Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

Published: March 31, 2020 doi: 10.3791/60596
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Washington

Summary

Denne artikkelen presenterer metoder for å generere, rense og kvantifisere Caenorhabditis elegans ekstracellulære vesikler.

Abstract

Utskillelse av små membranbundne vesikler i det ytre miljøet er en grunnleggende fysiologisk prosess for alle celler. Disse ekstracellulære vesiklene (EV-er) fungerer utenfor cellen for å regulere globale fysiologiske prosesser ved å overføre proteiner, nukleinsyrer, metabolitter og lipider mellom vev. EV-er gjenspeiler den fysiologiske tilstanden til deres opprinnelsesceller. EV-er er innblandet i å ha grunnleggende roller i nesten alle aspekter av menneskers helse. Dermed blir EV-protein og genetiske laster i økende grad analysert for biomarkører av helse og sykdom. Ev-feltet mangler imidlertid fortsatt et håndsdyrmodellsystem som tillater studiet av EV-lastsammensetning. C. elegans er godt egnet for EV-forskning fordi det aktivt utskiller EV-er utenfor kroppen i sitt ytre miljø, slik at facile isolasjon. Denne artikkelen gir all nødvendig informasjon for å generere, rense og kvantifisere disse miljøutskillede C. elegans-EV-ene, inkludert hvordan man arbeider kvantitativt med svært store populasjoner av alderssynkroniserte ormer, rensende EV-er og en flytcytometriprotokoll som direkte måler antall intakte EV-er i den rensede prøven. Dermed kan det store biblioteket av genetiske reagenser tilgjengelig for C. elegans forskning bli tappet inn for å undersøke virkningene av genetiske veier og fysiologiske prosesser på EV last sammensetning.

Introduction

Utskillelse av membranbundne ekstracellulære vesikler (EV-er) forenkler de globale fysiologiske prosessene ved aktivt å transportere spesifikt protein, nukleinsyre, metabolitter og lipidlaster mellom celle1. Celler utskiller EV-er som spenner over et kontinuum av størrelser fra 2 μm eller større til så små som 20 nm2. Små EV-er (<200 nm) studeres i økende grad på grunn av deres implikasjon i patologiske prosesser, inkludert metabolske forstyrrelser, kreft, kardiovaskulær sykdom og nevrodegenerative sykdommer3,4,5. Disse patologiene har også vist seg å påvirke proteinet og den genetiske sammensetningen av EV-laster av små EV-er. Derfor blir biomarkørsignaturer av patologien i økende grad avdekket gjennom EV-lastoppdagelsesmetoder som LC-MS-MS og RNAseq6,,7,8,9.

C. elegans har vært en nyttig virvelløse modell for å identifisere evolusjonært bevarte EV-signalveier. For eksempel ble en C. elegans flippase først vist å indusere EV biogenesis i C. elegans embryoer, og den menneskelige homolog ble vist å påvirke EV utgivelse i menneskelige celler10,11. C. elegans EV ble rapportert å bære Hedgehog signaler som er nødvendige for cuticle utvikling. Leveringen av Pinnsvin og andre morfoogener ble vist å spille en stor utviklingsrolle for EV-er, og det er bevart i sebrafisk, mus og mennesker12,,13,14,15. C. elegans er godt egnet for EV biomarkør oppdagelse fordi det utskiller EV utenfor kroppen som fungerer i dyr-til-dyr kommunikasjon16,17 (Figur 1A). Metodikken som er etablert gjennom en tidligere studie, kan imidlertid ikke brukes fordi nematodenes E. coli-matkilde også utskiller EV-er18. I denne metoden består det meste av prøven av E. coli-kontaminering, noe som begrenser kraften til proteomiske eller RNAseq tilnærminger for oppdagelsen av C. elegans EV-laster. Metodene som er beskrevet her ble utviklet for å gi svært rene C. elegans EV-er på overflodnivåer som er karakteristiske for typiske cellekultureksperimenter og dermed lette omics tilnærminger for EV biomarkør oppdagelse.

Store bestander av ormer er nødvendig for å generere et tilstrekkelig antall EV-er for lastanalyse. Derfor er metoder for å gjennomføre kvantitativ dyrking av store populasjoner av utviklingssynkroniserte C. elegans også inkludert. Vanligvis, når et stort antall ormer er nødvendig for eksperimenter, blir de dyrket i flytende medier. Mens dette er effektivt for å generere store populasjoner av ormer, er dyrenes fysiologi betydelig forskjellig fra ormer dyrket under standardforhold på nematodevekstmedium (NGM) agarplater. Dyr dyrket i væske vokser saktere, er tynnere, viser utviklingsheterogenitet, og blir utsatt for en høy grad av batch variabilitet. Derfor presenterer vi et enkelt, men effektivt middel for kvantitativ dyrking av store populasjoner av utviklingssynkroniserte C. elegans ved hjelp av 10 cm høye vekstplater. Mediesammensetningen av høyvekstplater inkluderer mer peptone enn vanlige NGM-plater og seedes med E. coli-stammen NA22 som vokser mer robust enn OP50.

