird¹⁷. Wenn also ein mit GFP markiertes Protein aus einem Vesikel in die neutralere extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird, erhöht sich die GFP-Fluoreszenzintensität um¹⁷. Wir nutzten die pH-Empfindlichkeit von GFP, um festzustellen, ob Dpp-GFP in sauren Bläschen liegt. Wir abgebildetflügelförmige Nvenzen, die Dpp-GFP vor und nach dem Zusatz von Ammoniumchlorid ausdrücken, das intrazelluläre Kompartimente neutralisiert¹⁸. Wir fanden eine signifikante Zunahme der Fluoreszenz von Punktikern nach der Zugabe von Ammoniumchlorid, was darauf hindeutet, dass intrazelluläres Dpp-GFP vor der Zugabe von Ammoniumchlorid¹⁸abgeschreckt wird. Wir schlussfolgern, dass sich intrazelluläres Dpp-GFP in sauren membrangebundenen Kompartimenten wie Vesikeln befindet und nach Zugabe von Ammoniumchlorid unausgequetscht wird, um den pH-Wert der intrazellulären Kompartimente zu neutralisieren¹⁸. Dies macht die Live-Bildgebung von Dpp-GFP zu einer nützlichen Technik, um die Dynamik von Dpp in der Drosophila-Flügelscheibe zu visualisieren, da sie aus sauren Kompartimenten in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird.

Hier beschreiben wir die Methode, mit der wir Dpp-Release-Ereignisse mit Dpp-GFP visualisieren. Dpp-GFP kann in seinem nativen Muster in Drosophila Flügelscheiben mit dem UAS-GAL4 System¹⁹ausgedrückt werden. Dies ist die Methode, die verwendet wurde, um zu bestimmen, dass Irk-Kanäle Dpp-Version¹⁸beeinflussen. Wir validierten die Methode durch Live-Imaging-Z-Stacks. Wir sehen nicht, dass sich Dpp-GFP puncta innerhalb der Fokusebene in Zeitreihen bewegt, wenn wir in einer Fokusebene erworben werden. Wir sehen auch keine Bewegung von Dpp-GFP puncta, wenn wir in einem Z-Stack abgebildet sind. Wir schlussfolgern, dass die Dpp-GFP-Punktias, die mit dieser Methode beobachtet werden, Freisetzungsereignisse sind und nicht die Intrazellulärbewegung von Vesikeln. Diese Methode der Live-Imaging von Dpp-GFP könnte möglicherweise verwendet werden, um andere vermeintliche Modifikatoren der Dpp-Freisetzung auf ihre Auswirkungen auf die Dpp-Dynamik zu testen, oder könnte geändert werden, um die Dynamik anderer Liganden zu betrachten.

Protokoll

1. Sammeln von Eiern, um Larven für die Dissektion zu generieren

1. Cross 30-40 jungfrau weibchen Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu fliegt zu 10-15 männlich Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
   HINWEIS: Zwei Genotypen, die Dpp-GAL4 und UAS-Dpp-GFP enthalten, können verwendet werden, solange die Balancer Larvenmarker haben, die die Auswahl der entsprechenden Nachkommen während der Larvenphase ermöglichen.
2. Um Eier zu sammeln, kippen Sie die gekreuzten Fliegen in eine frische Durchstechflasche mit Lebensmitteln und lassen Sie sie für 3-4 h liegen, bevor Sie sie aus der Durchstechflasche entfernen. Um die Eiablage zu fördern, kann eine kleine Menge Hefepaste aus granulierter Hefe, gemischt mit einer kleinen Menge Wasser, an die Oberseite des Futters gegeben werden, bevor die Fliegen in die Durchstechflasche eingeführt werden. Der gleiche Satz gekreuzter Fliegen kann bis zu 7 Tage lang mit Eiersammlungen aufbewahrt und verwendet werden.
   HINWEIS: Jedes Standard-Drosophila Maismehl-Lebensmittel-Rezept sollte akzeptabel sein. Hier wird das von Hazegh und Reis²⁰beschriebene Lebensmittelrezept verwendet.
3. Bewahren Sie die Eiersammelfläschchen bei 25 °C für ca. 144 h auf, bis die Larven im dritten Insternstadium (Wanderstadium) sind.
4. Um die geeigneten Larven für die Zerlegung auszuwählen (die sowohl Dpp-GAL4 als auch UAS-Dpp-GFP exdrücken), wählen Sie zuerst Larven aus, die nicht-Tb sind. Diese Larven werden normale Länge statt kurz und fett sein.
5. Unter den Nicht-Tb-Larven werden Larven, die CyO-GFP exexegieren, und Larven, die Dpp-GFP exemiten. Um die Dpp-GFP-exezierenden Larven auszuwählen, sehen Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Während sowohl Dpp-GFP als auch CyO-GFP-exezierende Larve eine gewisse GFP-Fluoreszenz haben wird, kann das Dpp-GFP, das Larven ausdrückt, dadurch unterschieden werden, dass das GFP auf die Flügelscheiben beschränkt ist und die Fluoreszenz viel weniger hell ist als die CyO-GFP-exemitzenten Larven. Wählen Sie diese weniger hellen Larven für die Zerlegung.

