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Methodenartikel

Zell-Zell-Fusion des Genoms bearbeitete Zelllinien zur Störung der Zellstruktur und Funktion

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⸱

DOI:

10.3791/60550

⸱

7. Dezember 2019

 , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, zwei verschiedene Zelltypen zu verschmelzen, um Hybridzellen zu erstellen. Die Fluoreszenzmikroskopie-Analyse von geschmolzenen Zellen wird verwendet, um die Ursprungszelle von Zellorganellen zu verfolgen. Dieser Test kann verwendet werden, um zu erforschen, wie Zellstruktur und Funktion auf Störungen durch Zellfusion reagieren.

Zusammenfassung

Das Leben ist räumlich in Lipidmembranen aufgeteilt, um die isolierte Bildung von unterschiedlichen molekularen Zuständen in Zellen und Organellen zu ermöglichen. Zellfusion ist die Verschmelzung von zwei oder mehr Zellen zu einer einzelnen Zelle. Hier stellen wir ein Protokoll zur Zellfusion von zwei verschiedenen Zelltypen bereit. Geschmolzene Hybridzellen werden durch strömungszytometriebasierte Sortierung angereichert, gefolgt von der Fluoreszenzmikroskopie der Hybridzellstruktur und -funktion. Fluoreszierend markierte Proteine, die durch genomische Bearbeitung erzeugt werden, werden in geschmolzenen Zellen abgebildet, so dass zelluläre Strukturen anhand der Fluoreszenzemission identifiziert und auf den Zelltyp des Ursprungs verwiesen werden können. Diese robuste und allgemeine Methode kann auf verschiedene Zelltypen oder Organellen von Interesse angewendet werden, um zelluläre Struktur und Funktion über eine Reihe von grundlegenden biologischen Fragen zu verstehen.

Einleitung

Die panostatische Erhaltung der Zellstruktur ist lebenswichtig. Zellen haben charakteristische Morphologien, subzelluläre Organellenzahlen und eine interne biochemische Zusammensetzung. Um zu verstehen, wie diese grundlegenden Eigenschaften erzeugt werden und wie sie während der Krankheit schief gehen, müssen Laborwerkzeuge sie stören.

Zellfusion ist das Zusammenführen von zwei oder mehr getrennten Zellen. Zellfusion kann entscheidend für die Entstehung von eukaryotischen Leben gewesen sein1. Im menschlichen Körper ist die Zellfusion relativ selten, die bei eingeschränkten Entwicklungsbedingungen und Gewebetypen auftritt, z. B. während der Befruchtung oder der Bildung von Muskeln, Knochen und der Plazenta2. Dieses Protokoll beschreibt die Induktion der Zell-Zell-Fusion in Gewebekulturzelllinien mit differenziell fluoreszierend markierten Organellen als Einumreaktion auf die Mechanismen zur Steuerung von Zellstruktur und -funktion.

In vitro induzierte Zell-Zell-Fusion ist zentral für die Produktion von monoklonalen Antikörpern3, ein wichtiges Werkzeug für die biologische Forschung und Krankheitsbehandlung. Zellfusion wurde auch verwendet, um viele verschiedene grundlegende zellbiologische Fragen über Zellzyklus Dominanz4, Aneuploidie5,6, zelluläre Reprogrammierung7,8, die Reparatur von beschädigten Neuronen9, virale Proliferation10, Apoptose11, Tumorigenese12, Zytoskelettdynamik13, und Membranfusion14,15. Laborbasierte Methoden zur Induzieren von Zell-Zell-Fusion16,17,18,19 induzieren Lipidmembran Koaleszenz durch die physikalische Verschmelzung von zwei Doppelschichten in einem. Zellfusion kann durch Elektrizität induziert werden18, virale Methoden17, thermoplasmonische Erwärmung20, Transgenexpression19, und Chemikalien einschließlich Polyethylenglykol (PEG)16,21,22.