Fremskritt i flow cytometri teknologi (FACS) har aktivert direkte analyse av individuelle EV20,21, tillater kvantifisering av EV uten de iboende begrensninger i andre metoder. Tidligere arbeid har vist at protein ikke er en nyttig proxy for EV overflod fordi ulike rensemetoder resulterer i betydelig forskjellige EV-til-protein forhold22. Ekstremt rene EV-fraksjoner inneholder relativt lite protein, noe som gjør det vanskelig å kvantifisere prøver med BCA eller Coomassie geler. Vestlig analyse kan identifisere relative forskjeller av individuelle proteiner, men kan ikke identifisere hvor mange EV-er som er i prøven. Robust kvantifisering av EV-nummer ved nanopartikkelsporingsanalyse hemmes av sitt smale signal-til-støy-område, manglende evne til å skille mellom EV-er og solide aggregater, og mangelen på overføringsevne av metoder mellom instrumenter med forskjellige spesifikasjoner23. Derfor inneholder denne artikkelen også en generell flyt cytometrisk prosedyre for diskriminering og kvantifiserende EV-er.

Protocol

1. Forberedelse

  1. Tilsett 2 g gelatin til 100 ml dH2O og varme i mikrobølgeovnen til den begynner å koke. Rør og la det avkjøles i 20 min.
  2. Send oppløsningen gjennom et 0,22 μm filter og dispenser i sterile rør. Behandle pipettespisser med gelatin umiddelbart før bruk ved å pipe opp og utvise gelatinoppløsningen. Behandlede tips kan enten brukes umiddelbart eller lagres.
  3. Klipp ut membranen fra et sterilt hettefilter.
  4. Våt en 20 cm kvadrat av 5 μm nylon mesh stoff og plassere rundt toppen av en steril cap filter. Fest den med flere tykke gummibånd.
    FORSIKTIG: Nøye undersøke stoffet for å sikre at det ikke er bretter. Disse gjør lufthull som hindrer suging.

2. Beregning av store populasjoner av ormer (figur 1A)

  1. Vortex og pipette 10 μL av ormsuspensjonen på et ormdyrkingsplatelokk eller et glasslysbilde. Gjenta denne prosessen 3x. Registrer antall dyr i hver dråpe.
  2. Juster ormsuspensjonen til to dyr per μL.
  3. Vorfjæringen og pipetten ni dråper (10 μL) på et lysbilde eller et platelokk. Telle antall dyr manuelt. Registrer antall dyr i hver dråpe.
  4. Beregn gjennomsnittet og standardfeilen for gjennomsnittet (S.E.M.) som en prosentandel av hver ormpopulasjon.
  5. Beregn det totale antallet dyr i hver populasjon ved å dele gjennomsnittsverdien med 10 μL og deretter multiplisere med det totale volumet av ormsuspensjonen i μL.

Figure 1
Figur 1: Prosedyreoversikter for generering, kvantifisering og rensing av C. elegans-EV-er. (A) Skjematisk for å telle store bestander av dyr. (B) Skjematisk for generering av ormer for høsting av EV-er. (C) Skjematisk for rensende EV-er fra C. elegans supernatent. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Dyrking av C. elegans for EV Rensing

  1. Generere en stor befolkning av utviklingssynkroniserte C. elegans. Hvis du vil gjøre dette, følger du trinnene nedenfor.
    1. Legg til et enkelt dyr på en 6 cm normal vekst medieplate. Inkuber i to generasjoner og vask deretter dyrene på to høyvekst medium plater.
    2. Inkuber til ormene har brukt opp maten.
    3. Filtrer L1 ormer med 5 μm nylonnett tilberedt i trinn 1.4. Plasser skrukorken på den sterile flasken, start vakuumet og hell ormer over filteret. Pass det samme volumet av mediet over ormaggregatene på filteret.
    4. Kvantifiser ormene og beregn det totale tallet (se trinn 2). Nylig sultet (<24 h) ormer dyrket på en høy vekstplate resulterer i ca 80.000 L1 larver.
    5. Sentrifuge L1 larver på 2000 x g i 3 min. Resuspend til ~ 100.000 dyr per ml.
    6. Plasser ~ 50.000 dyr per høy vekstplate. Dyr ved 20 °C til de er voksne (ca. 72 timer).
    7. Bleke de gravid voksne med standard midler og la embryoer klekkes i 10 ml S Basal løsning med 2,5 μg / ml kolesterol.
    8. Kvantifiser L1 larver (se trinn 2) og tilsett deretter 50.000 ormer til hver høy vekstplate.
    9. Dyrke plater ved 20 °C til dyrene er unge voksne.
  2. Forbered C. elegans for sekretorisk generasjon.
    1. Vask ormer fra plater ved å tilsette 15 ml steril M9 med 50 μg/ml karbenicillin til hver høy vekstplate. La de mettede platene sitte i 5 min. Løsne ormer ved å sirkle bufferen rundt platen. Unngå sloshing. Hell bufferen fra hver plate i et separat 50 ml konisk rør. Gjenta vasketrinnet 2x mer for totalt 45 ml buffer per plate.
    2. La ormene bosette seg i 15 min. Dekanter supernatanten og tilsett 50 ml fersk M9-buffer til røret. Gjenta for totalt 4x.
    3. Flyte ormene på toppen av en 30% sukrose trinngradient og gjenopprette dyr i S Basal løsning24.
      1. Resuspender ormene kort i 15 ml iskald 100 mM NaCl, tilsett 15 ml iskald 60% sukrose, og inverter til å blande. Med en glasspipette lag forsiktig 5 ml iskald 100 mM NaCl på toppen av sukroseblandingen.
      2. Sentrifuge på 1500 x g i 5 min. Ormer vil være konsentrert i grensesnittet mellom NaCl og sukrose.
      3. Pipette forsiktig ut dyrene fra grensesnittet til et nytt 50 ml konisk rør. Legg S Basal løsning til 50 ml. La ormene bosette seg 5 min.
      4. Dekanter supernatanten og tilsett frisk 50 ml S Basal-løsning. Gjenta dette minst 3x.
    4. Kvantifiser antall ormer som beskrevet i trinn 2.
    5. Resuspendorormene til en tetthet på ett dyr per μL med steril S Basal-oppløsning som inneholder 2,5 μg/ml kolesterol og 50 μM karbenicillin.
    6. For å forberede prøven for sekrektoomgenerering, legg til opptil 400 ml av suspensjonen til en steril 2 L bunnforvirret kolbe.
    7. Plasser flasker på den sirkulære rotatoren i en 20 °C inkubator ved 100 rpm i 24 timer.

