Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/60552

⸱

14. Februar 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Animal Protozoa Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, 2School of Life Sciences, Peking University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

Zusammenfassung

Transfektion ist ein technischer Prozess, durch den genetisches Material, wie DNA und doppelsträngige RNA, in Zellen abgegeben werden, um das Gen von Interesse zu modifizieren. Derzeit wird die transgene Technologie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von Eimeria, den Erregern der Kokzidiose bei Geflügel und Vieh. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der stabilen Transfektion bei eimerischen Parasiten: Reinigung und Nukleofektion von Sporozoiten oder Merozoiten der zweiten Generation und in vivo Vermehrung transfizierter Parasiten. Mit diesem Protokoll erreichten wir die Transfektion bei mehreren Eimeria-Arten. Zusammengenommen ist die Nukleofektion ein nützliches Werkzeug, um genetische Manipulationen bei eimerischen Parasiten zu erleichtern.

Einleitung

Eimeria spp. verursacht Kokziidiose, was zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Vieh- und Geflügelindustrie führt. Obwohl Antikokiside und in gewissem Maße abgeschwächte Antikokzien-Impfstoffe häufig zur Bekämpfung der Kokzidizien-Impfung eingesetzt wurden, gibt es immer noch Mängel in Bezug auf ihre Arzneimittelresistenz, Arzneimittelrückstände und die mögliche Diffusion von Impfstoffstämmen, die virulenz zurückgewinnen1. Mit der Entwicklung der Molekularbiologie ist die Transfektion zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Genfunktionen zu untersuchen, neuartige Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeriazu screening.

In den letzten Jahrzehnten wurde die Transfektion erfolgreich für apicomplexan Parasiten wie Plasmodium und Toxoplasma gondii2,3,4,5,6angewendet. Eine Studie, in der die Transfektion in E. tenella als Reporter für die Transfektion verwendet wurde, führte in Eimeria7auf solche Arbeiten. Die Transfektion von E. tenella8,9, E. mitis10und E. acervulina (Zhang et al., unveröffentlichte Daten) war bei Hühnern erfolgreich. Kürzlich erreichten wir die Transfektion mit Merozoiten von E. necatrix durch Nukleofection11.

Studien zeigten, dass Eimeria, die ein heterologes Antigen exizipieren, das Potenzial hat, als rekombinanter Impfstoff entwickelt zu werden, wie z. B. solche, die Campylobacter Jejuni-Antigen A (CjaA) oder Huhn interleukin 2 (chIL-2)12,13. Daher beschreibt dieses Protokoll eine Nukleofektionsstudie von Eimeria spp. bei Hühnern. Das Verfahren beschreibt die Reinigung von Sporozoiten oder Merozoiten, Die Nukleofektion mit Plasmid-DNA, die cloakale Inokulation/intravenöse Injektion und die In-vivo-Vermehrung, um Forschern zu helfen, Studien über transgene Eimeria-Parasiten zu beginnen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Hühner für alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee untergebracht und gepflegt und folgten den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren. Die Experimente wurden vom Beijing Administration Committee of Laboratory Animals genehmigt.