Centrosomen sind Mikrotubuli, die Zentren organisieren, die zelluläre Form, Beweglichkeit, Polarisation und Teilung23steuern. Centrosomale Wurzeln sind faserige Strukturen, die sich aus Zentrosomen erstrecken, die das Protein Rootletin24 enthalten (kodiert durch das Gen CROCC). Wir haben vor kurzem zell-Zell-Fusion verwendet, um zu verstehen, wie zentromische Position und Anzahl innerhalb von Heterokaryonen im Vergleich zu den Elternzellenvariiert 24. Der Grund für die Verwendung dieser Methode ist es, die Ursprungszelle von Wurzeln innerhalb eines Heterokaryons nach der Fusion von differenziell fluoreszierend markierten Elternzellen zu verfolgen und damit Organellefusion und -spaltung zu bilden. Die fluoreszierend getaggten Proteine rootletin-meGFP oder rootletin-mScarlet-I entstehen durch Genombearbeitung in separaten Zelllinien, die dann durch PEG-vermittelte Zellfusion verschmolzen werden. Wir beschreiben die Verwendung von Zellfarbstoffen (Materialtabelle) zur Identifizierung von geschmolzenen Zellen durch Durchflusszytometrie und anschließende Fluoreszenzmikroskopie-Identifikation von Zentromitenzelle und Morphologie (Abbildung 1). Dieser Ansatz ist eine robuste und einzigartige Methode, um zu untersuchen, wie große Veränderungen im Zellzustand einschließlich Organelle Zahl auf Zellhomöostase einwirken.

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Protokoll

1. Differential fluoreszierende Zellkennzeichnung

  1. Gen-Tagging mit CRISPR Cas9
    1. Verwenden Sie CRISPR Cas9 Genombearbeitung, um Rootletin (oder andere Gene von Interesse) mit den fluoreszierenden Proteinen meGFP oder mScarlet-I in menschlichen Krebszelllinien zu markieren.
      HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Genombearbeitung werden an anderer Stelle behandelt24,25,26.
  2. Fluoreszierende Farbstoffkennzeichnung
    1. Wachsen Sie Cal51 menschliche Krebszellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), L-Glutamin und 100 g/ml Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
      HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass Zellen regelmäßig auf das Fehlen einer Mykoplasmenkontamination und auf die Identität der Zelllinie überprüft werden. Verwenden Sie keine Zellen, die in der Kultur ausführlich durchdrungen wurden (>15 Passagen). Zellen müssen gesund sein und exponentiell wachsen. Vermeiden Sie Unter- oder Überkonfluenz.
    2. Säen Sie jeden Zelltyp (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I und elterliche, nicht markierte Cal51-Zellen), so dass am nächsten Tag für jede Probe 6 x 106 Zellen bei einer Konfluenz von 70 bis 90 % vorhanden sind.
      HINWEIS: Dies ist etwa ein T75 Gewebekulturkolben oder eine 10 cm Schale pro Zelltyp. Die nicht markierten Zellen der Eltern werden später im Protokoll als negative Scontrol benötigt. Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion von 20.000 geschmolzenen Zellen, aber diese Anzahl könnte durch Dieskalierung des Protokolls mit einer erhöhten Anzahl von Batches erhöht werden.
    3. Am nächsten Tag DMEM, Trypsin und 1x Phosphat-gepufferte Salzsäure (PBS) vorwärmen, indem man sie in ein Wasserbad bei 37 °C legt.
    4. Waschen Sie Rootletin-meGFP und Rootletin-mScarlet-I-Zellen 2x in PBS, indem Sie Medium gießen oder ansipirieren und durch 10 ml PBS ersetzen.
    5. Label Cal51 rootletin-meGFP Zellen durch Zugabe von 500 nM violetten Zellfarbstoff (Materialtabelle) in PBS für 1 min bei Raumtemperatur (RT).
    6. Beschriften Sie Cal51 rootletin-mScarlet-I Zellen, indem Sie 200 nM far red cell farbstoff (Table of Materials) in PBS für 1 min bei RT hinzufügen.
      HINWEIS: Halten Sie Proben nach möglichst fluoreszierender Färbung vor Licht geschützt, um Photobleichungen der Fluoreszenz zu vermeiden.
    7. Beenden Sie die Farbkennzeichnungsreaktionen, indem Sie 10 ml DMEM für 5 min hinzufügen.
    8. Entfernen Sie nicht beschriftete elterliche Cal51-Zellen aus dem Inkubator (ab Schritt 1.2.2).
      HINWEIS: Diese Zellen werden später als nicht beschriftete Negativsteuerelemente verwendet (Schritt 3.3.2).
    9. Waschen Sie alle Zellen einmal, indem Sie das Wachstumsmedium ausgießen und durch 10 ml PBS ersetzen.
    10. PBS abgießen und 5 min bei Kulturbedingungen mit 1 ml vorgewärmtem 1x Trypsin bebrüten.
    11. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml Kunststoffkonische Rohr und Zentrifuge bei 1000 x g für 5 min.
    12. Trypsin vorsichtig mit einer Pipette aus dem Zellpellet entfernen und entsorgen.
    13. Die violetten und weit rot beschrifteten Zellpellets in 1 ml PBS vorsichtig wieder aufhängen.
    14. Das elterliche (nicht fluoreszierende) Zellpellet in 1 ml DMEM vorsichtig wieder aufsetzen und zum Inkubator zurückkehren.
      HINWEIS: Diese Probe wird nicht zellzelllig fusioniert, sondern später während der Durchflusszytometrie verwendet.