4. EV Rensing

  1. Høsting og fraksjonering
    1. Fjern 2L kolbe av ormer fra inkubatoren og pellet dyrene i 50 ml koniske hetteglass (500 x g i 2 min).
    2. Hell supernatanten gjennom et vakuumfilter på 0,22 μm for å fjerne partikkelavfall.
      MERK: På dette tidspunktet kan den filtrerte supernatanten som inneholder sekretomen og vesiklene lagres ved -80 °C.
    3. Tell antall dyr som beskrevet i trinn 2.
    4. Bestem ormens levedyktighet ved å plassere en dråpe suspenderte ormer på en bakteriell plen. Vent i 15 minutter og deretter score dyr som bevegelige, lammet, eller død.
    5. Konsentrat 0,22 μm filtrert supernatant til 700 μL ved hjelp av regenererte nitrocellulose 10 kDa filterenheter. Tilsett 150 μL S Basal oppløsning og deretter pipette over filteret og vortex. Gjenta 2x.
    6. Sentrifuge konsentrert supernatant på 18.000 x g i 20 min ved 4 °C og overfør supernatanten til et nytt rør. Dette trinnet fjerner eventuelle rester eller større partikler som kan ha akkumulert under håndtering.
    7. Tilsett proteasehemmeren cocktail + EDTA i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: På dette punktet kan den konsentrerte supernatanten som inneholder sekretomen og vesiklene lagres ved -80 °C.
  2. Kroatografi for størrelsesekskludering
    1. Hell 80–200 μm agaroseharpiks (porestørrelsesfraksjonsområde på 70 000 til 40 000 000 kDa for kuleproteiner) i en tom gravitasjonsstrømningskolonnepatron. Flow S Basal løsning til harpikssengen er pakket med et endelig volum på 10 ml.
      MERK: Hvis for mye harpiks helles i kolonnekassetten, spres du toppen av kolonnen og fjerner overflødig med en pipette.
    2. Pass 40 ml steril filtrert S Basal-løsning gjennom kolonnen og la den flyte under tyngdekraften.
      FORSIKTIG: Kontroller at harpiksen ikke er forstyrret.
    3. La bufferflyten til toppen av harpiksen ikke er nedsenket, og deretter begrense bunnen av kolonnekassetten. Plasser et samlingsrør under kolonnen.
    4. Fjern hetten som er plassert på kassetten. Legg til den konsentrerte sekresiomet oppnådd i trinn 2.1 dropwise til toppen av kolonnesengen. Pipette 1 ml S Basal oppløsning dropwise. Plasser et nytt oppsamlingsrør under kolonnen.
    5. Fyll langsomt det øvre kolonnereservoaret med 5 ml S Basal-løsning for ikke å forstyrre harpiksen. Samle de første 2 ml eluate deretter raskt endre rør og samle de neste 4 ml. Dette er fraksjonen som er beriket for EV-er.
    6. Konsentrer eluatet til 300 μL med et regenerert nitrocellulose 10 kDa molekylært vektkuttet (MWCO) filter og overføringen retensitelt til et lavbindende mikrocentrifugerør.
    7. Vask filtermembran 2x med 100 μL S Basal-oppløsning ved å vortexing i 20 s og pipetterbufferen over filteret. Legg til den første prøven for et endelig volum på 500 μL.
    8. Tilsett proteasehemmercocktail i henhold til produsentens instruksjoner.
    9. Utfør nedstrømsforsøkene umiddelbart (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS osv.) eller oppbevar esi på -80 °C.

