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Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

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DOI:

10.3791/60599

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20. Februar 2020

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1Division of Infectious Diseases, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Immunology, Stanford University, 3Palo Alto Veterans Institute of Research

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein verzögertes Impfprotokoll zur Erzeugung chronischer Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein großer nosokomialer Erreger von zunehmender Relevanz für die menschliche Gesundheit und Krankheit, insbesondere bei chronischen Wundinfektionen bei Diabetikern und stationären Patienten. Es besteht ein dringender Bedarf an chronischen Infektionsmodellen, die bei der Untersuchung der Wundpathogenese und der Entwicklung neuer Therapien gegen diesen Erreger helfen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine verzögerte Impfung 24 Stunden nach der exzisionalen Verwundung mit voller Dicke verwendet. Die Infektion der provisorischen Wundmatrix, die zu diesem Zeitpunkt vorhanden ist, versichre entweder eine schnelle Clearance oder Verbreitung von Infektionen und stellt stattdessen eine chronische Infektion fest, die 7–10 Tage dauert, ohne dass Fremdstoffe implantation oder Immunsuppression erforderlich sind. Dieses Protokoll imitiert einen typischen zeitlichen Verlauf einer postoperativen Infektion beim Menschen. Die Verwendung eines lumineszierenden P. aeruginosa-Stamms (PAO1:lux) ermöglicht eine quantitative tägliche Beurteilung der bakteriellen Belastung für P. aeruginosa Wundinfektionen. Dieses neuartige Modell kann ein nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der bakteriellen Pathogenese und der Entwicklung neuer Therapien für chronische P. aeruginosa Wundinfektionen sein.

Einleitung

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein gramnegatives, stabförmiges Bakterium mit zunehmender Relevanz für die menschliche Gesundheit und Krankheit. Es ist verantwortlich für eine umfangreiche Morbidität und Mortalität in nosokomialen Umgebungen, insbesondere mit Wundinfektionen bei immungeschwächten Patienten1,2. Das Aufkommen multiresistenter Stämme dieses Erregers hat weitere Impulse für die Untersuchung von Faktoren gegeben, die zur Virulenz von P. aeruginosa, Mechanismen der Antibiotikaresistenz von P. aeruginosa und neuen Methoden zur Vorbeugung und Behandlung dieser tödlichen Infektion beitragen3. Daher war der Bedarf an Tiermodellen chronischer Wundinfektionen als Werkzeuge zur Untersuchung dieser Forschungsfragen noch nie so groß.

Leider neigen viele Tiermodelle der P. aeruginosa-Infektion dazu, eine akute Infektion mit schneller Auflösung der Infektion oder einem schnellen Rückgang aufgrund der Sepsis4,5zu simulieren, was die oft chronische Natur dieser Infektionen nicht ausreichend simuliert. Um diesen Nachteil zu beheben, nutzen einige Modelle die Implantation von Fremdkörpern wie Agarperlen, Silikonimplantaten oder Alginatgelen6,7,8. Andere Modelle verwenden Mäuse, die aufgrund des fortgeschrittenen Alters, Adipositas oder Diabetes immungeschwächt sind, oder durch pharmakologische Mittel wie Cyclophosphamid-induzierte Neutropenie9,10,11,12. Jedoch, entweder die Verwendung von Fremdstoffen oder immungeschwächte Wirte verändert wahrscheinlich den lokalen Entzündungsprozess, so dass es schwierig, ein Verständnis der Pathophysiologie in chronischen Wundinfektionen bei Wirten mit ansonsten normalen Immunsystem beteiligt zu gewinnen.

Wir haben ein chronisches Modell der P. aeruginosa Wundinfektion bei Mäusen entwickelt, das eine verzögerte Impfung mit Bakterien nach exzisionalen Wunden beinhaltet. Verzögerte Impfung ermöglicht Experimente zur Beurteilung der bakteriellen Belastung, die sich auf mindestens 7 Tage ausdehnt. Dieses Modell eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung sowohl pathogenese als auch neuer Behandlungen von chronischen Infektionen mit P. aeruginosa.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.