2. Zellzellfusion

  1. Mischen Sie 3 x 106 violett beschriftete Zellen mit 3 x 106 weit rot beschrifteten Zellen in einem 15 ml Rohr, indem Sie mit einer 1 ml Pipette 0,5 ml jedes Zelltyps sanft zusammenführen.
  2. Zentrifugieren Sie die verbleibenden ungemischten Zellen aus Schritt 2.1 bei 1.000 x g für 5 min, gießen Sie dann PBS ab, setzen Sie das Pellet in 1 ml DMEM wieder auf und kehren Sie zum Inkubator zurück.
    HINWEIS: Diese verbleibenden nicht gemischten einzelgekennzeichneten Proben werden später als Negativ- und Kompensationskontrollen in Abschnitt 3 des Protokolls verwendet.
  3. Zentrifugieren Sie die Mischzellen ab Schritt 2.1 bei 1.000 x g für 5 min und saugen Sie PBS mit einer 1 ml Pipette sorgfältig an.
  4. Fügen Sie 0,7 ml 50% 1450 PEG-Lösung in tropfenweiseer Weise zum Zellpellet (Schritt 2.3) mit einer 1 ml Pipette über einen Zeitraum von 30 s hinzu.
  5. Lassen Sie für 3,5 min bei RT.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit mit PEG kann je nach Zelltyp optimiert werden, obwohl beachten Sie, dass längere Inkubationszeit die Zelltoxizität erhöht.
  6. 10 ml serumfreies DMEM tropfenweise für 30 s hinzufügen und 10 min im Inkubator lassen.
  7. Drehen Sie bei 1.000 x g für 5 min, entsorgen Überstand, und wieder sanft in 1 ml des vollständigen Mediums (DMEM enthält FBS).
    HINWEIS: Fahren Sie direkt mit Abschnitt 3 fort. Es gibt Toxizität im Zusammenhang mit PEG-Exposition gefolgt von Durchflusszytometrie und Bildgebung, so halten Sie Zellen in Kulturbedingungen so weit wie möglich, indem Sie schnell zwischen den Schritten.

3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zur Anreicherung von geschmolzenen Zellen