5. Flyt cytometri kvantifisering av EV overflod

  1. Dye forberedelse
    1. Forbered en 10 mM lager av DI-8-ANEPPS ved hjelp av fersk DMSO. Fordel i 10 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
    2. Forbered en 1 mM arbeidsløsning ved å tilsette 90 μL sterilfiltrert PBS til et rør med 10 μL farger.
  2. Eksperimentell prøveforberedelse
    1. Tilsett 840 μL S Basal oppløsning i et mikrocentrifugerør. Tilsett deretter 60 μL av de rensede EV-ene som genereres i pkt. 4.2 og vortex.
    2. Aliquot 300 μL av prøven i to nye mikrocentrifugerør. Det er nå et eksperimentelt sett med tre rør som inneholder 300 μL av fortynnede EV-er hver. Merk rørene #1–3. Til prøver #2 og #3 tilsett 7 μL av DI-8-ANEPPS-aksjen tilberedt i 5,1,2. Tilsett deretter 7 μL 1% Triton-X 100 til røret #3. Bland hvert rør ved å virvle.
    3. Sonicate prøve #3 ved å plassere sonicator spissen i midten av prøven og pulserende 10 ganger ved 20% strøm 30% driftssyklus.
      FORSIKTIG: Kontroller at spissen av sonicatorsonden er midt i prøven, slik at skumgenerering holdes på et minimum. Skum kan kompromittere prøven ved å få EV-ene til å aggregere.
    4. Tilsett 300 μL S Basal oppløsning til to mikrostimulerende rør. Tilsett 7 μL av DI-8-ANNEPS arbeidsreagen som er utarbeidet i trinn 5.1 i det andre røret og merk "Dye Only". Merk det andre røret "Bare buffer".
      MERK: Klargjør bare dye- og bufferkontrollprøvene og de eksperimentelle prøvene med samme S Basal-kilde.
    5. Inkuber prøvene bort fra direkte lys og ved romtemperatur i 1 t.
  3. Gjennomføre FACS-eksperimenter.
    1. Sett FACS eksitasjonsfilteret til 488 nm (blå) og utslippsfilteret til 605 nm (oransje). Sett strømningshastigheten til 1,5 μL per min.
    2. Kjør nanobead FACS kalibreringsblanding (valgfritt, men anbefales).
    3. Kjør hver prøve på en FACS-maskin i 3 min .. Legg merke til de nøyaktige kjøretidene i løpet av sekunder.
  4. Analyser FACS-dataene.
    1. Åpne filer med FACS analyse programvare.
    2. Bytt Y-aksen til 488-Org (område) ved å klikke på aksen, og velge fra rullegardinmenyen.
    3. Angi en rektangulær port som starter øverst på tomten, som strekker seg fra SALS nivå 102 til 104 (<300 mnd. Utvid porten nedover til den inneholder 2,5% av de totale hendelsene. Gi porten navnet "DI-8-ANEPPS+"-hendelser.
  5. Kvantifisering av prøve EV overflod
    1. Kopier denne porten og lim den inn på de to andre prøvene i eksperimentelt sett, samt bufferbare og dye bare kontroller. Eksporter analysen til et regneark.
    2. Hvis FACS-prøvene ikke ble kjørt for de anbefalte 3 min (180 s), normaliserer du alle hendelsestellinger i prøven til hendelser per 180 s. Hvis et eksempel for eksempel ble kjørt for 250 s, skaleres DI-8-ANEPPS+-hendelsesnummeret med 250 s/180 s.
    3. Fjern bakgrunnshendelsene i fargeved å trekke fra antall DI-8-ANEPPS+-hendelser i dye-kontrollen bare fra de som er i eksempel#2.
    4. Fjern isotype bakgrunnshendelser ved å trekke fra antall DI-8-ANEPPS+-hendelser i eksempel#1.
    5. Fjern ufølsomme hendelser med vaskemiddel ved å trekke fra antall DI-8-ANEPPS+-hendelser i eksempel#3. Denne verdien er antall bona fide EV-er.
    6. Beregn antall EV-er i 1 μL prøve ved å dele verdien som er beregnet i trinn 5,5,5 med volumet som analyseres i μL (4,5 μL analysert som beskrevet i trinn 5.3) og multiplisere med fortynningsfaktoren (10x som beskrevet i trinn 2.5). Multipliser denne verdien med antall μL som gjenstår i EV-preparatet. Dette er antall EV-er tilgjengelig for nedstrøms analyse.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk flyt cytometri prøve forberedelse for å kvantifisere EV overflod. (A) EV-preparatet er delt inn i tre identiske prøver. Eksempel # 1 er Ingen Dye negativ kontroll. DI-8-ANEPPS legges deretter til prøver #2 og #3. Triton-X 100 legges deretter til eksempel #3. Den grønne pilen indikerer at bare prøve #3 senere sonikert. Dataene fra flyten bidrar til å bestemme det absolutte antallet vaskemiddelsensitive EV-er i FACS-prøvene og deretter beregne overflod av EV-er i det totale preparatet. Porten for å bestemme dye-positive hendelser er satt med prøve #1, som ikke inneholder noe dye. Den røde skrivingen på regnearkdataene er å illustrere at dye-positive hendelser fra den vaskemiddelbehandlede prøven trekkes fra prøven med dye. (B) Ligninger for kvantifisering av EV-er i en FACS analysert prøve og beregning av totalt antall EV-er i prøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

En skjematisk for prosessene som er nødvendige for å generere og rense EV-er, vises i figur 1. De typiske tidene som kreves for å fullføre hvert trinn, vises under. Figur 2 viser en skjematisk for klargjøring av prøver for FACS-analyse ved hjelp av DI-8-ANEPPS (figur 2A) samt beregningene som er nødvendige for å estimere totalt antall EV-er i et utvalg (figur 2B).

