In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Die Freisetzung von ETs aus Neutrophilen wurde zuerst als angeborene Immunantwort identifiziert, die durch eine bakterielle Infektion ausgelöst wurde¹. Sie bestehen aus einem DNA-Rückgrat, an das verschiedene Granulatproteine mit antibakteriellen Eigenschaften gebunden sind, einschließlich neutrophiler Elastase und Myeloperoxidase². Die primäre Rolle von neutrophilen ETs (NETs) besteht darin, Krankheitserreger zu erfassen und deren Eliminierung zu erleichtern³. Neben der schützenden Rolle von ETs in der Immunabwehr haben jedoch immer mehr Studien eine Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten entdeckt, insbesondere bei der Entwicklung von entzündungsgetriebenen Erkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis und Arteriosklerose⁴). Die Freisetzung von ETs kann durch verschiedene pro-inflammatorische Zytokine ausgelöst werden, einschließlich Interleukin 8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF)^5,6, und die lokalisierte Anhäufung von ETs kann Gewebeschäden erhöhen und pro-entzündliche Reaktion⁷. Zum Beispiel, ETs wurden als eine kausale Rolle in der Entwicklung von Arteriosklerose⁸beteiligt , Förderung der Thrombose⁹, und Vorhersage kardiovaskulären Risiko¹⁰.

Es ist nun anerkannt, dass neben Neutrophilen auch andere Immunzellen (d. h. Mastzellen, Eosinophile und Makrophagen) ETs bei Exposition gegenüber der mikrobiellen oder pro-inflammatorischen Stimulation freisetzen können^11,12. Dies kann besonders bei Makrophagen von Bedeutung sein, wenn man ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung, Regulierung und Lösung chronischer entzündlicher Erkrankungen berücksichtigt. Daher ist es wichtig, ein besseres Verständnis der potenziellen Beziehung zwischen DER FREISETZUNG von ET aus Makrophagen und der entwicklung von entzündungsbedingten Krankheiten zu gewinnen. Jüngste Studien haben das Vorhandensein von METs und NETs in intakten menschlichen atherosklerotischen Plaques und organisierten Thromben¹³gezeigt. In ähnlicher Weise wurden METs in die Fahrt nierenverletzung durch die Regulierung von Entzündungsreaktionen¹⁴verwickelt. Im Gegensatz zu Neutrophilen gibt es jedoch begrenzte Daten über die Mechanismen der MET-Bildung aus Makrophagen. Jüngste Studien mit menschlichen In-vitro-Modellen der MET-Bildung zeigen einige Unterschiede in den Pfaden, die an jedem Zelltyp beteiligt sind (d. h. in Bezug auf das Fehlen einer Histon-Zitrullination mit Makrophagen)⁶. Einige haben jedoch gezeigt, dass NET-Freisetzung auch ohne Histon-Citrullination¹⁵auftreten kann.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und direkte Methode zur Bewertung der MET-Freisetzung in einem klinisch relevanten Makrophagenmodell bereitzustellen. Es gibt eine Reihe von verschiedenen In-vitro-Makrophagenzellmodellen, die verwendet wurden, um METs zu untersuchen (d. h. die THP-1 menschliche Monozytenzelllinie und verschiedene murine Makrophagenzelllinien)¹⁶. Diesen Modellen sind einige Einschränkungen zugeordnet. Beispielsweise erfordert die Differenzierung von THP-1-Monozyten zu Makrophagen in der Regel einen Grundierungsschritt, wie z. B. die Zugabe von Phorbolmyristateacetat (PMA), das selbst Proteinkinase C (PKC)-abhängige Pfade aktiviert. Dieser Prozess ist dafür bekannt, ET-Freisetzung⁴ auszulösen und führt zu einer niedrigen basalen MET-Freisetzung aus THP-1-Zellen. Andere Studien haben einige Unterschiede in der Bioaktivität und Entzündungsreaktionen durch Makrophagen in vivo im Vergleich zu PMA-behandelten THP-1-Zellen¹⁷hervorgehoben.

In ähnlicher Weise stellen das Verhalten und die entzündlichen Reaktionen verschiedener muriner Makrophagen-ähnlicher Zelllinien das Reaktionsspektrum der primären menschlichen Makrophagen¹⁸nicht vollständig dar. Daher wird für die Untersuchung der Makrophagen-ET-Bildung im klinischen Umfeld angenommen, dass primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDMs) eher ein relevanteres Modell als monozytäre oder murine makrophagenähnliche Zelllinien sind.