  1. Bereiten Sie alle Zellen auf die Durchflusszytometrie vor, indem Sie jede Probe vorsichtig einzeln durch einen 70-mm-Filter in ein FACS-Rohr pipetieren.
    HINWEIS: Es werden vier Proben benötigt: verschmolzene Zellen, einzelne markierte weit rote Zellen, einzelne markierte violette Zellen, nicht beschriftete Elternzellen. Einmal aus der sterilen Gewebekulturhaube entfernt, haben Zellen die Fähigkeit, sich zu infizieren, so minimieren Sie die Expositionszeit von Proben in einer nicht-sterilen Umgebung von hier an. Die Zellen werden in einem kompletten DMEM-Medium sortiert.
  2. Verwenden Sie ein Zytometer, das eine Einzelzellensortierung kann.
    1. Richten Sie den Zellensortierer für eine aseptische Sortierung ein. Führen Sie die Gerätequalitätskontrolle gemäß der Empfehlung des Herstellers durch.
    2. Zeichnen Sie ein Diagramm von Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung und ein doppeltes Diskriminierungsdiagramm.
  3. Erstellen Sie Gates, um verschmolzene Zellen zu identifizieren.
    1. Erregen Sie die fluoreszierenden Farbstoffe bei Wellenlängen von 405 nm und 635 nm. Bei 450 nm bzw. 660 nm (violette bzw. weitrote Wellenlängen) zu erkennen. Zeichnen Sie weit rote versus violette Wellenlängen.
    2. Führen Sie unbeschriftete Elternzellen durch das Zytometer und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität auf.
      HINWEIS: Werte oberhalb dieser Basislinie definieren die Positivität für die Färbefärbung.
    3. Führen Sie einzelne markierte violette Zellen durch das Zytometer. Bestätigen Sie, dass es kein Übertreten von Violett in den weit roten Kanal gibt.
    4. Führen Sie einzelne markierte, weit rote Zellen durch das Zytometer und bestätigen Sie, dass es kein Übertreten von weit rot in den violetten Kanal gibt.
      HINWEIS: Für die dargestellten repräsentativen Daten wurden die Zellen mit 20 psi auf einem Sortierer sortiert, der mit einer 100-m-Düse ausgestattet war.
    5. Führen Sie die Fusionsprobe kurz aus, um zu bestätigen, dass verschmolzene Zellen mit den in Schritt 3.3 erstellten Toren sichtbar sind.
  4. Richten Sie den Sortierstrom zentral in eine 8-Well-Bildform aus.
  5. FACS sortieren verschmolzene Zellen, die als doppelt positive violette und weit rot markierte Zellen direkt in eine 8-Well-Bildform mit 100 l Wachstumsmedium vorliegen.
    HINWEIS: Die empfohlene maximale Anzahl von Zellen beträgt 50.000 USD pro 8-Well-Schale. Stellen Sie die Zellintegrität während der Sortierung sicher. Die Zellkonfluenz kann die Zellgesundheit beeinflussen, sodass die Zellen nach der Sortierung zwischen 20 und 90 % konfluenz bleiben, indem Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen für die bildgebende Schale sortieren. Jedes sortierte Tröpfchen enthält ca. 3 nL Mantelflüssigkeit. Stellen Sie sicher, dass Diemantelflüssigkeit das Wachstumsmedium während der Sortierung nicht signifikant verdünnt.
  6. Direkt nach der Sortierung die Zellen zurück zum Inkubator nehmen und für >2 h oder über Nacht verlassen.
    HINWEIS: Anhaftende Zellen werden während dieser Zeit nach und nach wieder am Deckschrutsch haften, und daher ändert sich ihre Morphologie im Laufe der Zeit, wenn sie direkt zum Mikroskop gebracht wird.

4. Immunfluoreszierende Färbung und Bildgebung von Zellzellfusionen

HINWEIS: Geschmolzene Zellen können live oder nach der Fixierung und weiteren fluoreszierenden Färbungen (oder beidem) abgebildet werden, abhängig von den erforderlichen Experimenten und Messungen.

  1. Live-Zell-Bildgebung
    1. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch ein Bildmedium ohne Phenolrot (Materialtabelle) und gehen Sie direkt zur Bildgebung über.
  2. Befestigung und Färbung
    1. Frisches 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS zubereiten.
    2. Fixieren Sie Zellen, indem Sie sie in 100 l von 4% PFA für 15 min bei RT inkubieren. PfA nach 15 min entfernen.
      ACHTUNG: PFA ist giftig, wenn es eingeatmet wird, daher sollte dieser Schritt in einer Dunstabzugshaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
      HINWEIS: Nach der Fixierung kann das Experiment angehalten und bei Bedarf später neu gestartet werden. Bewahren Sie die Probe bei Bedarf bei 4 °C vor Licht schutzgeschützt auf.
    3. Waschen Sie zellen 3x in 200 l PBS bei RT.
    4. Permeabilisieren Sie Zellen für 10 min bei RT in 200 l von 0,1% nichtionischem Tensid (Materialtabelle) und 0,1% nichtionischem Reinigungsmittel (Materialtabelle) in PBS verdünnt.
    5. Block in 200 l von 3% Rinderserumalbumin in PBS für 30 min bei RT.
    6. Inkubieren Sie mit Antikörpern in 150 l PBS, die 3% Rinderserumalbumin und 0,1% nichtionisches Tensid und 0,05% nichtionisches Reinigungsmittel für 1 h bei RT enthalten.
      HINWEIS: Die primären Antikörper, die zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet werden, sind fluoreszierend konjugierter Anti-GFP-Nanokörper (verwendet bei 1:400 Verdünnung) und fluoreszierend konjugierter Anti-MScarlet-I-Nanokörper (verwendet bei 1:500 Verdünnung). Diese verstärken das Signal der bereits fluoreszierenden Proteine.
    7. 2x für 5 min in 300 l PBS waschen und dann in 200 l PBS abgeben.
      HINWEIS: Samples werden in PBS abgebildet. Proben können bei 4 °C vor Licht geschützt gelagert werden.
  3. Bildaufnahme
    1. Erfassen Sie Bilder mit einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop, das vierfarbige Bildgebung simperbar ist (z. B. konfokale, breitfeldige, strukturierte Beleuchtung).
    2. Excite meGFP und mScarlet-I Kanäle mit 488 nm bzw. 561 nm Wellenlängenlasern. Stellen Sie Detektoren so ein, dass sie auf 505 x 550 nm und 590 bis 650 nm detektieren. Excite violette und weit rote Farbkanäle mit 405 nm bzw. 633 nm Lasern. Stellen Sie Detektoren so ein, dass sie bei 430 bis 500 nm und 660 bis 750 nm detektoren werden.
    3. Empirisch bestimmen Laserintensität, so dass signifikante Photobleichungen nicht auftreten und Zellen gesund bleiben (wenn Live-Zell-Bildgebung).
    4. Empirisch bestimmen, dass das Signal so erreicht wird, dass pixelwerte sättlich oder künstlich abgeschnitten werden.
    5. Sammeln Sie Z-Stack-Daten, sodass die Bilder dreidimensional sind und einen Bereich von 20 bis 60 m bei einer Schrittgröße von 500 m abdecken.
      HINWEIS: Die in repräsentativen Daten dargestellten Bilder wurden entweder konfokale (Abbildung 2B), Airyscan (Abbildung 2C) oder strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (Abbildung 2D) aufgenommen. Jede Zelle ist ein gutgläubiges Heterokaryon, wenn es sowohl violette als auch weit rote Farbstoffe enthält, die sich im Zytoplasma überlappen.