Representative resultater fra 10 biologiske replikater er vist i figur 3A. Variabiliteten mellom repliker er ikke signifikant, og den typiske S.E.M. av befolkningsstørrelse er litt over 10% (Figur 3B). Filtrering av ormene og dyrking på de friske høyvekstplatene vil generere en stor befolkning av gravid voksne egnet for blekemiddelsynkronisering. En enkelt sultet plate behandlet på denne måten kan produsere en eksperimentell befolkning på 1 x 106 eller mer synkronisert avkom fordi hver gravid voksen vil inneholde ca 10 egg. Det er mulig å opprettholde store populasjoner av utviklingssynkroniserte populasjoner ved å filtrere egg og larver gjennom et 40 μm filter for å få EV-er fra eldre dyr. Beholdt voksne overføres til friske høyvekstplater med en tetthet på 20.000 dyr per tallerken. Denne prosessen ble gjentatt annenhver dag. Figur 3C viser tre biologiske replikater av ormpopulasjoner som flyttes over tre plateoverføringer. Overføring av dyr mellom plater resulterer i omtrent 10% tap av dyr (Figur 3C) mens ca 20% av dyrene går tapt i sukrose flotasjon trinn (Figur 3D).

Figure 3
Figur 3: Kvantifisering av store populasjoner av C. elegans for EV-analyse. (A) En sammenligning av antall L1 larval stadium ormer isolert fra en enkelt nylig sultet (<24 h) høy vekstplate. Verdiene til hver av 10 biologiske replikater er plottet. Oppsummeringen av alle datapunktene i de 10 replikatene presenteres også som en fiolinplott og bar med S.E.M. Dette viser at en enkelt plate med nylig sultne ormer vil gi ~ 80.000 L1 larval stadium ormer. (B) S.E.M. av de 15 forskjellige platepopulasjonsmålingene i panel A plottet som individuelle punkter. Generelt er S.E.M. litt større enn 10%. (C) Tre biologiske replikater av ormpopulasjoner ble estimert etter hver av to overføringer mellom plater hver 4 h. Denne overføringen av dyr mellom plater resulterte ikke i en signifikant nedgang i befolkningsstørrelsen. Dette indikerer at metodikken som presenteres her for bevegelige ormer ikke resulterer i et betydelig tap av dyr. (D) Befolkningsmålinger tatt langs løpet av tre EV eksperimentelle replikerer: Antall dyr som ble anslått for de opprinnelige L1 larver som startet eksperimentet, antall unge voksne dyr gjenopprettet fra sukrose flyte og klar for 24 h inkubasjon perioden, antall dyr telles fra EV forberedelse ved utvinning av sekretoomet. Det er en liten, men ikke signifikant reduksjon av befolkningsstørrelsen mellom den første populasjonsestimeringen på L1 larval-stadiet og senere når dyrene er unge voksne. Gjennomsnittlig L1-populasjonsmåling ble utpekt som 100 % og alle andre målinger ble skalert av deres forhold til denne verdien. Feilfelt S.E.M. * = p-verdi < 0,05, N.S. = ikke signifikant i en parametrisk paret t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protein-til-dyr-forhold er en nyttig beregning for å karakterisere et EV-preparat. Denne målingen kan gi en rask måte å bestemme konsistensen mellom EV-preparater. I gjennomsnitt vil 1000 unge voksne dyr skille ut 1 μg proteiner som er større enn 10 kDa i deres miljø (Figur 4A). Når denne fraksjonen er ytterligere atskilt med størrelseseksklatografi, viser den totale proteinelutionprofilen en liten proteintopp mellom 2-6 ml og en stor topp etter 8 ml. EV-ene finnes i de første 5 ml i kolonnen eluate (Figur 4B). Nanopartikkelsporingsanalyse den første 5 ml av kolonnen unnvike inneholder en monodisperse populasjon av små, ~ 150 nm EV(Figur 4C). Overføring elektron mikroskopi av størrelse utelukkelse fraksjoner avslører rikelig EV i 2-6 ml brøkdel av eluat, men ikke i senere unnvike volumer. EV-er er kjent for sin kopplignende form og er derfor lett å diskriminere fra faste partikler som fremstår som punktatlyse prikker når de fremstilles under de negative flekkforholdene (figur 4D).