1. Extraktion und Reinigung von Sporozoiten von Eimeria spp. (z.B. E. tenella)

  1. Freisetzung von Sporozysten
    1. Zentrifuge 1 x 107sporulierte Oozysten in Kaliumdichromatlösung (2,5%, m/v) bei 2.300 x g für 5 min. Waschen Sie sie dreimal mit PBS (Phosphatpufferlösung).
    2. Die Pellets mit 1 ml PBS aussetzen und in ein 15 ml Rohr übertragen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Glasperlen (1 mm x 1 mm Durchmesserbereich) hinzu und oszillieren Sie die Oozystensuspension mit einem Wirbelmischer, um die Sporozysten freizusetzen.
    3. Überwachen Sie die Freisetzung von Sporozysten per Mikroskopie im Minutentakt. Stoppen Sie wirbeln, wenn mehr als 90% der Oozysten gebrochen sind.
      HINWEIS: Die meisten Oozysten (wie E. tenella, E. necatrixund E. acervulina) wurden nach 1 min mit dem Wirbelmischer gebrochen.
    4. Die Sporozystensuspension in neue 1,5 ml-Rohre und Zentrifuge bei 1.600 x g für 5 min übertragen.
    5. Den Niederschlag mit 1 ml 50% Dichtegradientenlösung aussetzen, in einem 1,5 ml Rohr kombinieren und zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.
      ANMERKUNG: Für die Dichtegradientenzusammensetzung siehe Tabelle 1. Der Dichtegradient ist ein kolloidales Mittel auf Kieselsäurebasis, bestehend aus kolloidalen Kieselsäurepartikeln mit 15-30 nm Durchmesser (23% w/w in Wasser), die mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtet wurden.
  2. Freisetzung von Sporozoiten
    1. Den Niederschlag mit dem Excystationspuffer (Tabelle 1) wieder aufbrechen und in einem 42 °C-Wasserbad für 40-60 min inkubieren, um die Sporozoiten freizusetzen. Stoppen Sie die Inkubation, wenn mehr als 90% der Sporozoiten freigesetzt werden. Dann Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Rohre einmal alle 5 Minuten während der Excystation.
    2. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml 55% Dichtegradientenlösung und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min aus.
    3. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml PBS wieder auf und zählen Sie die Sporozoiten mit einem Hämozytometer.

2. Sammlung und Reinigung von Merozoiten von E. necatrix

HINWEIS: Verwenden Sie Arbor Acre (AA) Masthähnchen im Alter von 7-14 d im Experiment. Kokzienfreie Hühner (n=3) wurden mit 2 x 105 Oozysten von E. necatrixgeimpft. Bei 109 h nach der Infektion wurden die Vögel durch zervikale Dislokation geopfert. Der Darm wurde für die Sammlung der2. Generation merozoites entfernt. Für verschiedene Eimeria-Arten gab es eine andere Zeit für die Sammlung der Merozoiten der2. Generation: E. necatrix bei 109 h und E. tenella bei 112 h nach der Impfung. Für die Transfektion von E. necatrixsind Merozoite die optimale Wahl, da die zweiten Merozoiten leicht zu reinigen sind.

  1. Sammlung der Merozoiten der zweiten Generation von E. necatrix
    1. Den Hühnerdarm längs schneiden, vom Dotterstiel (der Mitte des Dünndarms) bis zur ileocecal-Öffnung, und mit PBS oder HBSS (Hank es Balanced Salt Solution) in einer Petrischale dreimal sanft waschen.
    2. Den Darm in 0,5 cm x 0,5 cm Stücke schneiden und in einen konischen Kolben mit einem Verdauungspuffer legen (Tabelle 1). Legen Sie den Kolben auf einen Magnetmischer bei 37 °C mit einem Rührbalken für 30-60 min, um Merozoite freizusetzen. Nach 30 min Inkubation, überwachen Sie die Freisetzung von Merozoiten durch mikroskopische Untersuchung alle 5 min.
  2. Reinigen Sie die Merozoite durch Filtration und Zentrifugation.
    1. Filtern Sie die Suspension mit verdauten Merozoiten mit vier Schichten Gaze14und Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
    2. Nach der Zentrifugation den Überstand, der Darmablagerungen enthält, entsorgen. Übertragen Sie den Niederschlag mit gereinigten Merozoiten auf 1,5 ml Rohre.
    3. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml PBS wieder auf und zählen Sie die Merozoiten mit einem Hämozytometer.