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Ergebnisse

Entsprechend gekennzeichnete Zellen sind während der Durchflusszytometrie durch Fluoreszenzsignal sichtbar, das höher ist als unbeschriftete Kontrollzellen (Abbildung 2A). Für die Sortierung doppelt positiver Zellen werden Tore für die Sortierung doppeltpositiver Zellen gesetzt, die diese Population direkt zu bildgebenden Gerichten für weitere mikroskopische Analysen anreichern. Geschmolzene Zellen sind als ausgeprägte doppelt fluoreszierend ...

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Diskussion

Wir zeigen ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Verschmelzung von Zellen und zur Visualisierung der nachfolgenden Architektur von Zellhybriden mit Mikroskopie, das von Anfang bis Ende etwa zwei Tage dauert. Kritische Teile dieses Protokolls sind die Anreicherung von geschmolzenen Zellen durch Zellsortierung (Protokollabschnitt 3) und die sorgfältige Validierung von geschmolzenen Zellen durch Mikroskopie (Protokollabschnitt 4). Diese Abschnitte stellen sicher, dass geschmolzene Zellen leicht erhalten werden und...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einem Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship to R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Nummer 100090/12/Z) finanziert. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken Ashok Venkitaraman und Paul French für die kritische Beratung und Anleitung zu dem Projekt. Wir danken Chiara Cossetti und Gabriela Grondys-Kotarba im Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Liam Cassiday, Thomas Miller und Gianmarco Contino für das Korrekturlesen des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-ml-RöhrchenSarstedt62554502
37%iger FormaldehydlösungSigma-AldrichF8875
880 Konfokales Laserscanning-Airyscan-MikroskopCarl Zeiss
8-Well-BildgebungsschalenIbidi80826
Anti-GFP-Alpaka GFP-Booster NanobodyChromotekgba-488
BD Influx ZellsortiererBD Biosciences
RinderserumalbuminSigma-AldrichA7906
Zellfilter (70 μ m)BiofilCSS010070
CellTrace Far RedThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, GlutaMAX, PyruvatThermoFisher Scientific31966021
Fötales RinderserumSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I Alpaka-NanobodyNanoTag BiotechnologiesN1302-AT565
L15 CO2 unabhängiges BildgebungsmediumSigma-Aldrich21083027
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich15140122
Phenolrotfreies DMEM, hoher GlukosegehaltThermoFisher Scientific21063029
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)8g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O bis zu 1 l
Polyethylenglykol Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Polypropylen-RöhrchenBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151nichtionisches Tensid
TrypsinSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337nichtionisches Reinigungsmittel

Referenzen

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Schlagwörter

DurchflusszytometrieFluoreszenzmikroskopieGenomeditierungOrganellen Hom ostaseHeterokaryonenbildungPEG vermittelte FusionFluoreszenzprotein MarkierungZellsortierungCentrosomenduplikation
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