Die ET-Freisetzung von M1 polarisierten HMDMs wurde nach der Exposition dieser Zellen gegenüber einer Reihe verschiedener entzündlicher Reize, einschließlich der myeloperoxidase-abgeleiteten oxidanten Hypochlorsäure (HOCl), PMA, TNF und IL-8^6,nachgewiesen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, um HMDMs zum M1-Phänotyp zu polarisieren und die nachfolgende MET-Freisetzung bei Exposition gegenüber diesen entzündlichen Reizen zu visualisieren. PMA wird als Stimulus der MET-Freisetzung verwendet, um Vergleiche mit früheren Studien zu erleichtern, die Neutrophile verwendet haben. Wichtig ist, dass HOCl, IL-8 und TNF auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung zu stimulieren, die als bessere Modelle der entzündlichen Umgebung in vivo geglaubt werden. Die mikroskopische Methode zur Visualisierung der ET-Freisetzung beinhaltet die Färbung der extrazellulären DNA in lebenden Zellkulturen mit SYTOX-Grün, einem undurchlässigen fluoreszierenden grünen Nukleinsäurefleck, der in früheren Neutrophilenstudien erfolgreich angewendet wurde. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und qualitative Bewertung der ET-Freisetzung, ist jedoch nicht als eigenständige Methode für die Quantifizierung der ET-Freisetzungsausdehnung geeignet. Es sollte eine alternative Methodik angewandt werden, wenn eine Quantifizierung erforderlich ist, um den Umfang der ET-Freisetzung zu vergleichen, die sich aus unterschiedlichen Behandlungsbedingungen oder Interventionen ergibt.

Die HMDM wurden von menschlichen, buffy Mantelpräparaten isoliert, die von der Blutbank mit ethischer Genehmigung des Sydney Local Health District geliefert wurden.

1. HMDM Kultur

1. Isolieren Sie die Monozyten aus buffy Mantelpräparaten aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern mit einem kommerziell erhältlichen Präparat zur Isolierung von Lymphozyten, gefolgt von gegenläufiger Zentrifugalelutriation^{19, 20}.
2. Bestätigen Sie das Vorhandensein von Monozyten durch Zytospinnen und Färben mit modifiziertem Giemsa-Färbung für Monozytencharakterisierung¹⁹.
3. Passen Sie unter sterilen Bedingungen die Dichte von Monozyten auf 1 x 10⁶ Zellen/ml mit RPMI-1640-Medien ohne Serum an. Fügen Sie 1 ml dieser Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 12 Brunnengewebekulturplatte hinzu. Kultur in einem Zellinkubator bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 für 2 h, um die Einhaltung der Gewebekulturplatte zu fördern.
4. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Zellmedien und ersetzen Sie sie durch vollständige RPMI-1640-Kulturmedien, die 10% (v/v) gepooltes menschliches Serum und 20 mM L-Glutamin enthalten.
5. Kultur die Zellen bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator für 8 Tage, wechseln die Medien alle 2 Tage.

2. Polarisation von HMDM

1. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die M1-Grundierungsmedien vor, indem Sie dem gesamten RPMI-1640-Kulturmedium Interferon (IFN; 20 ng/ml) und Lipopolysaccharid (LPS; 1 g/ml) zusetzen. Bereiten Sie die M2-Grundierungsmedien vor, indem Sie Interleukin 4 (IL-4; 20 ng/mL) zu den gesamten RPMI-1640-Kulturmedien hinzufügen.
2. Unter sterilen Bedingungen, Aspirat Medien aus der Gewebekultur Platte Brunnen, die die HMDM enthalten, die gesät und kultiviert wurden, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
3. Waschen Sie die Brunnen, die die Zellen enthalten, 3x mit sterilem PBS (vorgewärmt auf 37 °C) sorgfältig mit 1 ml Aliquots PBS.
4. Fügen Sie 1 ml des M1- oder M2-Grundiermediums zu jedem Brunnen hinzu, der das HMDM enthält (je nach Bedarf für das Experiment).
5. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator.