3. Nukleofektion von Merozoiten oder Sporozoiten

  1. Zubereitung vor Nukleofektion von Parasiten
    1. Bereiten Sie etwa 107 Merozoite oder Sporozoite in einer Röhre vor. Wenn Sie Merozoite transfizieren, bereiten Sie 3-4 Röhren vor.
    2. Bereiten Sie eine Menge an Plasmid-DNA oder gereinigtem PCR-Fragment vor, das größer oder gleich 10 g ist.
      HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Plasmid enthält 2 Gene: verbessertes gelbes fluoreszierendes Protein (EYFP) und Dihydrofolat-Reduktase Thymidylat-Synthase aus Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15.
    3. Bereiten Sie 25 U restriktionsenzym vor. Wenn Plasmide linearisiert werden, kann das Restriktionsenzym die Transfektionseffizienz verbessern. Wenn die Plasmide kreisförmig sind, lassen Sie das Restriktionsenzym weg.
    4. Bereiten Sie 85 l Nukleofektionspuffer vor: Mischen Sie 20 L Nukleofektionspuffer I und 1 ml Nukleofektionspuffer II, und verwenden Sie einen Teil der Lösung. Das Volumen des Gesamtpuffers beträgt 100 L.
  2. Nukleofection
    1. Zentrifugieren Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension bei 600 x g für 10 min. Dann entsorgen Sie den Überstand.
    2. In der folgenden Reihenfolge fügen Sie 85 l Kerntransfektionspuffer, 10 g Plasmid (PCR-Fragment) und 25 U Restriktionsenzym (in der Regel 5 l) in das 1,5 ml-Rohr mit Sporozoiten oder Merozoiten ein.
    3. Übertragen Sie die Suspension auf einen nuklearen Transfektionsbecher. Den Becher in eine nukleare Transfernut legen.
    4. Schalten Sie die Nahrektionsvorrichtung mit dem Netzschalter ein und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033. Wenn das Nukleofection-Gerät im Modus "Freie Programmauswahl" gestartet wird, beenden Sie diesen Modus, indem Sie die X-Taste drücken.
    5. Wenn das Programm abgeschlossen ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm sollte OKanzeigen, was darauf hinweist, dass die Nukleofektion erfolgreich ist.
    6. Fügen Sie 0,5-1 ml Von Dulbeccoes Modified Eagle es Medium (DMEM)8 in den Nukleofection-Becher, um die Reaktion zu stoppen und die Suspension nach dem sanften Mischen auf 1,5 ml Rohr zu übertragen.

4. Cloakalinokulation oder intravenöse Injektion

  1. Impfen Sie die Nukleofekten Parasiten zu 7 Tage alten Hühnern. Impfen Sie die Merozoiten von E. necatrix oder die Sporozoiten von E. tenella über den kloaken Weg, aber impfen Sie E. acervulina sporozoites durch intravenöse Injektion. Impfen Sie etwa 2 x 107 Millionen Sporozoiten in jedes Huhn und inkoluieren Merozoiten 107 für jeden Vogel.

5. Vermehrung und FACS-Sortierung

  1. Sammeln Sie Oozysten aus Kot 5-9 Tage nach der Impfung mit transfizierten Sporozoiten. Sammeln Sie die Oozysten am dritten Tag nach der Impfung mit transfizierten Merozoiten.
  2. Verwenden Sie fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und 150 mg/kg Pyrimethamin8, um das transgene Populationsverhältnis sukzessive zu erhöhen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Pyrimethamin, indem Sie es direkt in den Feed einfügen. Für eine bequemere Verwendung bereiten Sie wasserlösliches Pyrimethamin vor. 1 g Pyrimethamin in 0,2 ml pfH2SO4 und 9,8 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) auflösen und dann 1,5 ml dieser Stammlösung in 1 L Trinkwasser für Vögel geben.

6. Optionale Säulenreinigung

HINWEIS: Wenn mehr reine Sporozoiten oder Merozoite benötigt werden, gibt es eine optionale Methode, die sie durch eine Diethylaminoethyl-52-Zellulosesäule (DE-52-Zellulose) reinigt.

