Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Diese Methode beschreibt vom Start bis zum Ende das chirurgische Verfahren zur Erzeugung orthotopischer Bauchspeicheldrüsentumoren mit einer minimalen Menge an zellulärem Material und die anschließende schnelle Dissoziation etablierter Tumoren für eine umfassende Durchflusszytometrieanalyse von Immunzellpopulationen, einschließlich ex vivo-Analyse der T-Zellfunktion.

Pankreasduktodalsocarkinom (PDAC) ist ein aggressives Karzinom mit nur 8 % der Patienten, die 5 Jahre^{überleben 1}. Da weniger als 20 % der Patienten für die chirurgische Resektion²in Frage kommen, sind frische Patientenproben für die Forschung nicht leicht zugänglich und daher bieten In-vivo-Modelle wesentliche Instrumente zur Untersuchung dieser Krankheit. Es gibt mehrere murine Modelle von PDAC: orthotopisch, subkutan, transgene, intravenöse und patientenabgeleitete Xenograft (PDX), ausführlich beschrieben hier³. Das hier beschriebene orthotopische Modell ermöglicht die Injektion syngenischer PDAC-Zellen in die Bauchspeicheldrüse immunkompetenter Mäuse. Dies kann in großen Kohorten von Wildtyp- oder Mutantenmäusen durchgeführt werden und bietet somit ein kostengünstiges und konsistentes Modell für den Vergleich von therapeutischen Wirkstoffen. Wichtig ist, dass das orthotopische Modell die kognitierte Mikroumgebung für das Wachstum von Tumorzellen und Metastasen in unseren Händen und anderen⁴ an klinisch relevante Stellen (z. B. Leber) liefert und damit klinisch relevanter ist als die subkutanen oder chemisch induzierten Modelle. Orthotopische Tumoren zeigen wichtige Merkmale von PDAC, wie eine starke desmoplastische Reaktion mit einer Fülle von Fibroblasten und extrazelluläre Matrixabscheidung⁵. Transgene Modelle von PDAC sind der Goldstandard des murinen Modells und das am häufigsten verwendete ist das KPC-Modell, das mutierte Kras^G12D/+ und Trp53^R172H/+ unter dem Pankreas-spezifischen Pdx-1-Cre Promoter⁶ausdrückt. Weitere KPC- und andere in vivo PDAC-Modelle werden hier überprüft⁷. KPC-Mäuse entwickeln spontan Bauchspeicheldrüsentumoren mit einem Krankheitsverlauf, der die Merkmale des menschlichen PDAC⁶originalgetreu nachbildet. Wie bei allen transgenen Modellen ist das Zuchtprogramm jedoch kostspielig, die Tumorprogression ist variabel und erfordert daher oft große Mäusekohorten. PDX-Modelle verwenden patientenabgeleitete Tumorzellen oder -stücke, die dann entweder orthotopisch oder häufiger subkutan in immungeschwächten Mäusen angebaut werden. Xenograft-Modelle bieten nützliche Werkzeuge zum Screening therapeutischer Verbindungen und berücksichtigen die Heterogenität der Patienten. Sie bieten jedoch keine vollständige Immunmikroumgebung und beschränken damit ihre Anwendungen^8,9.

Einmal etabliert, orthotopische Tumoren in der Regel etwa 1 Monat oder mehr zu wachsen (abhängig von der verwendeten Zelllinie) und bilden große Tumoren, die leicht durch Ultraschall oder MRT abgebildet werden können, um progression zu verfolgen und die Behandlungswirksamkeit^4,5,10. Sobald jedoch exponentielles Wachstum, die letzte Phase des Tumorwachstums kann schnell sein, so dass die meisten Behandlungsschemas relativ früh begonnen werden (z.B. 14 Tage)^11,12. Das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorentwicklung, auch bei PDAC, das durch einen immunsuppressiven Tumor gekennzeichnet ist, der mit relativer Knappheit von T-Zellen und häufiger Anwesenheit von myeloiden Zellen¹³infiltriert ist. Eine hohe Präsenz von T-Zellen in PDAC verleiht eine bessere Prognose^14,15. Als Einzelwirkstoffe haben Immun-Checkpoint-Inhibitoren, die die Immunsuppression von T-Zellen lindern, wie Anti-CTLA-4¹⁶ und Anti-PD-L1^17,jedoch keinen klinischen Nutzen bei PDAC-Patienten gezeigt, wahrscheinlich weil die reaktivität der T-Zellen insgesamt sehr gering ist. Jedoch, Agenten, die Prime T-Zell-Antworten, wie Anti-CD40, Anti-PD-L1/CTLA-4-Resistenz^18,19 und Impfung mit GM-CSF-sekretierenden allogenen PDAC-Impfstoff (GVAX) kann die Immunogenität der PDAC-Tumoren²⁰erhöhen , was darauf hindeutet, dass die Verbesserung der T-Zell-Antworten wichtige therapeutische Möglichkeit bildet.