1. Vorbereitung und Wachstum von Bakterien

  1. Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Tieren mit BSL-2-Vorkehrungen gemäß den Richtlinien des institutionellen Ausschusses für biosicherheitspolitische Sicherheit und Tierverwendungsausschüsse des Forschers durch. Führen Sie alle hier beschriebenen Schritte mit P. aeruginosa, einschließlich der Mausimpfung, in einem Biosicherheitsschrank aus.
  2. Der leuchtende PAO1:lux-Stamm von P. aeruginosa ist auf Anfrage in unserem Labor erhältlich. Streak PAO1, gelagert als gefrorener Glycerinbestand, auf Lysogeny Broth (LB) Agar. Für den lumineszierenden PAO1:lux-Stamm sollte LB-Agar selektive Antibiotika enthalten (100 g/ml Carbenicillin und 12,5 g/ml Kanamycin). Wachsen Sie bei 37 °C über Nacht in einem bakteriellen Inkubator.
  3. Wählen Sie eine isolierte Kolonie und wachsen Sie über Nacht bei 37 °C in 3 ml LB Medium, pH 7,4. Bei lumineszierenden Stämmen sollte die Brühe 100 g/ml Carbenicillin enthalten. Wachsen Sie unter schüttelnden, aeroben Bedingungen.

2. Verfahrensvorbereitung

  1. Lassen Sie alle Mitarbeiter, die eine Operation durchführen, ein sauberes Kleid/Lab-Mantel, Gesichtsmaske, Haarnetz und Handschuhe tragen.
  2. Autoklaven Sie alle chirurgischen Werkzeuge, einschließlich Schere und Zange. Verwenden Sie aseptische Technik, um Werkzeuge zwischen Tieren zu sterilisieren.
  3. Reinigen Sie den OPERATIONStisch mit Ethanol und bereiten Sie ein sauberes Operationsfeld vor.

3. Haarentfernung

  1. Anästhetisieren Sie 8–12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse mit 1%–3% Isofluran. Die Ermittler sollten die Richtlinien des Veterinärpersonals ihrer Institution für anästhesien befolgen, wenn isoflurane verwendet werden.
    1. Starten Sie die Anästhesie, indem Sie 1%–3% Isofluran liefern und den Sauerstoffdurchfluss auf 1,5 l/min einstellen. Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer.
    2. Pinch die Maus Zehen, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen. Wenn die Maus nicht mehr auf Stimulation reagiert, entfernen Sie sie aus der Induktionskammer und legen Sie sie mit der Nase in den Isofluran-Nasenkegel auf die Operationsbank.
    3. Okularschmierstoff auf beide Augen auftragen.
  2. Wiegen Sie die Maus, um ein Grundgewicht vor der Prozedur zu erhalten.
  3. Stellen Sie die Maus in eine anfällige Position. Injizieren Sie die Maus subkutan mit vorgewärmten sterilen 0,9% Natriumchlorid, 250 l an jeder Flanke für insgesamt 500 l.
  4. Rasieren Sie den dorsalen Bereich der Maus mit einem elektrischen Rasierer. Die Rasur sollte an einem anderen Ort als der chirurgischen Station erfolgen, um eine Haarkontamination der Wunde zu verhindern.
  5. Tragen Sie eine dünne Schicht Haarentfernung Lotion. Lassen Sie die Lotion für 20-60 s sitzen. Entfernen Sie das Haar und überschüssige Lotion mit Gaze in warmem Wasser befeuchtet. Nach der Haarentfernung, gehen Sie mit dem exzisionalen Verwundungsverfahren.

