Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Summary

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.

Abstract

Die Optimierung von Bioprozessen zur Ertragssteigerung der gewünschten Produkte ist in der biopharmazeutischen Industrie von Bedeutung. Dies kann durch die Dehnungsauswahl und durch die Entwicklung von Bioprozessparametern erreicht werden. Zu diesem Zweck wurden Schüttelkolben verwendet. Sie sind jedoch nicht in der Lage, die Prozessparameter wie pH und gelösten Sauerstoff (DO) zu steuern. Diese Einschränkung kann mit Hilfe eines automatisierten Mikrobioreaktors überwunden werden. Diese Bioreaktoren imitieren den Anbau in größerem Maßstab. Einer der Hauptvorteile dieses Systems ist die Integration des Design of Experiment (DOE) in die Software. Diese Integration ermöglicht die Erstellung eines Entwurfs, bei dem mehrere Prozessparameter gleichzeitig variiert werden können. Die kritischen Prozessparameter und optimalen Bioprozessbedingungen können innerhalb der Software analysiert werden. Im Mittelpunkt der hier vorgestellten Arbeit steht die Einführung der Schritte der Prozessgestaltung in der Software und der Einbindung des DOE in den Kultivierungslauf.

Introduction

Der globale biopharmazeutische Markt war 2018 mehr als 250 Milliarden US-Dollar wert und hat sich kontinuierlich erweitert¹. Pharmaunternehmen bewegen sich von der Herstellung kleiner molekularer Medikamente hin zu biotechnologisch hergestellten Therapeutika wie rekombinanten Proteinen. Diese allein sind für einen Umsatz von mehr als 150^MilliardenUS-Dollar verantwortlich. Säugetierzellen werden heute ausgiebig für die Herstellung dieser pharmazeutischen rekombinanten Proteine verwendet. In der aktuellen Periode werden 57 der 68 von Säugetierzellen hergestellten Produkte von chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO)

Protocol

1. Präkulturverfahren

HINWEIS: Für dieses Protokoll werden rekombinante CHO DG44-Zellen mit einer lebensfähigen Zellkonzentration von 1 x 10⁷ Zellen/ml verwendet.

1. Die Durchstechflasche mit 1,2 ml Zellen auf Raumtemperatur auftauen und die Zellsuspension sofort in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml kaltem Samenmedium übertragen.
2. Zentrifugieren Sie das konische Zentrifugenrohr 5 Minuten lang bei 190 x g und Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
3. 150 ml des Saatmediums in einem 500 ml Schüttelkolben auf 36,8 °C vorheizen.
4. Das Zellpellet in 10 ml vo....

Results

Abbildung 2gibt einen Überblick über den Anbau dieser Studie .

Abbildung 2: Schematische Darstellung der experimentellen Bedingungen zum Testen von pH- und Rührergeschwindigkeitsprofilen in den Kulturstationen. Die Abbildung stellt auch das richtige Layout für die Aufstellung der Schiffe dar.

Discussion

Die Optimierung des Prozesses zur Ertragssteigerung ist in der biopharmazeutischen Industrie von entscheidender Bedeutung. Schüttelkolben könnten möglicherweise für das Screening der Sorte verwendet werden; Die Überwachung der Prozessparameter wie pH und DO ist jedoch in den Kolben nicht verfügbar. Die Mikrobioreaktoren haben einen Vorteil, da sie eine kontinuierliche Überwachung und Kontrolle des Prozesses ermöglichen. Diese Regelkreise im Mikrobioreaktor bieten auch einen ähnlichen Zustand wie in größerem Maßstab und l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Einweg-Pipettenspitzen, sterilisiert	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0040
200 mM L-Glutamin	Corning, Merck	25-005-CV
24 Well Deep Well Platten	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0038
5 mL Einweg-Pipettenspitzen, sterilisiert	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0039
ambr 15 automatisiert Mikrobioreaktorsystem	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-2804
ambr 15 Zellkultur 24 Einweg-Bioreaktoren - Sparged	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-1B86
Antifoam C Emulsion	Sigma-Aldrich, Merck	A8011
Bottle Top Sterilfilter	Corning, Merck	CLS431474	0,1 μ m Porengröße
CEDEX Detergent (3% Mucosol)	Roche Innovatis AG	05-650-658-001
Zellzähler	Roche Innovatis AG	05-650-216-001	CEDEX HiRes
CHO DG44 Zelllinie	Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80026
CHOKO Production	Medium Sigma-Aldrich, Merck	CR80027
CHOKO Stock Culture Meium	Sigma-Aldrich, Merck	CR80028
Chromaster Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem	VWR International
Konisches Zentrifugenröhrchen	Corning, Merck	SIAL0790
Ethanol	Merck
Glycin	Carl Roth	56-40-6
HPLC-Fläschchen	VWR International	SUPLSU860181
PBS	Sigma-Aldrich,Merck	P4417
Protein A Säule	Thermo Fisher Scientific	1502226	POROS&Handel; A 1,7  mL
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich,Merck	7647-14-5
Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei	Sigma-Aldrich,Merck	7558-79-4
Trypanblau	VWR International	VWRVK940
YSI	YSI Inc	2900D	YSI 2900 Select