Figure 4
Figur 4: Rensing av C. elegans EV-er fra total utskilt biomasse. (A) Forholdet mellom de totale proteinene som er større enn 10 kDa, til antall ormer som ruges i preparatet for 10 biologiske replikater, ble plottet. De fleste preparater inneholdt 1 μg protein per 1000 dyr. (B) Protein elution profil fra en 10 ml harpiks kolonne lastet med 1 ml av konsentrert sekretoom. Fraksjonene som konsolideres i ytterligere analyser er skyggelagt i grupper. (C) Nanopartikkelsporingsanalyse av de konsoliderte harpikseluted fraksjonene 2–6 ml. 95% konfidensintervallet er skyggelagt grått. (D) TEM analyse av konsoliderte harpiks eluted fraksjoner. Startmaterialet hadde både vesikkellignende partikler og ikke-vesikkelpartikler. Den konsoliderte 2–6 ml elutionfraksjonen ble beriket for vesikler med få ikke-vesikkelpartikler. De 7–11 ml konsoliderte fraksjonene inneholdt få vesikkellignende partikler, men mange ikke-vesikkelpartikler. 12–15 ml elutionfraksjonene inneholdt bare ikke-vesikkelpartikler. Alle mikrografer er vist ved samme forstørrelse. Skala bar = 200 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å direkte sammenligne flytcytometriegenskapene mellom C. elegans og menneskelige EV-er, renset vi EV-er fra de betingede mediene til cellekulturer av menneskelige nevroner med denne metoden. Flow cytometri skiller partikler basert på lysspredning. Den lille vinkellysspredningen (SALS) korrelerer omtrent med størrelsen, og den lange lysspredningen (LALS) korrelerer med intern membranstruktur. De fleste av de totale prøvehendelsene fra både cellekultur og C. elegans EV-preparater er tett fokusert i en klynge sentrert rundt 103 SALS og 104 LALS (Figur 5A). Et histogrammet av C. elegans EV prøvehendelser sortert etter SALS viser at alle forberedelser topp på ~ 103 (Figur 5B).

Figure 5
Figur 5: C. elegans-EV-er er tydelig definert av deres lysspredningsegenskaper. (A)Histogram av SALS hendelser i tre biologiske replikerer av C. elegans EV. ~ 80% av de totale prøvehendelsene finnes i en stram, klart definert befolkning. I likhet med nanopartikkelsporingsanalyse viser den at størrelsesfordelingen av C. elegans-EV-er er monodisperst. Histogrammet til S Basal buffer som brukes til å fortynne prøvene er vist for sammenligning. (B) Sammenligning av brytningsegenskaper av C. elegans og human cellekultur EV renset med metodene som er beskrevet i denne teksten. Begge EV-typer presenterer konsekvent sammenlignbare kort- og langvinkellysspredningsfordelinger (SALS og LALS). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DI-8-ANEPPS etiketter cster cst-elegans EV-er, konsekvent fremhever et flertall av de totale hendelsene i både C. elegans og cellekultur avledede prøver. Kalibreringsperlene og kontrollene er presentert i figur 6A. De enkelte FACS scatter tomter er vist fra en C. elegans prøve utarbeidet fra 200.000 dyr (#1) og to utarbeidet fra 500.000 dyr (Figur 6B). Ev-er fra enten 100 ml (#1) eller 200 #2 ml cellekultur ble også analysert (figur 6C). Både C. elegans og cellekultur avledede prøver viste rikelig fluorescerende hendelser som forsvant når behandlet med 0,05% Triton-X 100 og lett sonikering. Dette viser at de merkede hendelsene er vaskemiddel labile fosfolipid strukturer (vesikler) i stedet for vaskemiddel-ufølsom solid lipoprotein aggregater. EV-overfloden beregnes som forskjellen mellom antall hendelser i DI-8-ANEPPS+-porten mellom fraksjonene uten vaskemiddel (-) og med vaskemiddel (+) minus hendelsene i Dye Only-kontrollen. For klarhet oppsummeres dataene individuelt i figur 6B og figur 6C som stolpegrafer i figur 6D og figur 6E. Overflod av rensede EV-er var ikke vesentlig forskjellig mellom C. elegans og cellekulturen avledede preparater (figur 6F).

Figure 6
Figur 6: Eksempler på flow cytometridata som brukes til å beregne EV-overflod. (A) For å sikre at antall hendelser kan sammenlignes direkte mellom prøver, må buffer- og dye-kontrollene bare kjøres med samme strømningshastighet og innsamlingstid som EV-prøvebrøkerne. Det er svært få hendelser i DI-8-ANEPPS gate. (B) Representative resultater av DI-8-ANEPPS og vaskemiddel behandlingsprotokoll fra C. elegans. Tre biologiske replikater vises. Biologisk replikatisering #1 ble utarbeidet av 200.000 dyr mens #2 og #3 ble utarbeidet fra 500.000 dyr. Forsvinningen av EV-er med vaskemiddelbehandlingen er i alle tilfeller klart. (C) Representative resultater av DI-8-ANEPPS og vaskemiddel behandlingsprotokoll ved hjelp av human celle kultur betinget media. Biologiske replikater #1 og #2 ble utarbeidet fra 200 ml betingede medier mens biologisk replika #3 ble utarbeidet fra 100 ml. (D)Bar graf av dataene samlet inn fra de tre biologiske replikerer av C. elegans EV. Feilfelt = S.E.M. Paret to-tailed t-tester mellom behandlinger. = p verdi < 0,001. (E) Bar graf av data samlet inn fra de tre biologiske replikerer av cellekultur avledede EV-er. Paret to-tailed t-tester mellom behandlinger. = p verdi < 0,001 (F) Antall fargemerkede vaskemiddelfølsomme hendelser per μL ble beregnet for alle biologiske replikater av C. elegans og cellekultur. Verdiene mellom de to EV-utvalgskildene er ikke vesentlig forskjellige. Paret to-tailed t-tester mellom behandlinger p verdi = 0,685. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1 inneholder de rå eksperimentelle verdiene for hele 4,5 μL av hver prøvetype som analyseres. Det totale antallet hendelser samlet inn fra EV-fraksjonene renset fra 500.000 dyr var 10–20x over bakgrunnsantallet partikler samlet inn av buffer alene, mens fraksjonen renset fra 200.000 dyr inneholdt ca. 2x så mange hendelser som buffer alene. Antall hendelser i DI-8-ANEPPS+-porten vises også for hvert utvalg. Disse beregningene kan importeres til et regneark for å beregne antall dye-positive, vaskemiddelfølsomme EV-er som beskrevet ovenfor. For eksempel beregnes antall EV-er i 1 ml av den første C. elegans biologiske replikaen som vises slik:

(18 974 – 3.853 - 1.487) x (10/4.5) x 1000 = 30.297.778.