Entscheidend für eine antitumorale T-Zell-Antwort ist die Erkennung von tumorabgeleiteten Antigenen über den T-Zell-Rezeptor (TCR) und die anschließende Produktion von zytotoxischen Zytokinen und Granulaten. Während die T-Zell-Antigen-Erkennung durch TCR-Sequenzierung bestimmt werden kann, ist dieser Ansatz kostspielig und zeitaufwändig. Die Quantifizierung von tumorinfiltrierenden T-Zell-Teilmengen liefert jedoch einen guten Hinweis auf eine antitumorale Reaktion. Eine weitere Untersuchung der T-Zellaktivität ex vivo in Bezug auf Degranulation, Zytokinproduktion und andere zytotoxische Faktoren liefert eine tiefere funktionelle Analyse. Diese Assays können an frischen Tumorproben durchgeführt werden und viele Parameter der T-Zellfunktion können schnell durch Durchflusszytometrie gemessen werden.

CD8⁺ und CD4⁺ T-Zellen produzieren Zytokine wie IFN und TNF, um eine Immunantwort zu potenzieren²¹. IFN-induziert MHCI-Upregulation auf Zielzellen, induziert Differenzierung und Rekrutierung von Immunzellen und unterstützt den Zelltod. Die IFN-Produktion durch CD8⁺ T-Zellen ist gut charakterisiert, um Teil einer antitumoralen Reaktion zu sein und korreliert mit der Tumorregression^22,23. TNF ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das sowohl von CD8⁺ als auch von CD4⁺ T-Zellen hergestellt wird. Es verbessert die TCR-abhängige Aktivierung und die Proliferation von T-Zellen und unterstützt die antitumorale Reaktion. Bei TCR-Engagement können zytotoxische CD8⁺ T-Zellen einer Degranulation unterzogen werden, bei der vorgebildete sekretore Lysosomen, die zytotoxische Moleküle enthalten, in die immunologische Synapse freigesetzt werden, um einen Zielzellabbau zu verursachen²¹. Zu diesen Molekülen gehört Perforin, ein Protein, das an die Zielzellmembran bindet und Poren bildet, die dann die Membranintegrität stören und die Diffusion²¹ oder Endozytose²⁴ anderer zytotoxischer Moleküle, wie Granzyme B, direkt in das Zytoplasma der Zielzelle ermöglichen. Granzyme B ist eine Protease, die den Abbau mehrerer Proteine innerhalb der Zielzelle inszeniert, was zum Zelltod^{führt 21}. Die Freisetzung solcher Moleküle erfordert eine Exozytose von Endosomen an die Zelloberfläche, wo der endosomale Marker CD107a (auch bekannt als LAMP-1) vorübergehend in die Zellmembran²⁵eingearbeitet wird.

Die Messung der Zytokinsekretion durch T-Zellen erfordert deren Isolierung durch strömungsunterstützte Zellsortierung oder perlenbasierte Separationstests, die bei einer großen Anzahl von Proben gleichzeitig nicht ohne weiteres durchgeführt werden können. Die Messung von intrazellulären Zytokinen erfordert jedoch keine Vorisolationsschritte und kann leicht an mehreren Proben gleichzeitig durchgeführt werden, was einen höheren Durchsatz ermöglicht. Da Zytokine schnell von T-Zellen abgesondert werden, können die intrazellulären Ebenen nicht nachweisbar sein und daher benötigt die T-Zelle Stimulation, um die Basalzytokinproduktion zu erhöhen. Um die antigengetriebene Zytokinproduktion zu bewerten, muss das von der TCR anerkannte Antigen der T-Zelle durch ein grundiertes APC in vitro vorgelegt werden. In Fällen, in denen die Antigenspezifität nicht bekannt ist, ist ein breiter Stimulationsansatz erforderlich. Die TCR-Stimulation kann mit Anti-CD3/28-Perlen nachgeahmt werden, die sowohl TCR-Aktivierung als auch Costimulation bieten, was die Zytokinproduktion und -proliferation induziert. Eine kostengünstigere Alternative ist jedoch die Verwendung von PMA und Ionomycin, die zusammen Signalwege, die zur Synthese und Freisetzung von intrazellulären Zytokinen führen, weitgehend aktivieren. Insbesondere aktiviert PMA die Proteinkinase C (PKC) und Ionomycin erhöht intrazelluläre Ca^2+-Ionen, was zu einer erhöhten Zellsignalisierung führt. Um den intrazellulären Gehalt an Zytokinen zu erhalten, kann diese Stimulation effektiv mit den Protein-Transport-Inhibitoren Brefeldin A und Monensin kombiniert werden, die Proteine im Golgi blockieren und so eine extrazelluläre Freisetzung verhindern. Die Verwendung von PMA/Ionomycin ist eine etablierte Methode zur Stimulierung von T-Zellen und es besteht eine starke Korrelation zwischen extrazellulär freigesetzten und intrazellulären Zytokinen²⁶. Die Stimulation von T-Zellen mit PMA und Ionomycin erhöht auch den Lysosomenhandel zur Zellmembran und so wird CD107a vorübergehend auf die Zelloberfläche integriert, bevor es in die Zelle recycelt wird. Durch die Einbeziehung eines Anti-CD107a-Antikörpers während der Stimulation ist es möglich, ihn als Marker der Degranulationsaktivität²⁵zu verwenden.