2. Vorbereitung der Lösung für Larval Imaging und Dissektion

1. Für die Live-Bildgebung von Flügelscheiben, vorbereiten modifizierte HL3 Medien²¹ (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl₂ Dyhydrat, 4 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 5 mM Trehalose Dyhydrat, 115 mM Saccharose, 5 mM HEPES). Dieses Medium ermöglicht es, die Flügelscheibe für die Bildgebung²¹am Leben zu erhalten.
2. Stellen Sie den pH-Wert mit HEPES auf 7,1 ein und filtern Sie mit einem 0,22-mm-Filter. Verwenden Sie dieses Medium sowohl für die Flügelscheibensektionen als auch als Montagemedium für Live-Bildgebung.

3. Vorbereiten von Dias für die Flügelscheibenmontage

1. Legen Sie zwei Stücke farbloses doppelseitiges Klebeband in der Breite über ein Mikroskopschlitten, sodass ein Abstand von etwa 5 mm zwischen ihnen bleibt. Die Bandstücke sollten lang genug sein, damit die Enden des Bandes bündig mit den Rändern des Mikroskopschlittens liegen.
2. Verwenden Sie eine flache Kante (z. B. das Griffende eines SezierenderZangenpaares), um das Band fest auf die Folie zu drücken, sodass kein Medium darunter sickern kann.
3. Platzieren Sie 25 l modifiziertes HL3-Medium zwischen den beiden Bandstücken. Die Flügelscheibe wird in diesem Tropfen von Medien zwischen Denbändern montiert, so dass das Band verhindert, dass der Abdeckungsrutsch die Scheibe zerkleinert (Abbildung 1A).

4. Sezieren und Montieren von Flügelscheiben für die Bildgebung

1. Sezieren Vonlarven im vorbereiteten modifizierten HL3-Medium²⁶.
2. Mit zwei Zangenpaaren die Larven vorsichtig in die Hälfte reißen und die hintere Hälfte der Larve entsorgen.
3. Greifen Sie die Mitte der vorderen Hälfte der Larve mit einem Paar Zangen und verwenden Sie ein anderes Paar geschlossener Zangen, um die Mundhaken zurück in die Larve zu drücken, bis die Larve vollständig invertiert ist.
4. Die Flügelscheiben können am einfachsten gefunden werden, indem man nach den scharfen Biegungen in den beiden dunkleren primären Zweigen der Luftröhre sucht, die beide Seiten der Larven hinunterlaufen. Die Flügelscheiben liegen direkt unter diesen Biegungen in den Luftröhren in einer umgekehrten Larve.
5. Entfernen Sie die Flügelscheiben vorsichtig und übertragen Sie sie auf das 25-Liter-HL3-Medium auf dem vorbereiteten Mikroskopschlitten. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftröhre an den sezierten Flügelscheiben befestigt bleibt, da dies dazu führen kann, dass die Scheiben schweben, was die Bildgebung erschwert.
6. Ordnen Sie die Flügelscheibe so an, dass die Peripodial-Seite des Flügelbeutels nach oben vom Mikroskopschlitten nach oben zeigt, wobei die Scheibe flach liegt (siehe Abbildung 1A,B).
7. Bedecken Sie die Flügelscheibe und das Klebeband mit einem Deckelschlupf und versiegeln Sie den Coverslip mit Nagellack. Sobald die Politur trocken ist, gehen Sie sofort zu den unten stehenden Bildschritten.