Tabell 1: Cytometridata for tabellflyt. Dataene som vises i figur 6, presenteres som et regneark. For hvert eksempel vises de totale hendelsene og DI-8-ANEPPS+ inngjerdede hendelser. Hver biologiske replika er ordnet i rekkefølgen av prøver #1-3 i protokollen. Disse beregningene viser at det totale antallet hendelser samlet inn fra C. elegans prøver utarbeidet fra 500.000 dyr eller 200 ml cellekultur betinget media var 10-20x over bakgrunnsantall partikler samlet inn av buffer alene mens den biologiske replikere renset fra 200.000 dyr inneholdt ca 2x så mange totale hendelser som buffer alene. Antall hendelser i DI-8-ANEPPS+-porten vises også for hvert utvalg. Disse beregningene kan eksporteres til et regneark for å beregne det totale antallet EV-er. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Discussion

En grunnleggende utfordring for EV-feltet er å skille det brede utvalget av EV-undertyper2. Metodene som er beskrevet her, bruker filtrering, differensentrifugering og størrelsesekskluderingskromatografi for å generere en ren populasjon av små EV-er fordi ~ 100 nm EV-er tidligere ble vist seg å være utskilt i det ytre miljø og funksjon i fysiologisk relevante kommunikasjonsveier16. EV-er renset gjennom størrelsesekskluderingskromatografi kan fortsatt være en blanding av eksosomer og små mikrovesikler fordi disse EV-underklassene er tilsvarende store. Virveldyr EV underklasser er vanligvis atskilt med immunnedbør fordi denne metoden isolerer EV gjennom binding til selektive membranproteinmarkører. Metodene som er beskrevet letter identifiseringen av C. elegans EV membranmarkørproteiner. Derfor kan det i fremtiden være mulig å ytterligere skille små EV-underklasser gjennom analoge immunnedbørsmetoder. I teorien kan immunnedbør isolere EV-er fra godt matet ormer fordi E. coli-EV-er ikke bør samhandle med antistoffet. Forskere som er interessert i å identifisere protein og genetisklaster av større EV underklasser (> 200 nm) kan gjøre det ved å hoppe over 0,22 μm filtrering trinn og deretter analysere pellet i stedet for supernatant. Avdekke protein og genetisk last overflod av store EV-er vil etablere en mer omfattende forståelse av fysiologiske prosesser som fungerer gjennom C. elegans secretome. I tillegg til å bli utskilt i miljøet, overføres C. elegans-EV-er internt mellom vev. Derfor isolerer disse metodene bare et delsett av totale C. elegans-EV-er. Lastoppdagelse av interne EV-er er imidlertid ikke mulig fordi det ikke finnes noen metode for å skille EV-er fra lysed ormer. Lastanalyse av denne eksternt utskillede EV-undergruppen gir også et middel til å identifisere potensielle generelle EV-proteinmarkører som kan merke interne EV-er.

Omfanget av EV-preparatet vil avhenge av kravene til eksperimentet. Totalt 500 000 unge voksne gir nok EV-er til å gjennomføre flow cytometri, LC-MS-MS og RNAseq analyse parallelt. Dette tallet kan skaleres opp eller ned avhengig av de eksperimentelle behovene. Den største praktiske faktoren for oppskalering er antall 10 cm høye vekstplater som kreves. Høye vekstplater tilberedt med 500 μL av 20x konsentrert over natten NA22 kultur vil støtte en befolkning på ~ 50.000 voksne fra L1 larval scenen til den første dagen i voksen alder. Derfor, for å gjennomføre et eksperiment med 500.000 voksne, er det nødvendig med 13 høyvekstplater: en tallerken for å generere befolkningen i L1s, to plater for å generere de voksne for bleking, og 10 plater for veksten av de eksperimentelle dyrene. Disse beregningene er betinget av seeding og bakteriellvekst forhold av høy vekst plater. Derfor anbefales det å lage alle platene på en standardisert måte og deretter kalibrere med kjente mengder dyr.

Ormer telles på to stadier under dyrkingsprosessen: 1) før seeding ormer på plater og 2) før du genererer de betingede mediene. Dyredyrkingstetthet har vist seg å påvirke atferd, utvikling og stressrespons15,16,17,18 og kan derfor også påvirke EV-laster. Derfor, for konsekvent dyrking tetthet er det nødvendig å nøyaktig estimere orm populasjoner. Kvantifisere antall ormer i ni dråper gir statistisk tillit til populasjonsestimeringer. Det er viktig å behandle hver dråpe individuelt, virvlende mellom hver dråpe og sette pipetten samme avstand inn i ormsuspensjonen. Å ta disse forholdsreglene vil sikre S.E.M. verdier på ~ 5-10% av den totale befolkningen. Hvis S.E.M. for en orm populasjon er høyere enn 20%, så noe gikk galt.