Diese Methode verdaut die Tumore schnell, um eine einzellige Suspension zu ermöglichen. An dieser Stelle können einzelne Populationen direkt für die Durchflusszytometrie gebeizt oder mit nachgeschalteten Methoden gereinigt werden: strömungsunterstützte Zellsortierung oder Magnetperlentrennung. Die Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension für die Durchflusszytometrieanalyse ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse mehrerer Immunzellpopulationen und ihrer phänotypischen Marker und liefert eine genaue Quantifizierung der Immunzellzahl und des Phänotyps.

Schließlich verhindert das hier beschriebene Verdauungsprotokoll den Verlust von Zell-Oberflächen-Markern und hält die Lebensfähigkeit der Immunzellen aufrecht, so dass Immunzellen weitere Zellreinigungsschritte und Kultur nach Bedarf durchlaufen können. Diese Methode wurde jedoch nicht auf die Ableitung von Epithelzellen aus dieser Verdauung getestet.

Orthotopische Bauchspeicheldrüsentumoren wurden wie zuvor^{beschrieben 10} in Übereinstimmung mit dem Uk Home Office Animal and Scientific Procedures Act 1986 und der Europäischen Richtlinie 2010/63/EU erzeugt. Alle Mäuse wurden perioperativ auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden überwacht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gewichtsverlust (> 15 % in 72 h oder 20 % in einem bestimmten Zeitraum), Piloerektion, Verengung der Augen, erhöhte Gang, geknicktes Aussehen, sowie Anzeichen einer Wundinfektion einschließlich Blutungen, Rötungen und Geschwür. Das Tumorwachstum wurde durch Palpation überwacht, und zusätzliche klinische Anzeichen wie arbeitste Atmung, Gelbsucht und kalte Extremitäten wurden ebenfalls überwacht, um zu beurteilen, ob Anzeichen eines Endpunkts erreicht waren. Alle Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle Reagenzien, die vor der Zytometrie-Färbung verwendet werden, sollten unter sterilen Bedingungen hergestellt werden.