4. Volle Dicke exzisionale Wundchirurgie

  1. Injizieren Sie das subkutane Buprenorphin 0,6–1 mg/kg subkutan mit einer 25 G Nadel im mittleren Dorsalen bereich der Maus. Langsame Freisetzung Buprenorphin bietet Schmerzlinderung über 48-72 h.
  2. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle. Wischen Sie die dorsale Oberfläche mit einem sterilen Betadine-Tupfer ab. Überschüssiges Betadin mit einem sterilen Alkoholtupfer abwischen. Dies sollte 3 Mal durchgeführt werden (abwechselnd zwischen Betadin und Alkohol), Abstriche, indem sie sich von der Mitte in einer kreisförmigen Weise an den Rand bewegen. Lassen Sie den Bereich trocknen.
  3. Erstellen Sie einen Vorhang, der die chirurgische Stelle mit steriler Gaze oder Kunststoff-Klebefolie umgibt.
  4. Stretch Haut straff kaudal. Verwenden Sie einen sterilen Hautbiopsie-Punch mit 6 mm Durchmesser, um einen ersten Schnitt durch die linke dorsale Epidermis zu machen. Wiederholen Sie dies auf der rechten dorsalen Epidermis.
  5. Verwenden Sie Zangen, um die Haut aus der Mitte des links umrissenen Wundbereichs zu zelten. Verbrauchen Sie die epidermalen und dermalen Schichten mit einer Schere. Wiederholen Sie dies auf der rechten Umrissbereich, um symmetrische Exzisionswunden zu erstellen.
  6. Wunden mit 50 l steriler Saline waschen. Lassen Sie die chirurgische Stelle und die umgebende Haut trocknen. Dann bedecken Sie die Wunden und dorsum mit einem transparenten Filmverband.
  7. Legen Sie die Maus wieder in einen sauberen Käfig. Haus 1 Tier pro Käfig.
  8. Legen Sie den Käfig auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis die Maus aufwacht.
  9. Wenn Sie die oben genannte Operation an mehreren Tieren durchführen, verwenden Sie einen heißen Perlensterilisator, um alle chirurgischen Instrumente zwischen den Tieren zu reinigen.
  10. Erlauben Sie 24 h für die Mäuse, sich vom chirurgischen Eingriff zu erholen und eine provisorische Wundmatrix über den Wunden zu bilden, bevor Sie mit Bakterien impfen.

5. Impfung mit P. aeruginosa

  1. Über Nacht PAO1:lux-Kultur auf OD600 = 0,05 in 75 ml LB-Medien verdünnen, die 100 g/ml Carbenicillin enthalten, und die Bakterien wachsen, bis sich die Kultur in einer frühen exponentiellen Phase befindet (OD600 x 0,3). Dies sollte etwa 2-3 h dauern.
  2. PAO1:lux in PBS auf eine Konzentration von (7,5 x 2,5) x 102 KBE/ml verdünnen. Achten Sie darauf, überschüssiges Inokulum vorzubereiten, um ausreichend Volumen zu gewährleisten und eine Beschichtung nach dem Experiment zu ermöglichen. Wenn Sie zwischen Einrichtungen (d.h. vom Labor zum Vivarium) transportieren, verwenden Sie die doppelte Einschließung in einer leckagenden Box mit deutlich emprogdiengeschützter Aufschrift Biohazard.
  3. Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Mäusen mit zugelassener persönlicher Schutzausrüstung in einem tierbiologischen Sicherheitsschrank (ABSL-2) durch, der für biologische Sicherheit (BSC) zugelassen ist. Wiederverwendbare Geräte wie die Waage sollten mit Einertinkelfolie abgedeckt werden, um eine Kontamination zu verhindern.
  4. Anästhetisieren mit 3% Isofluran, wie oben beschrieben. Wiegen Sie die Maus und zeichnen Sie das Gewicht auf. Injizieren Sie die Maus subkutan mit vorgewärmten sterilen 0,9% Natriumchlorid, 250 l an jeder Flanke für insgesamt 500 l.
  5. Wenn das transparente Filmdressing der Maus über Nacht abgekommen ist, entfernen Sie alle resultierenden Schorf sorgfältig und ziehen Sie ein neues Dressing an.
  6. Verwenden Sie eine 500-L-Tuberkulin-27-G-Sicherheitskappenspritze, um 40 l der PAO1:lux-Suspension durch den transparenten Folienverband in jede Wunde zu injizieren. Verschiedene Mäuse sollten für nicht geimpfte/PBS-Wundkontrollen verwendet werden, um kreuzkontaminationen von der kontralateralen Seite zu verhindern.
  7. Legen Sie die Maus wieder in ihren Käfig auf einem Heizkissen und überwachen Sie, bis sie aufwacht. Alle Mäuse sollten einzeln in separaten Käfigen untergebracht werden, um kreuzkontaminationen zu verhindern.
  8. Bieten Sie kalorienreiche Nahrungsergänzungsmittel Paste zwischen Lebensmittelpellets auf dem Boden des Käfigs eingeklemmt.
  9. Verwenden Sie das restliche Inokulum, um eine LB-Agarplatte zu streichen. Zählen Sie Kolonien, um die Anzahl der verabreichten Bakterien zu bestätigen.

