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Methodenartikel

Chronisches Post-Ischemia Schmerzmodell für komplexes regionales Schmerzsyndrom Typ-I bei Ratten

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DOI:

10.3791/60562

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21. Januar 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier ist ein Protokoll, das Schritte zur Etablierung eines Tiermodells für chronische Post-Ischämie-Schmerzen (CPIP) beschreibt. Dies ist ein anerkanntes Modell, das das menschliche komplexe regionale Schmerzsyndrom Typ-I iiaht. Mechanische und thermische Überempfindlichkeiten werden weiter ausgewertet, sowie Capsaicin-induzierte nocifensive Verhaltensweisen, die im CPIP-Rattenmodell beobachtet wurden.

Zusammenfassung

Das komplexe regionale Schmerzsyndrom Typ-I (CRPS-I) ist eine neurologische Erkrankung, die bei Patienten starke Schmerzen verursacht und nach wie vor eine ungelöste Erkrankung ist. Die zugrunde liegenden Mechanismen von CRPS-I müssen jedoch noch aufgedeckt werden. Es ist bekannt, dass Ischämie/Reperfusion einer der führenden Faktoren ist, die CRPS-I verursacht. Mittels längerer Ischämie und Reperfusion der Hintergliedsa wurde das modellierte chronische Post-Ischämie-Schmerz (CPIP) der Ratte etabliert, um CRPS-I nachzuahmen. Das CPIP-Modell hat sich zu einem anerkannten Tiermodell für die Untersuchung der Mechanismen von CRPS-I. Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Verfahren bei der Erstellung des Rattenmodells von CPIP, einschließlich Anästhesie, gefolgt von Ischämie/Reperfusion der Hintergliedsa. Die Merkmale des Ratten-CPIP-Modells werden weiter bewertet, indem die mechanischen und thermischen Überempfindlichkeiten der Hinterbleibse sowie die nozifensiven Reaktionen auf akute Capsaicin-Injektion gemessen werden. Das Ratten-CPIP-Modell weist mehrere CRPS-I-ähnliche Manifestationen auf, darunter Hinterd-Gliederödem und Hyperämie im frühen Stadium nach dem Aufbau, anhaltende thermische und mechanische Überempfindlichkeiten und erhöhte nocifensive Reaktionen auf akute Capsaicin-Injektion. Diese Eigenschaften machen es zu einem geeigneten Tiermodell für die weitere Untersuchung der mechanismen, die an CRPS-I beteiligt sind.

Einleitung

Komplexes regionales Schmerzsyndrom (CRPS) reprents komplexe und chronische Schmerzsymptome infolge von Frakturen, Trauma, Chirurgie, Ischämie oder Nervenverletzungen1,2,3. CRPS wird in 2 Unterkategorien eingeteilt: CRPS Typ-I und Typ-II (CRPS-I und CRPS-II)4. Epidemiologische Studien ergaben, dass die Prävalenz von CRPS etwa 1:20005betrug. CRPS-I, das keine offensichtlichen Nervenschäden zeigt, kann zu chronischen Schmerzen führen und die Lebensqualität der Patienten dramatisch beeinträchtigen. Die derzeit verfügbaren Behandlungen zeigen unzureichende therapeutische Wirkungen. Daher bleibt CRPS-I ein wichtiges und herausforderndes klinisches Problem, das angegangen werden muss.

Die Entwicklung eines präklinischen Tiermodells, das CRPS-I iiiiert, ist entscheidend für die Erforschung der Mechanismen, die CRPS-I zugrunde liegen. Um dieses Problem anzugehen, entwarfen Coderre et al. ein Rattenmodell, indem sie verlängerte Ischämie und Reperfusion auf die hintere Gliedmaße aufwendeten, um CRPS-I6zu rekapitulieren. Es ist bekannt, dass Ischämie/Reperfusionsverletzung eine der Hauptursachen für CRPS-I7ist. Das Ratten-CPIP-Modell weist viele CRPS-I-ähnliche Symptome auf, zu denen Hinterd-Gliederödem eödem und Hyperämie im frühen Stadium nach der Modelleinrichtung gehören, gefolgt von anhaltenden thermischen und mechanischen Überempfindlichkeiten6. Mit Hilfe dieses Modells wird vorgeschlagen, dass zentrale Schmerzsensibilisierung, periphere TRPA1-Kanalaktivierung und reaktive Sauerstoffspezies usw. zu CRPS-I8,9,10beitragen. Wir haben vor kurzem erfolgreich das CPIP-Rattenmodell etabliert und die RNA-Sequenzierung der dorsalen Wurzelganglien (DRGs) durchgeführt, die die betroffene Hinterpfote11innervate. Wir entdeckten einige mögliche Mechanismen, die möglicherweise an der Vermittlung der Schmerzüberempfindlichkeiten von CRPS-I11beteiligt sind. Wir identifizierten ferner den transienten Rezeptor-Potential-Vanilloid-Kanal 1 (TRPV1) in DRG-Neuronen als wichtigen Beitrag zu den mechanischen und thermischen Überempfindlichkeiten von CRPS-I12.