1. Vorbereitung von Tumorzellen zur Injektion

1. Nehmen Sie ein Aliquot von Kellermembran aus -20 °C und legen Sie auf Eis bei 4 °C über Nacht.
   HINWEIS: Die Konzentration der Kellermembran kann von Charge zu Charge variieren; Daher müssen lotspezifische Kellermembranchargen in vivo getestet werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Eine neue Charge Kellermembran wird über Nacht bei 4 °C auf Eis aufgetaut, dann in benutzerdefinierten Aliquots, auf Eis und dann weiter in -20 °C gelagert, bis erforderlich. Dies minimiert das Pipetieren und Gefrieren bei Verwendung von Kellermembran.
   1. Steriles PBS über Nacht bei 4 °C abkühlen lassen.
   2. Die pipetten Spitzen mit 200 l und 1000 l über Nacht bei -20 °C zum Abkühlen.
2. Verwenden Sie Tumorzellen, die Mykoplasmen frei sind, für mindestens 2- 10 Passagen nach dem Auftauen und in der Log-Phase des Wachstums vor der Ernte gewachsen sind. Dieses Protokoll verwendet die weibliche murine C57BL/6 KPC-abgeleitete Zelllinie: TB32048 als großzügiges Geschenk des Labors von David Tuveson zur Verfügung gestellt.
   1. Wenn Tumorzellen für die Ernte benötigt werden, entfernen Sie das Medium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (vorgewärmt auf 37 °C).
   2. 2x Trypsin (vorgewärmt auf 37 °C) 10 min bei 37 °C (zu einem T175-Kolben hinzufügen, 5 ml hinzufügen).
   3. Nach 10 min fügen Sie dem Kolben ein gleiches Volumen des kompletten Mediums (10% FBS, 1x Penicillin, 1x Streptomycin in DMEM) hinzu und dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sanft auf den Kolben tippen und im Medium gut suspendieren.
   4. Übertragen Sie die Zellen in ein Rohr und zentrifugieren für 5 min bei 300 x g und Raumtemperatur (RT).
   5. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in einem vollständigen Medium für die Zellzählung wieder auf.
   6. Zentrifugenzellen wieder für 5 min bei 300 x g und RT, und entfernen Sie den Überstand.
   7. Resuspend Zellen in vorgekühlten PBS, um eine Konzentration von 1x10⁶ Zellen/ml zu erreichen.
      ANMERKUNG: Diese Lagerkonzentration ist darauf vorbereitet, eine endgültige Injektionskonzentration von 1000 Zellen in 5 l zu erreichen. Wir fanden die Injektion einer geringeren Anzahl von Zellen in einem niedrigen Injektionsvolumen minimiert Zellleckage und daher erhöhte Reproduzierbarkeit jedoch Tumorwachstum kann Zelllinienabhängig sein, daher Benutzer sollten jede Zelllinie optimieren.
3. Daneben legen Sie eine voraliquoted Kellermembran aliquot, auf Eis, in die Haube.
   1. Das Verhältnis der von Kellermembran, PBS und Tumorzellen in PBS, die für die Injektion vorbereitet sind, beträgt 5:3:2. Daher zu einem 500 -L-Aliquot der Kellermembran 300 l vorgekühlte PBS mit einer vorgekühlten 1000-L-Pipettespitze hinzufügen.
   2. Fügen Sie die PBS direkt in die Kellermembran aliquot, um Pipettierung zu minimieren.
   3. Halten Sie die p1000 auf 300 l eingestellt und setzen Sie die PBS- und Kellermembran wieder auf, um die Röhre auf Eis zu halten, um die Kellermembran in flüssigem Zustand zu erhalten.
   4. Wenn Sie die gesamte Kellermembran aus der p1000-Spitze auswerfen, lassen Sie die Spitze im Rohr, damit jede Kellermembran/PBS die Pipettenspitze herunterkommt.
   5. Nach 5-10 min, werfen Sie weitere Kellermembran aus der p1000 Spitze zurück in die Röhre und lassen Sie die Röhre auf Eis sitzen.
4. Nehmen Sie 200 l resuspendierte Tumorzellen in PBS und fügen Sie sie direkt in die Kellermembran mit einer vorgekühlten 200-L-Pipettenspitze hinzu.
   1. Nehmen Sie eine frische vorgekühlte p1000 Pipettenspitze, stellen Sie die Pipette auf 300 l und setzen Sie sie 30-40 Mal wieder auf. Eine größere Pipettenspitze, die auf ein geringes Volumen eingestellt ist, ist vorzuziehen, da die Kellermembran die Spitze nach oben bewegen und den Pipettenspitzenfilter während der Resuspension berühren kann.
   2. Die Tumorzellen sind zur Injektion bereit. Halten Sie Tumorzelle/Kellermembran während der Operation auf Eis.

