Zell-Zell-Fusion des Genoms bearbeitete Zelllinien zur Störung der Zellstruktur und Funktion

Die panostatische Erhaltung der Zellstruktur ist lebenswichtig. Zellen haben charakteristische Morphologien, subzelluläre Organellenzahlen und eine interne biochemische Zusammensetzung. Um zu verstehen, wie diese grundlegenden Eigenschaften erzeugt werden und wie sie während der Krankheit schief gehen, müssen Laborwerkzeuge sie stören.

Zellfusion ist das Zusammenführen von zwei oder mehr getrennten Zellen. Zellfusion kann entscheidend für die Entstehung von eukaryotischen Leben gewesen sein¹. Im menschlichen Körper ist die Zellfusion relativ selten, die bei eingeschränkten Entwicklungsbedingungen und Gewebetypen auftritt, z. B. während der Befruchtung oder der Bildung von Muskeln, Knochen und der Plazenta². Dieses Protokoll beschreibt die Induktion der Zell-Zell-Fusion in Gewebekulturzelllinien mit differenziell fluoreszierend markierten Organellen als Einumreaktion auf die Mechanismen zur Steuerung von Zellstruktur und -funktion.

In vitro induzierte Zell-Zell-Fusion ist zentral für die Produktion von monoklonalen Antikörpern³, ein wichtiges Werkzeug für die biologische Forschung und Krankheitsbehandlung. Zellfusion wurde auch verwendet, um viele verschiedene grundlegende zellbiologische Fragen über Zellzyklus Dominanz⁴, Aneuploidie^5,6, zelluläre Reprogrammierung^7,8, die Reparatur von beschädigten Neuronen⁹, virale Proliferation¹⁰, Apoptose¹¹, Tumorigenese¹², Zytoskelettdynamik¹³, und Membranfusion^14,15. Laborbasierte Methoden zur Induzieren von Zell-Zell-Fusion^16,17,18,19 induzieren Lipidmembran Koaleszenz durch die physikalische Verschmelzung von zwei Doppelschichten in einem. Zellfusion kann durch Elektrizität induziert werden¹⁸, virale Methoden¹⁷, thermoplasmonische Erwärmung²⁰, Transgenexpression¹⁹, und Chemikalien einschließlich Polyethylenglykol (PEG)^16,21,22.

Centrosomen sind Mikrotubuli, die Zentren organisieren, die zelluläre Form, Beweglichkeit, Polarisation und Teilung²³steuern. Centrosomale Wurzeln sind faserige Strukturen, die sich aus Zentrosomen erstrecken, die das Protein Rootletin²⁴ enthalten (kodiert durch das Gen CROCC). Wir haben vor kurzem zell-Zell-Fusion verwendet, um zu verstehen, wie zentromische Position und Anzahl innerhalb von Heterokaryonen im Vergleich zu den Elternzellen^{variiert 24}. Der Grund für die Verwendung dieser Methode ist es, die Ursprungszelle von Wurzeln innerhalb eines Heterokaryons nach der Fusion von differenziell fluoreszierend markierten Elternzellen zu verfolgen und damit Organellefusion und -spaltung zu bilden. Die fluoreszierend getaggten Proteine rootletin-meGFP oder rootletin-mScarlet-I entstehen durch Genombearbeitung in separaten Zelllinien, die dann durch PEG-vermittelte Zellfusion verschmolzen werden. Wir beschreiben die Verwendung von Zellfarbstoffen (Materialtabelle) zur Identifizierung von geschmolzenen Zellen durch Durchflusszytometrie und anschließende Fluoreszenzmikroskopie-Identifikation von Zentromitenzelle und Morphologie (Abbildung 1). Dieser Ansatz ist eine robuste und einzigartige Methode, um zu untersuchen, wie große Veränderungen im Zellzustand einschließlich Organelle Zahl auf Zellhomöostase einwirken.