6. In-vivo-Bildgebung infizierter Wunden

  1. Befolgen Sie die BSL-2-Containment-Protokolle für den Transport von Mäusen zum und vom Bildgebungsinstrument, einschließlich der Verwendung eines sekundären Behälters. Achten Sie darauf, während des Transfers der Maus in die Induktionskammer oder das Bildgebungsinstrument keine Tierbetten zu übertragen oder fallen zu lassen.
  2. Induzieren Sie die Anästhesie der Maus mit inhaliertem 1%–3% Isofluran in einer Induktionskammer, wie in Schritt 3.1 beschrieben.
  3. Sobald die Maus anästhesiert ist, legen Sie sie in eine anfällige Position in der Bildkammer eines optischen Bildgebungssystems mit der Nase im Isofluran-Nasenkegel.
  4. Öffnen Sie das Softwareprogramm.
  5. Die Erfassungsparameter variieren je nach Anzahl der gleichzeitig abgebildeten Tiere und der Intensität der Biolumineszenz. Zu den festzulegenden grundlegenden Parametern gehören Belichtungszeit, Binning, f/Stop und Sichtfeld (FOV). Unsere Standard-Starteinstellungen sind Belichtungszeit 30 Sekunden, Binning low (2), f/stop 1.2 und FOV 25. Passen Sie diese Einstellungen je nach Bedarf an den Anforderungen des Forschers an.
  6. Analysieren von Lumineszenzdaten mithilfe eines Bildgebungsprogramms (siehe Tabelle der Materialien). Lumineszenz wird als Pseudofarbbild dargestellt, das auf einem Farbfoto der Mäuse überlagert wird.
    1. Erstellen Sie eine Region von Interesse (ROI) an der Wundstelle und messen Sie den durchschnittlichen Fluss (Photonen/Sekunde) gemessen. Beachten Sie, dass Daten auch als Ausstrahlung (Photonen/Sekunde/cm2/Steradian) gemeldet werden können, aber solange der Abstand der Bildplattform von der Kamera zwischen der Bildgebung konstant bleibt, ist der Fluss ausreichend.
    2. Messen Sie den Hintergrund, indem Sie einen ROI in einem zufälligen Bereich auf der Bildverarbeitungsplattform erstellen. Subtrahieren Sie die Hintergrundanzahl der Photonen/Sekunde.
    3. Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse in eine Kalkulationstabelle.
  7. Führen Sie die Bildgebung wie oben beschrieben so oft wie täglich durchzuführen, um das Fortschreiten der Infektion zu verfolgen.

7. Postoperatives Management

  1. Überwachen Sie Mäuse gemäß den Richtlinien des IACUC-Protokolls des Forschers. Wir überwachen alle Mäuse täglich für die ersten 4 Tage, dann jeden zweiten Tag bis zum Ende des Experiments. Wiegen Sie die Mäuse einmal täglich für die ersten 4 Tage nach der Operation in einem BSC. In jizieren Sie an den Tagen 1 und 2 an den Tagen 1 und 2 2 250 l 0,9 % Natriumchlorid subkutan injizieren.
  2. Überprüfen Sie auf Anzeichen von Schmerzen/Distress bei den Mäusen, einschließlich geknickter Körperhaltung, schroffer Mantel, Lethargie, Atembeschwerden, Gesichtsgrimassen und Gewichtsverlust.
  3. Wenn Tiere Anzeichen einer Verschlechterung der Gesundheit zeigen, konsultieren Sie einen Tierarzt. Jede Maus, die sich verschlimmernde Anzeichen von Schmerz/Not und einen Gewichtsverlust von 20% oder mehr zu zeigen scheint, sollte eingeschläfert werden.