2. Orthotopische Injektion von Tumorzellen

1. Akklimatisieren Sie die Mäuse in der Tieranlage für 7 Tage.
   1. Etwa 2 h vor der Operation die linke Seite des Bauches und des Rückens rasieren und dann das präoperative Analgetikum subkutan unter der Halsschnecke verabreichen (Buprenorphin bei 50-100 g/kg).
   2. Bereiten Sie chirurgische Feld, mit einer Wärmematte, um Maus auf und Vorhänge für umliegende Ausrüstung und über maus legen. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge; bereiten Sie genügend Werkzeuge für jede Maus vor.
   3. Legen Sie die Maus in eine 5% Isoflurane mit O₂ Kammer bis unbewusst.
   4. Übertragen Sie die Maus, auf dem Rücken liegend, auf eine Wärmematte und halten Anästhesie mit einer Maske, in der Regel bei einem niedrigeren 2-3% Isofluran.
   5. Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie; wie durch Verlust des Pedal-Entzugsreflexes identifiziert, wenn die Hinterpfote eingeklemmt wird und die Atemfrequenz der Überwachung konstant bleibt.
   6. Bedecken Sie den Körper in Drap, wobei nur der rasierte Teil freigelegt wird. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus sicher in der Anästhesiemaske befindet.
   7. Mit einer sterilen Baumwollknospe, Jodlösung in einer kreisförmigen Bewegung über den rasierten Bereich hinzufügen: von der Mitte beginnend und kreisen bis zum Rand. Wiederholen Sie den Prozess erneut mit frischer Baumwollknospe und Jod.
2. Verwenden Sie Skalpell, um einen 1 cm Schnitt direkt über der Bauchspeicheldrüse/Milzposition (oberlinker Quadrant) zu machen. Sterile Schere kann auch verwendet werden, um den Schnitt zu machen, wenn gewünscht.
   1. Ziehen Sie die Haut mit Zangen auseinander. Mit neuen Zangen, lokalisieren Sie die Peritonealwand und verwenden Sie eine Schere, um einen weiteren 1 cm Schnitt durch die Peritonealwand zu machen.
   2. Extrahieren Sie die Bauchspeicheldrüse, die mit der Milz kommen kann, aus dem Körper mit dem zweiten Paar Zange.
   3. Um die Durchstechflasche von Tumorzellen/Kellermembran mehrmals sanft umzukehren, um sie zu mischen.
   4. Bereiten Sie die Glasspritze mit 5 l mit 1.000 Tumorzellen in der Kellermembran vor und legen Sie sie für ein paar Sekunden auf die Wärmematte, damit sie sich erwärmen kann.
      HINWEIS: Durch die kurze Erwärmung der Spritze kann die Kellermembran mit der Erstarrung beginnen, um die Injektion ohne Leckagen zu erleichtern. Dies muss jedoch kurz gehalten werden, wenn die Kellermembran zu lange verfestigt und nicht injiziert wird. Durch die Verwendung einer Glasspritze kann ein geringes Volumen präzise injiziert werden.
   5. Halten Sie die Bauchspeicheldrüse am Schwanz, um sie zu verlängern und setzen Sie die Nadel direkt in die Mitte der Bauchspeicheldrüse, parallel zur Bauchspeicheldrüse selbst mit dem Bemühen, sichtbare Blutgefäße zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Mitte der Bauchspeicheldrüse hat eine große Fläche und es ist am einfachsten zu injizieren. Allerdings kann der Kopf oder Schwanz der Bauchspeicheldrüse auch gezielt injiziert werden, wenn gewünscht.
   6. Injizieren Sie nach der Injektion langsam 5 l Kellermembran in die Bauchspeicheldrüse und halten Sie die Nadel nach der Injektion mindestens 30 s stabil in der Bauchspeicheldrüse, damit sich die Kellermembran verfestigen und Leckagen verhindern kann. Die Kellermembran sollte sichtbar sein, wenn sich eine kleine klare Blase gebildet hat; Es ist jedoch möglicherweise nicht sichtbar.
      HINWEIS: Größere Mengen von Tumorzellen/Kellermembran können injiziert werden; Das genaue Volumen muss jedoch getestet werden, um sicherzustellen, dass keine Leckage auftritt.
   7. Entfernen Sie die Nadel aus der Bauchspeicheldrüse und warten Sie, bis keine Blutung aufgetreten ist. Setzen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein und achten Sie darauf, die Kellermembranblase nicht zu berühren.
   8. Ziehen Sie die Peritonealwand zusammen und führen Sie bei Bedarf eine einzelne Naht oder zwei unterbrochene Nähte durch.
   9. Ziehen Sie die beiden Seiten des Hautschnitts zusammen und führen Sie bei Bedarf mehrere unterbrochene Nähte durch oder legen Sie zwei chirurgische Clips ein.
3. Verabreichen Sie eine weitere subkutane Injektion von Buprenorphin in die Scruff.
   1. Übertragen Sie die Maus in einen beheizten 37 °C Käfig für mindestens 30 min nach der Operation, um die Körpertemperatur zu halten, bevor Sie wieder in einen frischen Käfig übertragen.
   2. Bereiten Sie eine Maische-Diät im Käfig zur Verfügung, um Rehydratation und Körpergewicht zu gewährleisten.
   3. Re-administration postoperative Analgesie wie empfohlen und beobachten Sie genau auf Anzeichen von Wundöffnung, Schmerzen oder Infektionen und Gewichtsverlust. Wenn Sie chirurgische Clips verwenden, können diese 7-10 Tage später mit einem Clip-Entferner entfernt werden.
   4. Nach etwa 14 Tagen wird das Narbengewebe ausreichend geheilt sein, um den Bauch zu lähmen. Überwachen Sie die Tumorgröße genau über Diepapation, bis Mäuse den Endpunkt erreichen.
   5. Am Endpunkt wird die Maus durch Zervixdislokation gekeult, gefolgt von Enthauptung. Die Haut und Die Peritonealhöhle werden mit einer Schere geöffnet und der Bauchspeicheldrüsentumor mit Zangen, um den Tumor zu halten, und Schere, um umgebendes Gewebe zu entfernen.