1. Differential fluoreszierende Zellkennzeichnung

1. Gen-Tagging mit CRISPR Cas9
   1. Verwenden Sie CRISPR Cas9 Genombearbeitung, um Rootletin (oder andere Gene von Interesse) mit den fluoreszierenden Proteinen meGFP oder mScarlet-I in menschlichen Krebszelllinien zu markieren.
      HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Genombearbeitung werden an anderer Stelle behandelt^24,25,26.
2. Fluoreszierende Farbstoffkennzeichnung
   1. Wachsen Sie Cal51 menschliche Krebszellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), L-Glutamin und 100 g/ml Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
      HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass Zellen regelmäßig auf das Fehlen einer Mykoplasmenkontamination und auf die Identität der Zelllinie überprüft werden. Verwenden Sie keine Zellen, die in der Kultur ausführlich durchdrungen wurden (>15 Passagen). Zellen müssen gesund sein und exponentiell wachsen. Vermeiden Sie Unter- oder Überkonfluenz.
   2. Säen Sie jeden Zelltyp (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I und elterliche, nicht markierte Cal51-Zellen), so dass am nächsten Tag für jede Probe 6 x 10⁶ Zellen bei einer Konfluenz von 70 bis 90 % vorhanden sind.
      HINWEIS: Dies ist etwa ein T75 Gewebekulturkolben oder eine 10 cm Schale pro Zelltyp. Die nicht markierten Zellen der Eltern werden später im Protokoll als negative Scontrol benötigt. Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion von 20.000 geschmolzenen Zellen, aber diese Anzahl könnte durch Dieskalierung des Protokolls mit einer erhöhten Anzahl von Batches erhöht werden.
   3. Am nächsten Tag DMEM, Trypsin und 1x Phosphat-gepufferte Salzsäure (PBS) vorwärmen, indem man sie in ein Wasserbad bei 37 °C legt.
   4. Waschen Sie Rootletin-meGFP und Rootletin-mScarlet-I-Zellen 2x in PBS, indem Sie Medium gießen oder ansipirieren und durch 10 ml PBS ersetzen.
   5. Label Cal51 rootletin-meGFP Zellen durch Zugabe von 500 nM violetten Zellfarbstoff (Materialtabelle) in PBS für 1 min bei Raumtemperatur (RT).
   6. Beschriften Sie Cal51 rootletin-mScarlet-I Zellen, indem Sie 200 nM far red cell farbstoff (Table of Materials) in PBS für 1 min bei RT hinzufügen.
      HINWEIS: Halten Sie Proben nach möglichst fluoreszierender Färbung vor Licht geschützt, um Photobleichungen der Fluoreszenz zu vermeiden.
   7. Beenden Sie die Farbkennzeichnungsreaktionen, indem Sie 10 ml DMEM für 5 min hinzufügen.
   8. Entfernen Sie nicht beschriftete elterliche Cal51-Zellen aus dem Inkubator (ab Schritt 1.2.2).
      HINWEIS: Diese Zellen werden später als nicht beschriftete Negativsteuerelemente verwendet (Schritt 3.3.2).
   9. Waschen Sie alle Zellen einmal, indem Sie das Wachstumsmedium ausgießen und durch 10 ml PBS ersetzen.
   10. PBS abgießen und 5 min bei Kulturbedingungen mit 1 ml vorgewärmtem 1x Trypsin bebrüten.
   11. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml Kunststoffkonische Rohr und Zentrifuge bei 1000 x g für 5 min.
   12. Trypsin vorsichtig mit einer Pipette aus dem Zellpellet entfernen und entsorgen.
   13. Die violetten und weit rot beschrifteten Zellpellets in 1 ml PBS vorsichtig wieder aufhängen.
   14. Das elterliche (nicht fluoreszierende) Zellpellet in 1 ml DMEM vorsichtig wieder aufsetzen und zum Inkubator zurückkehren.
       HINWEIS: Diese Probe wird nicht zellzelllig fusioniert, sondern später während der Durchflusszytometrie verwendet.

2. Zellzellfusion

1. Mischen Sie 3 x 10⁶ violett beschriftete Zellen mit 3 x 10⁶ weit rot beschrifteten Zellen in einem 15 ml Rohr, indem Sie mit einer 1 ml Pipette 0,5 ml jedes Zelltyps sanft zusammenführen.
2. Zentrifugieren Sie die verbleibenden ungemischten Zellen aus Schritt 2.1 bei 1.000 x g für 5 min, gießen Sie dann PBS ab, setzen Sie das Pellet in 1 ml DMEM wieder auf und kehren Sie zum Inkubator zurück.
   HINWEIS: Diese verbleibenden nicht gemischten einzelgekennzeichneten Proben werden später als Negativ- und Kompensationskontrollen in Abschnitt 3 des Protokolls verwendet.
3. Zentrifugieren Sie die Mischzellen ab Schritt 2.1 bei 1.000 x g für 5 min und saugen Sie PBS mit einer 1 ml Pipette sorgfältig an.
4. Fügen Sie 0,7 ml 50% 1450 PEG-Lösung in tropfenweiseer Weise zum Zellpellet (Schritt 2.3) mit einer 1 ml Pipette über einen Zeitraum von 30 s hinzu.
5. Lassen Sie für 3,5 min bei RT.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit mit PEG kann je nach Zelltyp optimiert werden, obwohl beachten Sie, dass längere Inkubationszeit die Zelltoxizität erhöht.
6. 10 ml serumfreies DMEM tropfenweise für 30 s hinzufügen und 10 min im Inkubator lassen.
7. Drehen Sie bei 1.000 x g für 5 min, entsorgen Überstand, und wieder sanft in 1 ml des vollständigen Mediums (DMEM enthält FBS).
   HINWEIS: Fahren Sie direkt mit Abschnitt 3 fort. Es gibt Toxizität im Zusammenhang mit PEG-Exposition gefolgt von Durchflusszytometrie und Bildgebung, so halten Sie Zellen in Kulturbedingungen so weit wie möglich, indem Sie schnell zwischen den Schritten.