In dieser Studie haben wir die detaillierten Verfahren beschrieben, die bei der Erstellung des Rattenmodells von CPIP beteiligt sind. Wir haben das Ratten-CPIP-Modell weiter evaluiert, indem wir die mechanischen und thermischen Überempfindlichkeiten sowie deren Reaktionsfähigkeit auf akute Capsaicin-Herausforderungen gemessen haben. Wir schlagen vor, dass das Ratten-CPIP-Modell ein zuverlässiges Tiermodell für die weitere Untersuchung der Mechanismen von CRPS-I sein kann.

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Protokoll

Die Tierprotokolle wurden von der Zhejiang Chinese Medical University Animal Ethics Committee genehmigt.

1. Tiere

  1. Erhalten Sie männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten (280–320 g, 8-10 Wochen alt) vom Shanghai Laboratory Animal Center. Beherbergen Sie die Tiere in Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Center. Beachten Sie, dass die Brutbedingungen 12 h / 2h Licht/Dunkel-Zyklen umfassen und die Temperatur konstant bei 24 °C halten sollten. Geben Sie Wasser und Lebensmittel ad libitum. Beachten Sie, dass in dieser Studie insgesamt 48 Ratten verwendet werden. Eine Anmerkung, in diesem Modell müssen wir die Schmerzreaktion während des gesamten Prozesses beobachten. Wenn Schmerzmittel angewendet werden, können wir das Schmerzmodell nicht erfolgreich etablieren. Nach den Experimenten werden die Ratten geopfert.

2. CPIP-Modelleinrichtung

  1. Anästhetisieren Sie alle Ratten (einschließlich Schein- und CPIP-Modellgruppen) mit Natriumphenobarbital (50 mg/kg, intraperitoneale Injektion [i.p.]). Halten Sie die Anästhesie mit bis zu 20 mg/kg/h Phenobarbital [i.p.], falls erforderlich. Überprüfen Sie die Reflexe jedes Tieres, indem Sie ihre Hinterpfote oder Schwanzspitze mit Zangen kneifen. Stellen Sie sicher, dass die Ratten nicht vor der Modelleinrichtung reagieren. Legen Sie Tierarzt Salbe auf die Augen, um Trockenheit während des Eingriffs zu vermeiden. Legen Sie die anästhesierten Ratten auf ein beheiztes Pad, das für das folgende Verfahren bei 37 °C gehalten wird.
  2. Ischämie und Reperfusion der Hinterpfote
    1. Schmieren Sie die rechte Hinterpfote und den Knöchel mit Glycerin, sobald die Ratte bezähmt wird.
    2. Schieben Sie einen Nitrile 70 Durometer O-Ring mit einem Innendurchmesser von 7/32" (5,5 mm) in die größere Seite eines 1,5 mL Eppendorf-Rohrs (mit vor Gebrauch abgeschnittener Fangkappe). Legen Sie die Hinterpfote vorsichtig in das hohle Eppendorfrohr ein, bis sie den Boden erreicht.
    3. Nach und nach schieben Sie den O-Ring von der Röhre in die rechte Hintergliedsa in der Nähe des Sprunggelenks und legen Sie für 3 h. Wenden Sie die gleiche Behandlung auf eine Scheingruppe von Ratten an, mit der Ausnahme, dass ein gebrochener O-Ring, der abgeschnitten ist und keine Ischämie auslösen sollte, um den Knöchel gelegt werden sollte.
    4. Den O-Ring 3 h nach dem Ischämieschritt abschneiden. Beobachten Sie die Ratte sorgfältig, bis sie genug Bewusstsein zurückgewinnt, um die Brustbeschisse aufrechtzuerhalten. Beachten Sie, dass die Ratte, die Anästhesie erhalten hat, nicht an die Gesellschaft anderer Ratten zurückgebracht werden sollte, bis sie sich vollständig erholt hat.