3. Verdauung von Bauchspeicheldrüsentumoren

1. Legen Sie den sezierten Bauchspeicheldrüsentumor, metastasierende Standorttumore oder gesundes Bauchspeicheldrüsengewebe in eiskaltes PBS und lagern Sie auf Eis.
   1. Verwenden Sie Zangen, um den Tumor auf eine Petrischale zu übertragen.
   2. 5,0 ml Verdauungsmedium (2 mg/ml Kollagenase, 0,025 mg/ml DNase RPMI) in ein 50 ml-Rohr geben; auf Eis lagern, um enzymatoriszu verhindern, dass enzymatorische Aktivität eint.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Collagenase Typ V, die eine Aktivität von 1 Einheiten/mg FALGPA und > 125 Kollagen-Verdauungseinheiten (CDU)/mg Feststoff hat. Kollagenase und DNase Aliquots können bei -20 °C gelagert und vor Gebrauch auf Eis aufgetaut werden. Wenn beide vollständig in sterilem RPMI löslich sind, können sie durch einen 0,2 m-Filter geleitet werden, um Verunreinigungen zu entfernen. Kollagenase muss vor der Filterung vollständig slubilisiert werden, um Materialverlust zu vermeiden.
   3. Nehmen Sie ein kleines Aliquot dieser Lösung, um den Tumor auf der Petrischale zu bedecken.
   4. Verwenden Sie steriles Skalpell und Zangen, um den Tumor in kleine Stücke zu schneiden, etwa weniger als 3 mm lang.
   5. Die Tumorstücke in das Rohr zerkleinern und das Rohr sanft umkehren, bis alle Teile in Verdauungsmedien getaucht sind. Auf Eis lagern, wenn andere Tumorproben in einer Charge vorbereitet werden müssen.
   6. 20 min bei 37 °C auf ein Schüttelgerät übertragen. Stellen Sie sicher, dass alle Tumorstücke untergetaucht sind und nicht am Rand des Rohres kleben. Wenn Schütteln nicht möglich ist, dann wirbeln Sie die Probe alle 5 min, um die Verdauung zu unterstützen.

4. Herstellung der einzelligen Suspension aus verdautem Tumor

1. Unmittelbar nach dem Verdauungsschritt die Röhre auf Eis legen, um die Enzymaktivität zu verlangsamen.
   1. Fügen Sie EDTA hinzu, um eine Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und kurz Wirbelprobe zu mischen. Dies wird die Enzymaktivität weiter verlangsamen.
   2. Öffnen Sie das Rohr und spülen Sie jeden Tumor digest aus dem Deckel des Rohres mit frischem RPMI Medium.
   3. Bereiten Sie ein 70 m Sieb (die Größe des Siebs kann nach Belieben geändert werden) auf einem 50 ml offenen Röhrchen auf Eis vor.
   4. Den Filter mit Medium vorbefeuchten.
   5. Setzen Sie die verdauten Zellen wieder auf und waschen Sie die Seiten des Rohres mit einem 25 ml Stripette oder größer. Die breitere Öffnung der Stripette ist wichtig, damit der dicke Digest leicht passieren kann.
   6. Übertragen Sie den gesamten Digest mit der 25 ml Stripette auf das Sieb.
   7. Zerkleinern Sie den Tumor auf dem Filter mit einem 1 ml Spritzenkolben. Nur direkt nach oben und unten mischen, um die Scherspannung der Zellen zu minimieren.
   8. Waschen Sie Zellen kontinuierlich durch das Sieb mit RPMI. Achten Sie darauf, mit genügend Kraft zu waschen, um Zellen durchzudrücken.
   9. Wenn es noch Material zum Maischen gibt, aber der RPMI aufhört, durchzuspülen, wird das Sieb gesättigt. Übertragen Sie die Probe daher in einen neuen Filter, und fahren Sie fort.
      HINWEIS: Letztendlich bleiben nur extrazelluläre Matrixkomponenten im Filter, alle einzelnen Zellen sollten durchlaufen haben.
2. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 300 x g und 4 °C.
   1. Setzen Sie das Zellpellet vorsichtig in vollständiger RPMI aus und passieren Sie direkt einen anderen Filter, um extrazelluläre Matrix oder große Zellklumpen zu entfernen, die nicht ausreichend resuspendiert werden können.
   2. Wenn keine Stimulation erforderlich ist, färben Sie die isolierten Zellen sofort für die Durchflusszytometrieanalyse, indem Sie auf Schritt 6.1 überspringen. Alternativ können Sie sie im Gefriermedium (10% DMSO in FBS) wieder aufbewahren und bei -80 °C lagern, gefolgt von einer Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff.
      HINWEIS: Der Gefrierschritt kann eine spätere Reinigung von Immunzellen ermöglichen; Die Quantifizierung von Immunzell-Teilmengen kann jedoch eine Optimierung erfordern, um zu bestätigen, dass Zellzahlen und Phänotyp nicht durch den Freeze/Tau-Prozess beeinflusst werden. Die ex vivo T-Zellstimulation wird am besten an frischen Tumorproben durchgeführt. An dieser Stelle kann die Probe durch perlenbasierte Totzellentfernung oder Immunzellanreicherungstests bei Bedarf weiter gereinigt werden.