3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zur Anreicherung von geschmolzenen Zellen

1. Bereiten Sie alle Zellen auf die Durchflusszytometrie vor, indem Sie jede Probe vorsichtig einzeln durch einen 70-mm-Filter in ein FACS-Rohr pipetieren.
   HINWEIS: Es werden vier Proben benötigt: verschmolzene Zellen, einzelne markierte weit rote Zellen, einzelne markierte violette Zellen, nicht beschriftete Elternzellen. Einmal aus der sterilen Gewebekulturhaube entfernt, haben Zellen die Fähigkeit, sich zu infizieren, so minimieren Sie die Expositionszeit von Proben in einer nicht-sterilen Umgebung von hier an. Die Zellen werden in einem kompletten DMEM-Medium sortiert.
2. Verwenden Sie ein Zytometer, das eine Einzelzellensortierung kann.
   1. Richten Sie den Zellensortierer für eine aseptische Sortierung ein. Führen Sie die Gerätequalitätskontrolle gemäß der Empfehlung des Herstellers durch.
   2. Zeichnen Sie ein Diagramm von Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung und ein doppeltes Diskriminierungsdiagramm.
3. Erstellen Sie Gates, um verschmolzene Zellen zu identifizieren.
   1. Erregen Sie die fluoreszierenden Farbstoffe bei Wellenlängen von 405 nm und 635 nm. Bei 450 nm bzw. 660 nm (violette bzw. weitrote Wellenlängen) zu erkennen. Zeichnen Sie weit rote versus violette Wellenlängen.
   2. Führen Sie unbeschriftete Elternzellen durch das Zytometer und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität auf.
      HINWEIS: Werte oberhalb dieser Basislinie definieren die Positivität für die Färbefärbung.
   3. Führen Sie einzelne markierte violette Zellen durch das Zytometer. Bestätigen Sie, dass es kein Übertreten von Violett in den weit roten Kanal gibt.
   4. Führen Sie einzelne markierte, weit rote Zellen durch das Zytometer und bestätigen Sie, dass es kein Übertreten von weit rot in den violetten Kanal gibt.
      HINWEIS: Für die dargestellten repräsentativen Daten wurden die Zellen mit 20 psi auf einem Sortierer sortiert, der mit einer 100-m-Düse ausgestattet war.
   5. Führen Sie die Fusionsprobe kurz aus, um zu bestätigen, dass verschmolzene Zellen mit den in Schritt 3.3 erstellten Toren sichtbar sind.
4. Richten Sie den Sortierstrom zentral in eine 8-Well-Bildform aus.
5. FACS sortieren verschmolzene Zellen, die als doppelt positive violette und weit rot markierte Zellen direkt in eine 8-Well-Bildform mit 100 l Wachstumsmedium vorliegen.
   HINWEIS: Die empfohlene maximale Anzahl von Zellen beträgt 50.000 USD pro 8-Well-Schale. Stellen Sie die Zellintegrität während der Sortierung sicher. Die Zellkonfluenz kann die Zellgesundheit beeinflussen, sodass die Zellen nach der Sortierung zwischen 20 und 90 % konfluenz bleiben, indem Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen für die bildgebende Schale sortieren. Jedes sortierte Tröpfchen enthält ca. 3 nL Mantelflüssigkeit. Stellen Sie sicher, dass Diemantelflüssigkeit das Wachstumsmedium während der Sortierung nicht signifikant verdünnt.
6. Direkt nach der Sortierung die Zellen zurück zum Inkubator nehmen und für >2 h oder über Nacht verlassen.
   HINWEIS: Anhaftende Zellen werden während dieser Zeit nach und nach wieder am Deckschrutsch haften, und daher ändert sich ihre Morphologie im Laufe der Zeit, wenn sie direkt zum Mikroskop gebracht wird.