  1. Bereiten Sie die DE-52-Zellulosesäule mindestens einen Tag im Voraus vor.
    1. Vorbereiten des Glycin-Eluentenpuffers (Tabelle 1). Stellen Sie den pH-Wert des Glycin-Eluentenpuffers von 7,6 auf 8,0 und auf 41 °C vorgewärmt an.
    2. 2,5 g DE-52-Zellulose in die Säule geben. Wasser hinzufügen und über Nacht einweichen. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Wasser hinzufügen und 1 h einweichen. Den Überstand entsorgen.
    4. 0,1 M NaOH hinzufügen und mindestens 2 Stunden einweichen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    5. Ersetzen Sie den Überstand durch Wasser. Nachdem sich die Zellulose vollständig auf den Boden (ca. eine halbe Stunde) gelegt hat, wiederholen Sie diesen Schritt.
    6. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 0,1 M HCl hinzu und tränken Sie ihn mindestens 2 Stunden lang. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    7. Entsorgen Sie den Überstand und tränken Sie die Zellulose zweimal mit dem Glycin-Eluentenpuffer.
    8. Messen und einstellen Sie den pH-Wert von 7,6 auf 8,0, indem Sie 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH hinzufügen.
      HINWEIS: In diesem Teil hat die Flüssigkeit mindestens 5x mehr Volumen als die von DE-52 Cellulose.
  2. Stellen Sie den Durchfluss zwischen 40-50 r/min ein.
  3. Wenn die Sedimentation von Zellulose abgeschlossen ist, fügen Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension in die chromatographische Säule ein. Stellen Sie den Durchfluss auf 30-40 r/min ein.
    HINWEIS: Setzen Sie die Sporozoit- oder Merozoitfällung mit Glycin-Eluentenpuffer aus, bevor Sie die chromatographische Säule hinzufügen.
  4. Mit Glycin-Eluentenpuffer in 50 ml-Rohre sammeln. Stoppen Sie die Sammlung gemäß den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung von Sporozoiten oder Merozoiten während des Elutionsprozesses.
  5. Zentrifuge den bei 600 x g gesammelten Glycin-Eluentenpuffer für 10 min. Übertragen Sie den Sporozoit- oder Merozoitniederschlag in neue 1,5 ml-Rohre.
  6. Zählen Sie die Sporozoiten oder Merozoiten mit einem Hämozytometer.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eimerian Parasiten zu transfekten. In dieser Studie wurden die Meronten und Merozoiten der2. Generation von E. necatrix in Abbildung 2A und Abbildung 2Bdargestellt, während Abbildung 2C und Abbildung 2D die Sporozysten und Sporozoiten von E. te...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

In den 1990er Jahren wurde ein Transfektionssystem für apicomplexan Parasiten entwickelt, und es wurde für Studien über eimerische Parasiten verwendet. Kürzlich wurde eine stabile Transfektion in E. tenella8,9 und E. nieschulzi15durchgeführt. Wir erreichten die stabile Transfektion von E. necatrix durch transfizierende Merozoiten der zweiten Generation11. Die Impfung der transfizierten Spo...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) und der National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 und 31873007) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ATP-DinatriumSigmaA26209
Zellulose DE-52SolarbioC8350
Pumpe mit konstantem DurchflussSHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.HL-2B
DMEMMACGENE
GlasperlenSigmaZ250473-1PAK
GlukoseSigmaNr. V900116
GlycinBiotoppedG6200
HBSSMACGENECC016
KH2PO4SigmaNr. V900041
Zentrifuge mit niedriger DrehzahlVERIFIZIERTER LIEFERANT - BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.DT5-2
MagnetischerMischer SCILOGEXMS-H280-Pro
MgCl2Sigma449164
MoFlo ZellsortiererBeckMan Coulter, US201309995
NaHCO3Sigma144-55-8
NukleofektionsgerätLONZA/amaxa90900012 (Nucleofector II)
PBSSolarbioP1010
Percoll (DG Gradient Stammlösung)GE Healthcare17-0891-09
NatriumtaurodeoxycholathydratSigmaT0875
Sorvall Legend Micro 17 MikrozentrifugeThermoFisher Scientific75002430
4,5 g/L Glukose mit Natriumpyruvat, L-Glutamin und 25 mM HEPES.
TrypsinSolarbioT8150
Vortex-MischerBeijing North TZ-Biotech Develop.co.HQ-60-II
Wasserbad-ThermostatGrant Instruments (Cambridge), Ltd.GD120,GM0815010
CM15019 Die Zusammensetzung von DMEM:

Referenzen

  1. Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
  2. Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
  3. Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
  4. Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
  5. Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
  6. Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
  7. Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
  8. Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
  9. Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
  10. Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188(2014).
  11. Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
  12. Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533(2015).
  13. Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
  14. Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
  15. Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
  16. Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2(2017).
  17. Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807(2016).
  18. Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
  19. Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Reinigung von SporozoitenIsolation von MerozoitenDichtegradientenzentrifugationTransfektionsprotokollfluoreszenzaktivierte ZellsortierungCRISPR-Cas9-Technologiegenetische Manipulation
Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.