5. Vorbereitung von Zellen für die Ex-vivo-Stimulation

1. Zählen Sie die Zellen, um eine Konzentration von 2 x 10⁶/ 100 l in vollständigem Medium zu erreichen (RPMI 10 % FBS, 1X Penicillin und 1X Streptomycin).
   HINWEIS: Die hohe Anzahl der gesamten plattierten Zellen stellt sicher, dass in dieser Probe genügend T-Zellen vorhanden sind, um sie zu analysieren. Die Anzahl kann jedoch je nach Verfügbarkeit der Stichprobe und der seltenen Natur von T-Zell-Teilmengen nach oben oder unten skaliert werden.
   1. Platte 100 l Zellen in einer U-Boden 96-Well-Platte.
   2. Fügen Sie 100 l des vollständigen Mediums hinzu, das eine 2x-Präparation von PMA/Ionomycin enthält (um eine Endkonzentration von 0,081 m bzw. 1,34 m zu erreichen, wie vom Hersteller empfohlen).
      HINWEIS: Bei der Messung der Degranulation/Exozytose, enthalten Sie hier auch eine fluoreszierend konjugierte Anti-Maus-CD107a in den Medien. Ein Kontrollbeispiel, das keine CD107a enthält, muss ebenfalls ausgeführt werden.
   3. 37 °C Inkubator mit 5%_CO2 für 1 h aufstellen.
   4. Fügen Sie 20 l einer 10-fachen Zubereitung von Brefeldin A und Monensin (um eine Endkonzentration von 1,06 m bzw. 2,0 m (wie vom Hersteller empfohlen) in vollständigen Medien hinzuzufügen.
      HINWEIS: Brefeldin A und Monensin sind Proteintransporthemmer und blockieren somit die extrazelluläre Freisetzung von Zytokinen usw. und ermöglichen deren Detektion durch Durchflusszytometrie. Wenn die Messung der Zytokinfreisetzung in den Überstand mittels ELISA oder ähnlichen Methoden – dann kann dieser Schritt übersprungen werden.
   5. Legen Sie die Platte in einen 37 °C Inkubator mit 5%_CO2 für weitere 4 h.

6. Extrazelluläre und intrazelluläre Färbung für Durchflusszytometrie

1. Entfernen Sie die Platte und setzen Sie jeden Brunnen wieder auf, um das gesamte Material auf eine V-Bodenplatte zu übertragen, die auf Eis gelegt wird.
   HINWEIS: Epithelzellen, Makrophagen und andere anhängliche Zellen können durch Erneutanhalten möglicherweise nicht vollständig abgerufen werden. Da sich die nachgeschaltete Analyse jedoch nur auf T-Zellen konzentriert, ist dies kein Problem.
   1. 6.1.1 Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 300 x g und 4 °C (verwenden Sie diese Bedingungen für nachfolgende Schritte, sofern nicht anders angegeben).
   2. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte in einer scharfen Bewegung auf den Kopf schieben.
2. Resuspend in 50 l eines fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoffs, hergestellt in eiskaltem PBS. Stellen Sie beim Wiederanhalten die Pipette auf ein geringeres Volumen ein, um Blasen zu vermeiden.
   1. 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
   2. Waschschritt: Fügen Sie 100 L FACS-Puffer, Zentrifuge und entfernen Sie den Überstand.
3. Setzen Sie jeden Brunnen mit 50 l Anti-CD16/CD32 (2,5 g/ml) im FACS-Puffer (0,5 % BSA, 2,0 mM EDTA in PBS) wieder auf, um die unspezifische Bindung von Nachweisantikörpern an Fc-Rezeptoren zu blockieren.
   1. 15 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
4. Fügen Sie jedem Brunnen direkt einen 2x Mastermix aus fluorchromkonjugierten Anti-Maus-CD45, CD3, CD4 und CD8 (weitere extrazelluläre Marker können nach Belieben hinzugefügt werden) im FACS-Puffer hinzu.
   1. 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
   2. Waschschritt: Fügen Sie 100 L FACS-Puffer, Zentrifuge und entfernen Sie den Überstand.
5. Fügen Sie 100 l 1x intrazellulären (IC) Fixationspuffer hinzu und brüten Sie 30 min bei RT im Dunkeln.
   1. Bereiten Sie die Zentrifuge bei RT vor.
6. Fügen Sie 100 l FACS-Puffer, Zentrifuge für 5 min bei 300 x g und RT hinzu und entfernen Sie den Überstand. Mit 1x Permeabilisationspuffer und Zentrifuge für 5 min bei 300 x gwiederholen; entfernen Sie dann den Überstand.
7. Fügen Sie 50 L 1x Mastermix aus fluorchromkonjugierter Anti-Maus-IFN, TNF- und anderen intrazellulären Markern hinzu, die in 1x Permeabilisationspuffer hergestellt werden.
   1. Inkubieren Für 1 h bei RT, im Dunkeln.
   2. Fügen Sie 100 L Permeabilisationspuffer zum Waschen hinzu. Dann Zentrifuge für 5 min bei 300 x g und RT und entfernen Sie den Überstand.
   3. Fügen Sie 100 l FACS-Puffer zum Waschen hinzu, Zentrifugieren Sie 5 min bei 300 x g und RT und entfernen Sie den Überstand.
8. Nach dieser letzten Zentrifugation stellen Sie Zellen in einem Volumen wieder auf, das für das Durchflusszytometer kompatibel ist. Es kann je nach Größe der FACS-Rohre variieren.
   1. Übertragen Sie dieses Volumen zur Akquisition in entsprechende FACS-Rohre.
   2. Aus Licht abdecken und im Kühlschrank aufbewahren und die Proben innerhalb von 24 h erwerben.