4. Immunfluoreszierende Färbung und Bildgebung von Zellzellfusionen

HINWEIS: Geschmolzene Zellen können live oder nach der Fixierung und weiteren fluoreszierenden Färbungen (oder beidem) abgebildet werden, abhängig von den erforderlichen Experimenten und Messungen.

1. Live-Zell-Bildgebung
   1. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch ein Bildmedium ohne Phenolrot (Materialtabelle) und gehen Sie direkt zur Bildgebung über.
2. Befestigung und Färbung
   1. Frisches 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS zubereiten.
   2. Fixieren Sie Zellen, indem Sie sie in 100 l von 4% PFA für 15 min bei RT inkubieren. PfA nach 15 min entfernen.
      ACHTUNG: PFA ist giftig, wenn es eingeatmet wird, daher sollte dieser Schritt in einer Dunstabzugshaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
      HINWEIS: Nach der Fixierung kann das Experiment angehalten und bei Bedarf später neu gestartet werden. Bewahren Sie die Probe bei Bedarf bei 4 °C vor Licht schutzgeschützt auf.
   3. Waschen Sie zellen 3x in 200 l PBS bei RT.
   4. Permeabilisieren Sie Zellen für 10 min bei RT in 200 l von 0,1% nichtionischem Tensid (Materialtabelle) und 0,1% nichtionischem Reinigungsmittel (Materialtabelle) in PBS verdünnt.
   5. Block in 200 l von 3% Rinderserumalbumin in PBS für 30 min bei RT.
   6. Inkubieren Sie mit Antikörpern in 150 l PBS, die 3% Rinderserumalbumin und 0,1% nichtionisches Tensid und 0,05% nichtionisches Reinigungsmittel für 1 h bei RT enthalten.
      HINWEIS: Die primären Antikörper, die zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet werden, sind fluoreszierend konjugierter Anti-GFP-Nanokörper (verwendet bei 1:400 Verdünnung) und fluoreszierend konjugierter Anti-MScarlet-I-Nanokörper (verwendet bei 1:500 Verdünnung). Diese verstärken das Signal der bereits fluoreszierenden Proteine.
   7. 2x für 5 min in 300 l PBS waschen und dann in 200 l PBS abgeben.
      HINWEIS: Samples werden in PBS abgebildet. Proben können bei 4 °C vor Licht geschützt gelagert werden.
3. Bildaufnahme
   1. Erfassen Sie Bilder mit einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop, das vierfarbige Bildgebung simperbar ist (z. B. konfokale, breitfeldige, strukturierte Beleuchtung).
   2. Excite meGFP und mScarlet-I Kanäle mit 488 nm bzw. 561 nm Wellenlängenlasern. Stellen Sie Detektoren so ein, dass sie auf 505 x 550 nm und 590 bis 650 nm detektieren. Excite violette und weit rote Farbkanäle mit 405 nm bzw. 633 nm Lasern. Stellen Sie Detektoren so ein, dass sie bei 430 bis 500 nm und 660 bis 750 nm detektoren werden.
   3. Empirisch bestimmen Laserintensität, so dass signifikante Photobleichungen nicht auftreten und Zellen gesund bleiben (wenn Live-Zell-Bildgebung).
   4. Empirisch bestimmen, dass das Signal so erreicht wird, dass pixelwerte sättlich oder künstlich abgeschnitten werden.
   5. Sammeln Sie Z-Stack-Daten, sodass die Bilder dreidimensional sind und einen Bereich von 20 bis 60 m bei einer Schrittgröße von 500 m abdecken.
      HINWEIS: Die in repräsentativen Daten dargestellten Bilder wurden entweder konfokale (Abbildung 2B), Airyscan (Abbildung 2C) oder strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (Abbildung 2D) aufgenommen. Jede Zelle ist ein gutgläubiges Heterokaryon, wenn es sowohl violette als auch weit rote Farbstoffe enthält, die sich im Zytoplasma überlappen.

Entsprechend gekennzeichnete Zellen sind während der Durchflusszytometrie durch Fluoreszenzsignal sichtbar, das höher ist als unbeschriftete Kontrollzellen (Abbildung 2A). Für die Sortierung doppelt positiver Zellen werden Tore für die Sortierung doppeltpositiver Zellen gesetzt, die diese Population direkt zu bildgebenden Gerichten für weitere mikroskopische Analysen anreichern. Geschmolzene Zellen sind als ausgeprägte doppelt fluoreszierend positive Zellen nachweisbar und machen etwa 1 % der Bevölkerung aus.