3. Nocifensive Verhaltenstests

  1. Legen Sie die Ratte in eine transparente Plexiglaskammer, die auf einem Mesh-Boden sitzt. Habituate die Ratte für 0,5 h vor jeder Verhaltensprüfung.
  2. Mechanische Allodynie
    1. Verwenden Sie von Frey Filamente (0.4, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 15.0 und 26.0 g Filamente) für den Test. Beginnen Sie den Test aus dem mittleren Filament (4,0 g). Die Filamente vertikal auf die mittlere Plantaroberfläche der Hinterpfote auftragen. Etwas geeignete Kraft anwenden, um das Filament für bis zu 5 s zu biegen. Ein plötzliches Zurückziehen der Hinterpfote als Reaktion auf die Reize gilt als nocifensives Verhalten. Führen Sie den mechanischen Allodynie-Test an Tagen -3, -2, -1 und jeden zweiten Tag bis zum 13. Tag durch.
    2. Wenden Sie die Up-Down-Testmethode an, um den Schwellenwert zu testen. Wenden Sie die Dixon-Methode zur Berechnung der Schwelle für den Entzug der Pfote (PWT)13,14,15an.
  3. Thermische Hyperalgesie
    1. Verwenden Sie die Hargreaves-Methode, um die thermische Hyperalgesie zu untersuchen. Richten Sie den Lichtstrahl, der von einer Glühbirne (50 W) auf die Hinterpfote emittiert wird, direkt an, um die Pfotenentzugslatenz (PWL) zu messen. Stellen Sie 20 s als Cut-off-Schwelle ein, um übermäßige Verletzungen durch die Heizung zu vermeiden.
    2. Wiederholen Sie jeden Test 3x in 5 min Intervallen für jede Hinterpfote. Nehmen Sie den Durchschnitt dieser drei Tests als PWL jeder Ratte16. Führen Sie den thermischen Hyperalgesie-Test an Tagen -3, -2, -1 und jeden zweiten Tag bis zum 13. Tag durch.
  4. Capsaicin-induziertes akutes nocifensives Verhalten
    1. Capsaicin-Stammlösung (200 mM) mit Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereiten und in steriler phosphatgepufferter Saline (PBS) zur Hinterpfoteninjektion weiter auf 1:1000 verdünnen. Die endgültige DMSO-Konzentration in PBS beträgt 0,1% (Fahrzeug enthält 0,1% DMSO nur in PBS). Injizieren Sie Capsaicin oder Fahrzeug in die Hinterpfote (Intraplantar-Injektion) mit einem Volumen von 50 l mit einer 30 G-Nadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist.
    2. Zeichnen Sie das nocifensive Verhalten (d. h. Lecken, Beißen oder Zucken der injizierten Pfote) mit einer Videokamera für 10 min direkt nach der Injektion auf und quantifiziert anschließend wie zuvor beschrieben17,18,19.
  5. Nachd Pfotenödemauswertung: Bewerten Sie das Hinterpfotenödem, indem Sie die Erhöhung des Pfotendurchmessers messen. Messen Sie mit einem digitalen Bremssattel und berechnen Sie die Differenz zwischen dem Basalwert und dem Zust. Bewerten Sie die Veränderungen der Pfotendicke bei 15 min, 24 h, 48 h und 72 h nach dem Modellaufbau.

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Ergebnisse

Nach der Platzierung des O-Rings am Knöchel zeigte die ipsilaterale Hinterpfotenhaut Zyanose, ein Hinweis auf Gewebehypoxie (Abbildung 1A). Nach dem Schneiden des O-Rings begann sich die ipsilaterale Hinterpfote mit Blut zu füllen und zeigte eine starke Schwellung, die ein intensives Anzeichen von Hyperämie zeigte (Abbildung 1A). Die Pfotenschwellung nahm allmählich ab und kehrte nach dem ischämischen/reperfusionsverfahren wiede...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Methoden zur Etablierung eines Ratten-CPIP-Modells durch Anwendung von Ischämie/Reperfusion auf hintere Gliedmaßen der Ratten. Es beinhaltet die Bewertung des Aussehens der Hinterbeine, Ödeme, mechanische/thermische Überempfindlichkeiten und akute nocifensive Verhaltensweisen als Reaktion auf Capsaicin-Injektion.

LimbIschämie/Reperfusion ist ein häufiger Faktor, der bei menschlichen Patienten zu CRPS-I beiträgt12. Dieses Pro...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte in diesem Werk.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (81873365 und 81603676), Zhejiang Provincial Natural Science Funds for Distinguished Young Scholars (LR17H270001) und Forschungsgeldern der Zhejiang Chinese Medical University ( Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml Eppendorf RöhrchenEppendorf22431021
DMSOSigma-AldrichD1435
CapsaicinAPEXBIOA3278
Digitaler MessschieberMeinaiteNA
O-RingO-Ringe WestNitril 70 Durometer7/32 Zoll
Innendurchmesser
PlantarprüfgerätUGO Basile, Italien37370
von Frey filamentsUGO Basile, ItalienNC12775

Referenzen

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