5. Imaging Dpp Release

1. Stellen Sie die montierte Flügelscheibe mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit einem 40-fachen Ölobjektiv und 488 nm Laser ab. Das Dpp-GFP sollte als GfP-Fluoreszenzstreifen in der Mitte der Flügelscheibe erscheinen, wobei kleine Punktzeichen von Dpp-GFP aus diesem mittleren Zellstreifen freigesetzt werden.
2. Sammeln Sie Bilder mit einer Geschwindigkeit von 2 Hz für 2 min, um Dpp-Release zu visualisieren. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie den Laser auf eine Einstellung ein, die gerade stark genug ist, um ein klares Bild der Dpp-releasing-Zellen zu erhalten, um überbleichen während der Bildsammlung zu vermeiden. Die Bilder können als Zeitreihe gesammelt werden, die dann als AVI-Dateien (keine Komprimierung, 3 Frames/s) exportiert werden kann, um Videodateien der Dpp-Version zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Live-Imaging-Ergebnisse dieses Protokolls. Wenn das Protokoll erfolgreich ist, kann Dpp-GFP als Streifen in der Mitte der Flügelscheibe mit Kernen gesehen werden, die als nicht fluoreszierende Kreise innerhalb des Dpp-GFP-Bereichs sichtbar sind (Abbildung 2). Die Dpp-GFP-Freisetzung ist als fluoreszierende Punkta sichtbar, die erscheinen und verschwinden. Wir haben beobachtet, wie die Fluoreszenz von Dpp-GFP in den Zellkörpern un...

Diskussion

BMPs wie Dpp machen ihre signifikante Wirkung, wenn sie einen Komplex von membrangebundenen Rezeptoren binden, um eine Kaskade von intrazellulären Signalisierung in benachbarten oder scheinbar entfernten Zellen zu verursachen. Das Labor von Dr. Thomas Kornberg hat gezeigt, dass Zellen, die die Dpp-Signalkontaktzellen erzeugen, die das Signal mit actinbasierten dünnen Filapodie-ähnlichen Strukturen empfangen, die Zytome^15,24,25ge...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Backhefe	Roter Stern
CaCl2 Dyhydrat	Fisher Scientific	C79-500
Deckgläser	VWR	484-457
Doppelseitiges Klebeband	Scotch
Drosophila Agar Typ II	Apex	66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu			Dieser Bestand wird in Kürze im Bloomington Drosophila Stock Center verfügbar sein
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu			Dieser Bestand wird demnächst im Bloomington Drosophila Stock Center erhältlich
Dumont Pinzette #5	World Precision Instruments	500233	Pinzette zum Präparieren
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
KCl	Fisher Scientific	AC193780010
Light Corn Syrup	Karo
Malzextrakt	Breiss
MgCl2	Fisher Scientific	AC223210010
Objektträger	Sigma Aldrich	S8400
NaCl	Fisher	Scientific S271-500
NaHCO3	RPI	S22060-1000.0
Nagellack	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	72180
Propionsäure	VWR	U330-09
Sojamehl	ADM Spezialzutaten	062-100
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3
Saccharose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Trehalose-Dyhydrat	Chem-Impex International, Inc.	00766
Yellow Corn Meal	Quäker
Zeiss LSM 780 Konfokalmikroskop	Zeiss		Mikroskop für Live-Imaging
Zeiss SteREO Discovery.V8 Mikroskop	Zeiss		Mikroskop für Dissektionen