Etter den 24 h bakteriefrie inkubasjonsperioden kryper unge, ville type C. elegans umiddelbart etter tillegg til en bakteriell plen. Dette indikerer at inkubasjonen ikke alvorlig påvirker helsen deres. Dette trinnet påvirker imidlertid dyrenes fysiologi og kan derfor påvirke sammensetningen av EV-lastene. Derfor, når du arbeider med svært syke genotyper eller eldre dyr, er det viktig å sjekke levedyktighet etter inkubasjonstrinnet. Hvis alle dyr ikke overlever inkubasjonen, øker du den eksperimentelle populasjonsstørrelsen og reduserer inkubasjonstiden. Når du arbeider med store mengder av betingede medier, er det mer praktisk å bruke en rørt cellekonsentrator med et filter laget av regenerert nitrocellulose. EV-er binder seg ikke til denne filterkjemien like sterkt som andre filtertyper14.

Forholdet mellom det totale proteinet som er gjenvunnet fra de betingede mediene til antall dyr som ruges for å gjøre preparatet er en nyttig beregning. Hvis dette forholdet er mye høyere enn forventet, er det mulig at populasjonsestimeringene var av eller at dyr døde og forverret seg i de betingede mediene. Hvis dette forholdet er mye lavere enn forventet, kan noe protein ha gått tapt på filtrene under konsentrasjonsprosessen. Mens FACS-metodene direkte kvantifiserer EV-ene i preparatet, er denne målingen nyttig fordi den kan markere eksempelavvik tidlig i prosessen. En annen nyttig metode for å verifisere kvaliteten på EV-preparatet er overføringselektronmikroskopi, som vist i figur 4D. Selv om protokollen for overføring elektron mikroskopi ikke er formelt inkludert i denne metoden artikkelen på grunn av lengde, det kan utføres av standardmetoder. Det anbefales å gjennomføre denne typen analyse, i hvert fall i utgangspunktet, som en gratis metode til FACS for å vurdere kvaliteten på EV-preparater. For best resultat bruk nyutladet formvar-karbongitter og beis prøvene med 2% fosforsyre i stedet for uranylacetat.

DI-8-ANEPPS ble valgt fordi det har vist seg å kvantitativt merke EV membraner, outperforming andre generelle EV fargestoffer med menneskelige biopsi prøver og liposomer25. Målingene er raske, og tar bare 3 min innsamlingstid for hver prøve. Kvantifiseringen av vaskemiddelfølsomme EV-er har direkte funksjonell betydning fordi den utnytter et grunnleggende fysisk skille mellom EV-er og solide lipoproteinaggregater. Viktigere, denne metoden påvirkes ikke av mengden av totalt protein eller antall ikke-EV aggregater og kan derfor kvantifisere EV-er oppnådd gjennom ulike rensemetoder på en objektiv måte. FACS-verifisert EV-målingen vi beskriver her, vil være spesielt nyttig for studier som viser fysiologiske konsekvenser av rensede EV-er. Det kan også være til nytte for EV-feltet generelt å etablere en FACS-metodikk som en universell beregning, slik at absolutte EV-overfloder kan sammenlignes direkte på tvers av studier. Vitale fargestoffer kan også merke C. elegans EV,men de er ikke så lyse som EV-er merket med Di-8-ANEPPS.

Denne rensetilnærmingen utnytter den aktive sekresjonen av EV-er utenfor kroppene til intakte, levende ormer. Dette gjør det mulig for C. elegans EV-er å isoleres ved sammenlignbar renhet og overflod som fra cellekultur, spesifikasjoner som er tilstrekkelige for å identifisere hundrevis av protein- og RNA-laster via LC-MS- ms- og RNAseq-analyse26. Dermed kan det store biblioteket av reagenser tilgjengelig for C. elegans forskning utnyttes for å undersøke påvirkning av den genetiske og fysiologiske perturbasjonen på EV-lastsammensetning.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi anerkjenner takknemlig Nick Terzopoulos for ormplater og reagenser; Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ved NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) for N2 nematode linjen; Lucia Vojtech, PhD, for hjelp med nanopartikkelsporingsanalysen; Jessica Young, PhD, og Marie Claire, MD, PhD, for hiPSC-avledet nevronal betinget cellemedia; Wai Pang for å få hjelp med TEM-bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendet P30AG013280 til MK og NIH-bevilgning AG054098 til JCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05% to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2 L bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  3. Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
  4. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
  5. Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).
  6. Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589 (2013).
  7. Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
  8. Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  9. Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
  10. Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
  11. Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069 (2019).
  12. Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
  13. Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
  14. Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
  15. Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
  16. Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
  17. Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
  18. Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
  20. Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502 (2016).
  21. Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940 (2016).
  22. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  23. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  24. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
  25. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
  26. Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).

Tags

Biologi Utgave 157 flow cytometri DI-8-ANEPPS størrelse utelukkelse kromatografi flow cytometri stor populasjon C. elegans vedlikehold
Rensing og analyse av <em>Caenorhabditis elegans</em> Ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Russell, J. C., Postupna, N.,… More

Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter