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Methodenartikel

In Vivo-Infektion mit Leishmania amazonensis zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen

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DOI:

10.3791/60617

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20. Februar 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein zusammengestelltes Protokoll zur Bewertung der Hautinfektion von Mäusen mit Leishmania amazonensisvor. Dies ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Virrulenz von Parasiten, die eine systemische Ansicht der Wirbeltier-Wirtsreaktion auf die Infektion ermöglicht.

Zusammenfassung

Leishmania spp. sind protozoische Parasiten, die Leishmanien verursachen, Krankheiten, die ein breites Spektrum klinischer Manifestationen von haut- bis viszeralen Läsionen darstellen. Derzeit sind schätzungsweise 12 Millionen Menschen weltweit mit Leishmania infiziert, und über 1 Milliarde Menschen sind von infektionsgefährdet. Leishmania amazonensis ist in Mittel- und Südamerika endemisch und führt in der Regel zur hautförmigen Form der Krankheit, die in einem Tiermodell direkt visualisiert werden kann. Daher sind L. amazonensis Stämme gute Modelle für kutane Leishmaniose-Studien, weil sie auch leicht in vitro kultiviert werden können. C57BL/6-Mäuse imitieren die l. amazonensisgetriebeneKrankheitsprogression, die beim Menschen beobachtet wurde, und gelten als eines der besten Mäusestämme modellieren für kutane Leishmaniose. Im Wirbeltierwirt bewohnen diese Parasiten Makrophagen trotz der Abwehrmechanismen dieser Zellen. Mehrere Studien verwenden In-vitro-Makrophagen-Infektionstests, um die Parasiteninfektiosität unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Der In-vitro-Ansatz beschränkt sich jedoch auf ein isoliertes Zellsystem, das die Reaktion des Organismus außer Acht lässt. Hier stellen wir eine in vivo murinierte Infektionsmethode zusammen, die einen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Wechselwirkung bietet. Das detaillierte Protokoll zur In-vivo-Infektion von C57BL/6-Mäusen mit L. amazonensis umfasst die Parasitendifferenzierung in infektiöse Amastigoten, Mäusefootpad-Kutane-Impfung, Läsionsentwicklung und Parasitenlastbestimmung. Wir schlagen diese etablierte Methode als die am besten geeignete Methode für physiologische Studien des Wirts Immun- und Stoffwechselreaktionen auf hautnahe Leishmaniose vor.

Einleitung

Leishmanien sind weltweit weit verbreitete parasitäre Infektionskrankheiten, die in Entwicklungsländern eine wichtige Herausforderung darstellen und von der Weltgesundheitsorganisation1,2als eine der wichtigsten vernachlässigten Tropenkrankheiten anerkannt werden. Die Leishmanien sind durch haut-, schleimhaut- und/oder viszerale Manifestationen gekennzeichnet. Kutane Leishmaniose wird in der Regel durch L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica und L. aethiopica3verursacht. Diese Form der Krankheit ist oft Selbstheilung beim Menschen aufgrund der Induktion der schützenden zellulären Immunantwort. Jedoch, die zelluläre Immunantwort kann fehlschlagen, und die Krankheit kann zu verbreiten cutaneous Leishmaniasisfortschreiten 4,5. Aufgrund der Vielfalt unter den Leishmanien-Arten und dem genetischen Hintergrund der Wirtszeit gibt es keinen Impfstoff6,7. Behandlungsmöglichkeiten sind auch begrenzt, da die meisten der derzeit verfügbaren Medikamente entweder teuer, toxisch und/oder kann langfristige Behandlung erfordern8,9. Außerdem gab es Berichte über Arzneimittelresistenz entogen gegen die verfügbaren Behandlungen10,11.

Der Erreger der Leishmanien ist der protozoische Parasit Leishmanien. Der Parasit stellt zwei verschiedene morphologische Formen in seinem Lebenszyklus dar: Promastigoten, die flagellated Form in Sandfliegen gefunden; und Amastigoten, die intrazelluläre Form, die in den parasitopholen Vakuolen des Säugetierwirts Makrophagen12,13gefunden wird. Die Fähigkeit von Amastigotes, trotz der Abwehrmechanismen der Makrophagen des Wirbeltierwirts einzudringen, zu überleben und zu replizieren, unterliegt vielen Studien14,15,16,17. Daher haben mehrere Forschungsgruppen In-vitro-Makrophagen-Infektionstests beschrieben, um die Auswirkungen spezifischer Umweltfaktoren sowie von Parasiten- und Wirtsgenen auf die Parasiteninfektiosität zu bewerten. Dieser Test bietet mehrere Vorteile, wie die Fähigkeit, Studien an ein Format mit hohem Durchsatz anzupassen, einen relativ kürzeren Zeitraum, um Ergebnisse zu erzielen, und eine geringere Anzahl von Labortieren, die18geopfert wurden. Die Ergebnisse von In-vitro-Assays sind jedoch begrenzt, da sie nicht immer in vivo-Studien14,19,20,21replizieren. In-vivo-Assays bieten einen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Interaktion, die durch In-vitro-Assays nicht vollständig nachgeahmt werden kann. Zum Beispiel können immunologische Studien durch immunhistochemische Assays aus gesammelten Fußpolstergewebeabschnitten oder sogar von poplitealen Lymphknoten zur Analyse der wiedergewonnenen Immunzellen durchgeführt werden22.

Tiere werden oft als Modell für menschliche Krankheiten in der biologischen und biomedizinischen Forschung verwendet, um die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen der Krankheiten besser zu verstehen23. Im Falle der Leishmaniose beeinflussen die Route, der Ort oder die Dosis der Impfung das Krankheitsergebnis24,25,26,27. Darüber hinaus werden Anfälligkeit und Resistenz gegen die Infektion bei Menschen und Mäusen stark durch den genetischen Hintergrund des Wirts und Parasiten4,5,22,28,29,30,31reguliert. BALB/c-Mäuse sind sehr anfällig für L. amazonensis kutane Infektionen, die ein schnelles Krankheitsverlauf mit der Verbreitung der Parasiten an die Lymphknoten, Milz und Leber32zeigen. Da die Krankheit zu kutanen Metastasen fortschreiten kann, kann die Infektion tödlich sein. Im Gegensatz dazu entwickeln C57BL/6-Mäuse häufig chronische Läsionen mit anhaltenden Parasitenbelastungen in L. amazonensis-Infektions-Assays 33. Dabei wurde eine L. amazonensis-Infektion mit dieser speziellen Mausart als ein ausgezeichnetes Modell zur Untersuchung chronischer Formen der hautnaheleishmaniosen Beim Menschen angesehen, da sie das Krankheitsverlaufbesser imitiert als das BALB/c-Mäuseinfektionsmodell5,34.

Daher schlagen wir vor, dass die murine in vivo-Infektion eine nützliche Methode für Leishmanenvirulenz physiologische Studien für menschliche Krankheiten ist, die eine systemische Ansicht der Wirts-Parasiten-Interaktion ermöglichen. Bei der Begutachtung der etablierten Assays22präsentieren wir hier ein zusammengestelltes Schritt-für-Schritt-Protokoll der In-vivo-Infektion von C57BL/6-Mäusen mit L. amazonensis, das die Parasitendifferenzierung in axtische Amastigoten, Mäusefußpad-Hautimpfung, Läsionsentwicklung und Parasitenlastbestimmung umfasst. Dieses Protokoll kann an andere Mäusestämme und Leishmanienarten angepasst werden, die kutane Leishmanien verursachen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Methode entscheidend für die Identifizierung neuerAnti-Leishmanie-Medikamentenziele und -impfstoffe sowie in physiologischen Studien des Wirts immun- und metabolische Reaktionen auf Leishmanien-Infektionen ist.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Instituts für Biowissenschaften der Universität Von Sao Paulo (CEUA 342/2019) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen und den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Bundesstaates Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) und der brasilianischen Regierung (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle in den Abschnitten 1-5 beschriebenen Schritte sollten aseptisch in laminaren Strömungsschränken durchgeführt werden. Persönliche Schutzausrüstung sollte beim Umgang mit lebenden Leishmanienparasiten eingesetzt werden.

1. In Vitro Differenzierung von L. amazonensis Promastigotes in Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

HINWEIS: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) Parasit wurde in diesem Test verwendet. Je nach Studienzweck kann die infektiöse Parasitenform entweder durch Reinigung der metazyklischen Form unter Verwendung eines Dichtegradienten, wie zuvor beschrieben14, oder durch Differenzierung von Promastigoten in axtische Amastigoten nach folgendem Protokoll erhalten werden.

  1. Grow La promastigotes in einem 25 cm2 Zellkulturkolben mit 10 ml Medium für Promastigoten (pro-medium) (pH = 7,0).
  2. 3 Tage lang bei 25 °C inkubieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie Promastigot-Kulturen, die in vitro weniger als 10x durchdrungen wurden, um den Verlust von Virulenz und Aneuploidie-Veränderungen von Parasiten39,40,41,42,43,44zu vermeiden.
  3. Pipette 5 ml logarithmische Wachstumsphase promastigote Kultur in einem neuen 25 cm2 Kolben.
  4. 5 ml Medium für axtische Amastigoten (ama-medium) hinzufügen (pH = 5,2).
  5. 3-4 Tage bei 34 °C inkubieren.
  6. Teilen Sie die Kultur auf, indem Sie mit ama-medium im Verhältnis 1:3 in einen neuen 25 cm2 Kolben verdünnen.
  7. 3-5 Tage bei 34 °C inkubieren.
    HINWEIS: Inkubieren Sie die axtischen Amastigoten für bis zu 5 Tage, da sie das Ende der Reifung37darstellen.

2. C57BL/6 Footpad Infektion mit L. amazonensis

HINWEIS: Weibliche C57BL/6-Mäuse (6-8 Wochen alt) wurden im Animal Center des Biomedizinischen Instituts der Universität von Sao Paulo gewonnen und gepflegt. Die Tiere erhielten Nahrung und Wasser ad libitum.

  1. Zählen Sie die Kultur der axtischen Amastigoten, indem Sie ein Aliquot der in PBS verdünnten Parasitensuspension in eine Neubauer-Kammer (d.h. Hämozytometer) übertragen. Zählen Sie die nicht flagellated Parasiten, die Amastigoten Formen darstellen.
    HINWEIS: Alternativ kann Trypan blue (1:1) verwendet werden, um die Anzahl der lebensfähigen Amastigoten zu zählen (d. h. solche, die nicht mit Trypan blue befleckt sind).
  2. Verdünnen Sie die axtischen Amastigoten in PBS entsprechend der gewünschten Inokulumdosis und der Anzahl der vorgesehenen Inokulume (1 x 106 axenic amastigotes in 50 l PBS wird empfohlen).
  3. Eine Tuberkulinspritze mit einer 27 G Nadel mit der vorbereiteten Parasitensuspension beladen.
  4. Anästhetisieren Sie eine C57BL/6 Maus mit 3-5% Isofluran, wie vom Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45empfohlen. Bewerten Sie die Anästhesietiefe, indem Sie die Reaktion der Maus auf eine Zehenklemme testen.
  5. Impfen Sie 50 l der homogenisierten Parasitensuspension (1 x 106 axen amastigotes oder die gewünschte Inokulumdosis) im Subplantargewebe des linken Hinterfußpads mit der zuvor geladenen Tuberkulinspritze (Schritt 2.3).

3. Mouse Footpad Lesion Entwicklung

  1. Messen Sie einmal pro Woche das Fortschreiten der Läsion, indem Sie die Dicke der linken (infizierten) und rechten (nicht infizierten) Fußpolster mit einem Bremssattel messen.
  2. Berechnen Sie wöchentlich die Differenz der Dicke zwischen dem linken und rechten Hinterfuß, um die Läsionsprogression zu bewerten.
  3. Zeichnen Sie die berechneten Unterschiede auf der Y-Achse und die Zeit der Infektion auf der X-Achse und berechnen Sie die statistische Signifikanz.
    HINWEIS: Gemäß den Empfehlungen der Tierpflege- und Einsatzausschüsse müssen Tiere geopfert werden, bevor die infizierte Läsion ulzeriert wird, da Hautgeschwüre zu einer sekundären Infektion führen können. Wie in Der Ergänzenden Abbildung 1dargestellt, dauert es etwa 10 Wochen, bis die Läsionen Anzeichen einer Ulzeration mit der Parasitendosis (106 axenatonische Amastigoten) und dem in diesem Protokoll verwendeten Wirtsstamm (C57BL/6) zeigen. Die Mäuse sollten für die Läsionsextraktion geopfert werden, bevor die Anzeichen einer Ulzeration beobachtet werden.

4. Mäuse Footpad Lesion Extraktion und Parasiten begrenzende Verdünnung

  1. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte (flacher Boden) für den begrenzenden Verdünnungstest46,47 vor, indem Sie allen Brunnen 180 l Pro-Medium hinzufügen.
    HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Tier vier Plattenbahnen (die Hälfte der Platte), die quadruplicate Assays darstellen (d. h. Tier 1 = Bahnen A-D; Tier 2 = Bahnen E-H).
  2. Fügen Sie 1 ml Pro-Medium in ein Glasgewebeschleifrohr pro Läsion und wiegen Sie das Rohr.
    HINWEIS: Das Rohr muss steril gehalten werden, so verwenden Sie einen sterilen Deckel und wiegen Sie das Rohr mit dem geschlossenen Deckel, wenn Sie außerhalb des laminaren Strömungsschranks wiegen.
  3. Opfern Sie das Tier in einerCO2-Kammer, entsprechend den Empfehlungen der Tierpflege- und Nutzungsausschüsse. Desinfizieren Sie das Tier, indem Sie mit 70% Ethanol sprühen.
  4. Verbrauchen Sie den Fuß des Tieres an ihm Fersen, um das infizierte Fußpolster zu extrahieren und sprühen 70% Ethanol auf dem Fußpolster für die Desinfektion. Sorgen Sie für die Sterilisation von Schere und Zange, indem Sie sie in 70% Ethanol getränkt halten.
  5. Legen Sie das infizierte Fußpolster in eine sterile Petrischale und sezieren Sie mit sterilen Zangen und einem Skalpell, um alle Weichgewebe zu sammeln. Entsorgen Sie die Knochen.
    HINWEIS: Es wird eine Gleichmäßigkeit im Abschnittsschritt empfohlen, um eine voreingenommene Geweberückgewinnung zu vermeiden.
  6. Übertragen Sie das gesammelte Gewebe mit Pro-Medium auf das Glasgewebeschleifrohr, und wiegen Sie das Rohr dann erneut, um das Läsionsgewicht zu bestimmen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zangen und das Skalpell direkt in das Medium zu legen, da kleine Volumina entfernt werden können, was zu einem unterschätzten Gewebegewicht führt. Das Gewicht der Läsion wird berechnet, indem das Gewicht des Schlauches, das Pro-Medium enthält, mit dem gesammelten Gewebe vom Gewicht des Rohres subtrahiert wird, das nur pro-medium enthält.
  7. Homogenisieren Sie das Gewebe 10x mit dem Schleifer für vollständige Gewebestörung.
  8. Lassen Sie das Gemisch für 10 min Sediment, dann sammeln 20 l des Überstandes.
  9. In der1. Spalte der 1. Spur der in Schritt 4.1 vorbereiteten1. Spur der 96-Wellplatte 20 l des Überstandes beladen. Wiederholen Sie dies für die nächsten drei Bahnen, um Quadruplizierungen für jedes Tier zu haben (d. h. für Tier 1 fügen Sie 20 L zu jedem Brunnen hinzu und kennzeichnen Sie A1, B1, C1 und D1).
  10. Homogenisieren Sie jeden Brunnen in der1. Säule 10x mit einer Mehrkanalpipette. Übertragen Sie dann 20 l der verdünnten Proben von der1. Spalte in die2. Spalte.
    HINWEIS: Es ist wichtig, jeden Brunnen 10x von einer Spalte zur nächsten zu homogenisieren.
  11. Wiederholen Sie Schritt 4.10 auf alle verbleibenden Spalten bis zur letzten Spalte(12.)und verwerfen Sie die letzten 20 L der verdünnten Probe.
    HINWEIS: Ändern Sie die Spitzen nach jeder Verdünnung, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  12. Versiegeln Sie die Platten mit einer Folie und brüten Sie 7 Tage lang bei 25 °C in einer feuchten Kammer.

5. Läsion Parasiten Last Bestimmung

  1. Analysieren Sie die Platten nach 7 Tagen Inkubation mit einem invertierten Mikroskop, um den letzten parasitenhaltigen Brunnen für jede Spur zu bestimmen.
    HINWEIS: Es ist auch möglich, einen Hinweis auf das Wachstum der Parasiten oder die Zelldichte durch visuelle Analyse der Farbveränderungen und Trübung des Mediums zu haben.
  2. Berechnen Sie die Parasitengewebelast für jede Spur, indem Sie den Verdünnungsfaktor pro Läsionsgewicht dividieren.
    HINWEIS: Wenn Parasiten in einer bestimmten Spur nur in den Spalten 1-5 vorhanden sind (d. h. Brunnen A1-A5 sind positiv für das Parasitenwachstum), bedeutet dies, dass Spalte 5 nur 1 Parasiten enthielt, Spalte 4 10 Parasiten usw. in Vielfachen von zehn. Spalte 1 würde 104 Parasiten enthalten, was die Anzahl der Parasiten in den anfänglichen 20 l Desobtant (die nicht verdünnte Probe in Schritt 4.7) darstellt. Da diese 20 l mit 180 l Pro-Medium verdünnt wurden, enthielt das Anfangsrohr 5 x 105 Parasiten: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 Parasiten/1 ml. Dann kann die Parasitenbelastung in dieser Läsion berechnet werden, indem die Anfangskonzentration des Parasiten durch das Läsionsgewicht dividiert wird: (5 x 105) / Läsionsgewicht (siehe Schritt 4.6).
  3. Zeichnen Sie den Durchschnitt des quadruplizierten Ergebnisses für jedes Tier mit einer Log Y-Skala.

6. Statistische Analyse

  1. Stellen Sie die Daten als durchschnittliche Standardabweichung dar, bei der mindestens fünf Tiere pro Versuchsgruppe als Replikationen verwendet werden.
  2. Führen Sie statistische Analysen mit einem nicht gepaarten zweischwanzigen Test durch, wobei ein p-Wert < 0,05 als signifikant betrachtet wird.

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Ergebnisse

Leishmania protozoan Parasiten existieren in zwei Entwicklungsformen während ihres Lebenszyklus in wirbellosen und Wirbeltier wirte: Promastigoten, die proliferative Formen im Lumen der weiblichen Sandfliege gefunden; und Amastigoten, die proliferativen Formen, die in den parasitophorischen Vakuolen der Säugetier-Wirtszellen gefunden werden. Promastigoten haben einen langgestreckten Körper von etwa 1,5 m Breite und 20 m Länge, wobei ein Flagellum typischerweise aus der vorderen E...

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Diskussion

Der in diesem Protokoll beschriebene In-vivo-Infektionstest ermöglicht es jedem Forscher, in vivo kutane Leishmaniose unter Berücksichtigung der Wirts-Parasiten-Interaktion in einem systemischen Szenario zu bewerten. Diese Assays wurden von vielen Gruppen22,24,27,29,31,32,34,

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cémara vom Tierzentrum des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität von Sao Paulo für die Unterstützung und Prof. Dr. Silvia Reni Uliana für die Bereitstellung der Glasgewebemühle. Diese Arbeit wurde von der Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' Grant 2017/23933-3) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-PlatteGreiner bio-ne655180Eine Platte mit flachem Boden zur Begrenzung des Verdünnungsassays
AdeninSigma A8626Ergänzung zum M199-Messschieber für Zellkulturmedien
Mitutoyo700-118-20Ein Messschieber zur Messung der Dicke des
Corning353014Ein Zellkulturkolben mit einem Volumen von 25 cm2 zur Kultivierung der
Leishmania-ParasitenzentrifugeEppendorf5804REin Gerät zur Trennung von Proben basierend auf seiner Dichte
CO2 Inkubator 34 &/deg; CThermo Scientific3110Ein Inkubator für die Differenzierung von Amastigoten
EthanolMerckK50237083820Ein Desinfektionsmittel für allgemeine Gegenstände
Fötales RinderserumGibco12657-029Ergänzung zu M199 Zellkulturmedien Glasgewebe
SchleifröhrchenThomas Scientific3431 E04Ein Röhrchen zum Sammeln und Aufbrechen von infiziertem Fußballengewebe
GlukoseSynthG1008.01.AHErgänzung zu M199 Zellkulturmedien GraphPad
Prism SoftwareGraphPadEine Software zur Darstellung der Daten und zur Berechnung der statistischen Signifikanz
HäminSigmaH-2250Ergänzung zu M199 Zellkulturmedien
HEPESPromegaH5303Ergänzung zu M199
Zellkulturmedien Inkubator 25 ° CFanem347CDEin Inkubator für die Kultivierung von Promastigoten
InversmikroskopNikonTMSEin Gerät zur visuellen Analyse der Promastigoten- und Amastigotenkulturen
IsofluranEin Inhalationsanästhetikum für Mäuse (3-5%)
Laminar-Flow-SchrankVecoVLFS-09Eine Biosicherheitswerkbank für den aseptischen Arbeitsbereich
M199-Zelle NährmedienGibco31100-035Ein Zellkulturmedium für die Leishmania-Kultivierung
MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT150CEin Mikroröhrchen zur Probenentnahme, -verarbeitung und -lagerung
Multikanal-PipetteLabsystemsF61978Eine Mehrkanalpipette zur Begrenzung der Verdünnung Assay
NaHCO3Merck6329Ergänzung zu M199 Zellkulturmedien
NaOHSigmaS8045Ergänzung zu M199 Zellkulturmedien
Neubauer KammerHBG2266Ein Hämozytometer zur Zählung des optischen Mikroskops der Parasitensuspension
NikonE200Ein optisches Gerät zur Zählung von Parasiten-Parafilm
Bemis349Ein flexibler und widerstandsfähiger Kunststoff zur Abdichtung der
Platte Penicillin/StreptomycinGibco15140122Ergänzung zu M199-Zellkulturmedien
PetrischalenTPP93100Eine sterile Schale zum Präparieren des Ballengewebes
Pipettierer-KitGilsonF167360Ein Mikropipetten-Kit mit vier Pipettieren (P2, P20, P200, P1000)
WaageQuimisBG2000Ein Gerät zum Wiegen des gesammelten Fußballens
SkalpellSolidor10237580026Ein Skalpell zum Schneiden und Sammeln von Fußballengewebe
serologische Pipette 10 mLNest327001Eine sterile Pipette zum Übertragen von Millilitervolumina
SpitzenAxygenEine Pipettenspitze zum Übertragen von Mikrolitervolumina
TrypanblauGibco15250-061Ein Farbstoff zum Zählen lebensfähiger Parasiten
Trypticase-PeptonMerck-Ergänzungsmittelzur M199-Zellkulturmedien-Tuberkulin-Spritze
BD305945Eine Spritze mit 27G-Nadel zur Inokulation der Parasitensuspension
Fußpolster-Zellkulturkolbens

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