Fusion induziert eine größere Neuanordnung der zellulären Architektur durch Mischen von zwei Zellen in eine (Abbildung 2B). Heterokaryonen werden auf dem Mikroskop als Zellen identifiziert, die beide fluoreszierenden Farbstoffsignale enthalten, die in einer einzigen Zelle gemischt werden (ohne dazwischen liegende Plasmamembranen). Zusätzlich können zwei Kerne in geschmolzenen Zellen durch Hellfeld-/Differentialinterferenzkontrast oder Fluoreszenz-Bildgebung sichtbar sein. Beachten Sie, dass Triploid oder andere hoch polyploide Zustände zusätzlich zu diploiden Fusionen jedoch möglich sind, und so sollte das Farbsignal von zwei Farben verwendet werden, um die Identität von geschmolzenen Zellen zu bestätigen.

Zellstruktur und Funktion werden durch die Verschmelzung von Zellen, die meGFP und mScarlet-I markierte Proteine enthalten, weiter untersucht. Die Fusion führt zu einer Verdoppelung der Zentrominzahl in Heterokaryonen, die sich aus der Verschmelzung zweier Zellen ergibt. Wenn also Zellen mit fluoreszierend gekennzeichneten Zentrosomen verschmolzen sind, werden mindestens vier perizentrriolare Materialfoci beobachtet, wenn die zentromsome pericentriolar Komponente NEDD1 fluoreszierend markiert ist (NEDD1-mRuby3; Abbildung 2C). Durch die Fusion von Zellen mit endogen fluoreszierend getaggtem Rootletin (Rootletin-meGFP und Rootletin-mScarlet-I) kann die Ursprungszelle jedes Zentromes in einem Heterokaryon identifiziert werden. Rootletin in zentrosomalen Wurzeln hat einen begrenzten Diffusionsumsatz24und ist daher als deutlich gefärbte Fasern in Heterokaryonen vorhanden, die mit Fluoreszenzmikroskopie dargestellt sind (Abbildung 2D).

Abbildung 1: Zell-Zell-Fusion und Fluoreszenz-Bildgebung experimenteller Workflow. Schemat des vierstufigen experimentellen Workflows. (1) Zwei Zellpopulationen sind mit Farbstoffen und fluoreszierenden Fusionsproteinen differenziell gekennzeichnet. Cyan steht für Färbung mit violettem Zellfarbstoff und Magenta für Färbung mit weit roten Zellfarbstoffen. Grün steht für meGFP-Tagging und rot für mScarlet-I-Tagging. (2) Zellen werden durch Inkubation mit Polyethylenglykol verschmolzen. (3) Geschmolzene Zellen werden durch Durchflusszytometrie angereichert, die die doppelt fluoreszierend positiven Zellen (far rot und violett) sortieren. (4) Geschmolzene Zellen werden durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um zu verstehen, wie zelluläre Struktur und Funktion verändert werden (Bildgebung der grünen und roten Kanäle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Durchflusszytometrieanreicherung und fluoreszierende Bildgebung von geschmolzenen Zellen. (A) Repräsentative Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Sortierung von geschmolzenen Zellen. Geschmolzene Zellen, die doppelt fluoreszierend sind, werden durch das schwarze Quadrat angezeigt. (B) Repräsentative konfokale Fluoreszenzmikroskopie von geschmolzenen Zellen, doppelt mit violetten und weit roten Farbstoffen gekennzeichnet. Gezeigt werden Beispiele für erfolgreich verschmolzene Zellen, die entweder tetraploid oder hexaploid sind (obere bzw. untere Platten). Scale bar = 10 m . (C) Repräsentative lebende Zelle Airyscan konfokale Bildgebung von Zentrosomen in einer einzigen geschmolzenen Zelle, die endogen markierte zentrosomale Wurzeln (Rootletin-meGFP) und zentrsomales pericentriolarmaterial (NEDD1-mRuby3) enthält. Scale bar = 1 m . (D) Zellen, die endogen getaggt rootletin-meGFP exzessierten, wurden mit Zellen verschmolzen, die endogen getaggtes Rootletin-mScarlet-I exdrücken. Die Zellen wurden durch strukturierte Beleuchtungsmikroskopie fixiert und gebeizt und abgebildet. Gezeigt wird eine maximale Intensität z-Projektion von Zentrosomen in einer geschmolzenen Zelle. Skala bar = 1 m. Panel D wurde von Mahen24 mit Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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