3. Stimulation von HMDM zur Induzieren von MET Release

1. Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die Kulturmedien mit verschiedenen Stimulatoren der MET-Freisetzung (je nach Experiment) auf das gesamte RPMI-1640-Medium vor: PMA (25 nM), humanes rekombinantes TNF (25 ng/mL) oder humanes Rekombinantilen (50 ng/ml) ).
2. Für Experimente mit HOCl-Stimulation bereiten Sie HOCl (200 m) in HBSS (vorgewärmt auf 37 °C), unmittelbar vor der Zugabe zu den Zellen vor. Stellen Sie sicher, dass der HOCl nicht in vollständigen Zellmedien vorbereitet ist.
   HINWEIS: Die Konzentration der Stammlösung von HOCl wird quantifiziert, indem die UV-Absorption der Lösung bei 292 nm und pH = 11⁶ gemessen und ein Aussterbekoeffizient von 350 M^-1cm^-121verwendet wird.
3. Nach der in Abschnitt 2 beschriebenen Polarisationsbehandlung die Zellmedien aus jedem Brunnen aspirieren und die Zellen 3x mit 1 ml Aliquots von entweder: sterilen PBS (für PMA, TNF und IL-8) oder HBSS (für HOCl) sorgfältig waschen, die auf 37 °C vorgewärmt wurden.
4. Für Experimente mit PMA, TNF oder IL-8: 1 ml des gesamten Mediums hinzufügen, das PMA, TNF oder IL-8 enthält, nachdem das PBS im letzten Waschschritt entfernt wurde.
5. Für Experimente mit TNF a inkubieren Sie die Zellen für 6 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator. Für Experimente mit PMA und IL-8 die Zellen 24 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator inkubieren.
6. Für Experimente mit HOCl 1 ml HOCl in HBSS hinzufügen, nachdem sie die HBSS im letzten Waschschritt entfernt haben. Dann inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator.
   1. Saugen Sie den Zellüberstand vorsichtig an und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml Aliquots von HBSS, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
   2. Nachdem Sie den HBSS aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie 1 ml vollständige RPMI-1640-Kulturmedien hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2 in einem Zellinkubator.

4. Visualisierung von MET in Live Cell Culture

1. Bereiten Sie SYTOX grünen Farbstoff in HBSS mit einer Konzentration von 40 m vor.
2. Am Ende der in Abschnitt 3 beschriebenen Behandlungen zur Induktion der MET-Freisetzung fügen Sie jedem, der HMDM enthält, direkt 25 l von 40 m des Farbstoffs zu.
3. Inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min im Dunkeln.
4. Stellen Sie das HMDM in Gewebekulturbrunnen auf die Mikroskopstufe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops für die Bildgebung.
5. Mikroskopverfahren
   1. Schalten Sie eine Breitspektrum-Leuchtstofflichtquelle, eine Hellfeldlichtquelle und ein invertiertes Mikroskop ein, das mit einer hochauflösenden Farb-Digitalkamera installiert ist (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Drehen Sie das Filterrad auf die "Zahl 2" Position für grüne Fluoreszenz (Erregung = 504 nm, Emission = 523 nm) für die Abbildung der grün gebeiztproben in den Gewebekulturbrunnen enthalten.
   3. Mit dem 5x Objektiv, fokussieren Sie das Bild mit dem groben Fokus, dann die feinen Fokusknöpfe auf dem Mikroskop, bis das Bild scharf, klar und fokussiert erscheint, wenn es durch das Mikroskop Okular betrachtet wird.
   4. Schalten Sie das Mikroskop in den Kameramodus.
   5. Starten Sie die zugehörige Software.
   6. Wählen Sie die Registerkarte Erfassen in der Software aus.
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um eine Vorschau des Bildes anzuzeigen, und passen Sie den Feinfokusknopf am Mikroskop an, bis das Bild im Software-Vorschaufenster scharf, klar und fokussiert erscheint.
   8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen.
      HINWEIS: Das aufgenommene Bild wird automatisch in der begleitenden Software angezeigt.
   9. Klicken Sie innerhalb der Software auf Datei | Speichern als erforderlicher Bilddateityp.
   10. Drehen Sie das Filterrad auf dem Mikroskop in die Position "Nummer 5" für die Lichtfeldabbildung und wiederholen Sie die Schritte 4.5.2–4.5.9, um das entsprechende Hellfeldbild zu erhalten.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.2–4.5.10, wenn dies für die nachfolgende Bildaufnahme erforderlich ist.

Hellfeldbilder, die die morphologischen Veränderungen von HMDM als Reaktion auf Reize zur Zelldifferenzierung zeigen, sind in Abbildung 1dargestellt. M1 polarisierte Makrophagen aus Experimenten mit HMDM, die IFN und LPS ausgesetzt waren, zeigten eine längliche und spindelartige Zellform, wie die schwarzen Pfeile in Abbildung 1 (mittleres Panel) zeigen. Zum Vergleich: Die Morphologie der polarisierten Makrophagen M2 nach Exposition von HMDM bei IL-4 für 48 h war in der Regel rund und flach, wie die schwarzen Pfeile in Abbildung 1 (ganz rechts).

Die Fähigkeit differenzierter HMDM-Phänotypen, METs freizusetzen, wurde durch Live-Zellfluoreszenz-Bildgebung mit SYTOX grün visualisiert, wie in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Kontrolldaten, die aus jedem HMDM-Phänotyp gewonnen wurden, der für 24 h inErbegnet, wenn keine pro-inflammatorischen Reize vorhanden sind. In diesem Fall gab es, wie erwartet, sehr begrenzte grüne Färbung, da die Zellundurchlässigkeit dieses Flecks war. Abbildung 2B zeigte eine positive Färbung für METs, die sich aus der Exposition von M1-HMDMs gegenüber HOCl, PMA, IL-8 oder TNF ergab. Die METs werden durch die weißen Pfeile angezeigt, die als grüne Streifen dargestellt werden und aus den Strängen der extrazellulären DNA resultieren. Mit HOCl, zusätzlich zur Färbung extrazellulärer DNA, gab es einige grüne Färbung in den Zellen offensichtlich. Diese zelluläre Färbung wurde auch in gewissem Maße mit den anderen Reizen beobachtet und wird geglaubt, um Verlust der Membranintegrität infolge des ET-unabhängigen Zelltodes als Folge der Behandlungsbedingungen zu reflektieren.

Abbildung 2B zeigt auch die entsprechenden Experimente, die mit M2-HMDMs durchgeführt wurden, die IL-4 ausgesetzt waren. In diesem Fall gab es keine Freisetzung von DNA aus den Zellen, wie durch das Fehlen der Stränge/Streifen der extrazellulären DNA angezeigt; jedoch gab es eine gewisse zelluläre Aufnahme von grünem Fluoreszenzfarbstoff mit dem HOCl und TNF. Zu Vergleichszwecken zeigt Abbildung 3 repräsentative Daten, die die MET-Freisetzung aus THP-1-Makrophagen anzeigen, die TNF (50 ng/ml) für 4 h ausgesetzt sind. In diesem Fall ist zu beachten, dass eine unpolarisierte Population von Zellen verwendet wurde, und die THP-1-Monozyten wurden durch Vorbehandlung mit PMA (50 ng/ml für 72 h) wie zuvorbeschrieben 22zu Makrophagen differenziert.

Abbildung 1: Morphologische Veränderungen von differenziell polarisierten HMDMs. Repräsentative Hellfeldbilder von nicht differenzierten und differenzierten HMDMs (nr. 5). HMDMs wurden 8 Tage lang mit vollständigen Medien kultiviert, die humanes Serum und Glutamin enthielten, bevor sie bei Exposition gegenüber IFN und LPS bzw. IL-4 für 48 h an den M1- oder M2-Phänotyp primaten. Pfeile zeigen Beispiele von Zellen, die morphologische Eigenschaften von M1- oder M2-HMDMs aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: METs, die von M1-HMDMs nach HOCl-, PMA-, IL-8- und TNF-Stimulation hergestellt werden. Repräsentative Bilder von SYTOX grün gebeiztEN HMDMs von (A) Nicht stimulierte M1- und M2-HMDMs, die für 24 h in Ermangelung von entzündlichen Reizen inkubiert wurden, wurden als Kontrolle verwendet, was das Fehlen einer MET-Freisetzung demonstrierte. (B) M1 und M2 HMDMs wurden mit 1) HOCl (200 m, 15 min), PMA (25 nM) oder IL-8 (50 ng/mL) mit Inkubation für 24 h oder 2) TNF (25 ng/ml) mit Inkubation für 6 h behandelt, um die MET-Freisetzung zu induzieren. METs wurden durch die Zugabe von SYTOX grün visualisiert, wie durch weiße Pfeile im oberen Panel von M1 HMDMs angezeigt. In den entsprechenden Experimenten mit M2-HMDMs wurden keine METS gesehen. Die Daten sind repräsentativ für Replizierungskulturbrunnen von n 3 Einzelspendern. Skalenbalken = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: METs, die durch nicht polarisierte THP-1-Makrophagen nach TNF-Stimulation erzeugt werden. Repräsentative Bilder von SYTOX grün gefärbten TNP-1-Makrophagen, die durch Vorbehandlung mit PMA (50 ng/ml für 72 h) differenziert wurden, bevor eine weitere Inkubation für 4 h in Abwesenheit oder Anwesenheit von TNF (50 ng/ml) zur Induzierung einer MET-Freisetzung durchgeführt wurde. METs wurden durch Zugabe von SYTOX green visualisiert. Die Daten sind repräsentativ für Replizierungskulturbrunnen aus n-3-Experimenten. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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