8. Wundexzision

  1. Am Ende des Experiments opfern Sie die Mäuse mit CO2-Inhalation, gefolgt von zervikalen Dislokationen. Entsorgen Sie den Tierkadaver gemäß den ABSL-2-Protokollen der Institution.
  2. Verbrauchen Sie Wundbetten mit steriler Schere und Zange in einem BSC. Legen Sie jedes Wundbett in 1 ml steriles PBS in ein 1,5 ml Polypropylenrohr. Das Wundgewebe mit einer Schere zerkleinern. Alle Wunden sollten als ASBL-2 behandelt werden, auch wenn sie nicht als infiziert gelten.
  3. Auf einem Shaker bei 300 Umdrehungen pro Minute für 2 h bei 4 °C inkubieren. Wirbel jede Röhre für 10 s und seriell verdünnen die bakteriellen Abwässer in PBS. Die verdünnten bakteriellen Abwässer auf LB-Agar auftragen, um die bakterielle Belastung aufzuzählen.
  4. Betrachten Sie Wunden infiziert, wenn Lumineszenz signal in der Wunde ist über Hintergrund Lumineszenz und mehr Bakterien in der Wunde Abwasser als in Wunden mit PBS als Kontrolle geimpft erkannt werden.

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Ergebnisse

Mit einem lumineszierenden PaO1-Stamm mit einem Plasmid, das für das luxABCDE-Reportersystem (PAO1:lux) kodiert, führten wir exzisierende Verwundungen an Mäusen durch, impften diese Wunden mit planktonischem P. aeruginosa 24 h später und maßen die bakterielle Belastung im Laufe der Zeit(Abbildung 1 und Abbildung 2). Ein repräsentatives Bild, das mit einem optischen Bildsystem gewonnen wurde, zeigt, dass dieses Modell zu ...

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Diskussion

Wir haben ein neuartiges Modell für die verzögerte Impfung P. aeruginosa Wundinfektion entwickelt. Die Strategie, die Impfung mit Bakterien nach exzissiver Verwundung um 24 stunden zu verzögern, ermöglicht die Bewertung von Wundinfektionen über einen Zeitraum von einer Woche. Durch die Verwendung eines lumineszierenden Stammes von P. aeruginosaist es möglich, das Infektionsverlauf während des Infektionsverlaufs zu verfolgen. Der längere Infektionsverlauf im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Infekti...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Der pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 Leuchtkonstruktvektor war ein gnädiges Geschenk von J. Hardy. Schemata wurden mit BioRender.com erstellt. Wir danken dem Labor von G. Gurtner für ihre Ratschläge zum Wundinfektionsmodell. Wir danken auch T. Doyle vom Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging für sein technisches Know-how. Diese Arbeit wurde durch Stipendien R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 und Stipendien von Stanford SPARK, dem Falk Medical Research Trust und der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) an P.L.B. C.R.D unterstützt, die von T32AI007502 unterstützt wurde. Ein Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering und ein Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship unterstützten J.M.S.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % Natriumchlorid-InjektionHospira2484457
18 G x 1 sterile NadelBD305195
25 G x 1 1/5 sterile NadelBD305127
AlkoholtupferBD326895
Aura Imaging SoftwareSpectral Instruments Imagingn/a
BetadinePurdue Frederick Company19-065534
Buprenorphin SR LABZoopharmn/a
C57BL/6J männliche MäuseThe Jackson Laboratory000664
Einweg-Biopsie-Stanze, 6mmIntegra33-36
Feine Schere - WolframkarbidFine Science Tools14568-09
Glasperlen-TrockensterilisatorHarvard-Gerät61-0183
Granulierter AgarFisher BioReagentsBP9744
HeizkissenMilliard804879481218
Insulinspritze mit 28 G NadelBD329461
Lago X Imaging SystemSpectral Instruments Imagingn/a
LB BouillonFisher BioReagentsBP1426
Leur-Lok 1 mL SpritzeBD309628
Mini Arco TiertrimmerWahl Professional919152
Nair Haarentfernungslotion mit BabyölChurch und Dwightn/aIn jeder Apotheke erhältlich
Octagon PinzetteFine Science Tools11041-08
PetrischaleFalke351029
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1xCorning21-040-CV
Press and Seal FrischhaltefolieGladn/a
SafetyGlide Insulinspritze mit 30 G NadelBD305934
Safetyglide Insulin Spritze, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TWBD305934
ScaleOhaus Scout ProSP202
Supplical NahrungsergänzungsmittelHenry Schein Tiergesundheit29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm3M1624W

Referenzen

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Schlagwörter

Biolumineszenz ImagingKoloniez hlungvollschichtige VerwundungBakterienlastchronisches InfektionsmodellWirt Pathogen InteraktionenBSL 2 Sicherheit

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