Nach der Injektion von 1000 TB32048 Zellen in die Bauchspeicheldrüse, orthotopische Tumoren brauchen etwa 30 Tage, um zu entwickeln (Abbildung 1A,B). Kellermembranlecks während der Operation können dazu führen, dass sich große Tumore direkt an der Peritonealwand bilden, die durch die Haut deutlich sichtbar sind (Abbildung 1C). Wir würden diese Mäuse aus der Studie entfernen. Bei guten chirurgischen Fähigkeiten wird die Inzidenz von Leckagen jedoch minimiert. Orthotopische Tumoren, die am Endpunkt geerntet werden, können bei C57BL/6 Wildtypmäusen zu einer beträchtlichen Größe heranwachsen(Abbildung 1D). Geerntete orthotopische Tumoren erfordern eine Verdauung in Kollagenase/ DNase für 20 min, um eine einzellige Suspension zu erreichen (Abbildung 2). An dieser Stelle können tumorabgeleitete Zellen in einer U-Boden-Platte bei 2 x 106 Zellen/Well plattiert werden. Die Anzahl der plattierten Zellen kann in Abhängigkeit von der Prävalenz der T-Zellen innerhalb der Probe verändert werden; Die Zellzahl kann verringert werden, wenn T-Zellen eine hohe Dichte aufweisen. Kontrollmilz- oder Lymphknotenproben können an dieser Stelle auch zur Stimulation plattiert werden. Jeder Brunnen wird mit PMA und Ionomycin für 5 h stimuliert und nach 1 h Inkubation werden Brefeldin A und Monensin hinzugefügt, um die extrazelluläre Freisetzung von Zytokinen zu blockieren (Abbildung 2). Nach der Inkubation werden Proben für extrazelluläre Epitope und intrazelluläre Zytokine zur Analyse mittels Durchflusszytometrie gefärbt (Abbildung 2).

Proben von Milz und Tumoren von Mäusen mit orthotopischen Tumoren wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die in der Strömungszytometrie-Analyse für die Milz- und orthotopische Tumoren verwendete Gating-Strategie schließt Ablagerungen mit FSC-A, SSC-A, Doublets von FSC-A/FSC-H und SSC-A/SSC-W, dann tote oder apoptotische Zellen als positiv für fixierbare Lebensfähigkeitsfarbstoffe aus (Abbildung 3A). Immunzellen werden dann als CD45+und T-Zellen weiter als CD3+ abgegrenzt, von denen CD4+ und CD8+ Teilmengen definiert sind (Abbildung 3A). Zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz für gating wird eine Fluoreszenz minus eins (FMO) durchgeführt, und es wird eine reine Brefeldin-A/Monensin-Kontrolle durchgeführt, um die Basalproduktion von Zytokinen zu bestimmen (Abbildung 3B-D).

Für IFN führte die Inkubation mit Brefeldin A/ Monensin zu keiner Zunahme von IFN über die FMO-Kontrolle sowohl in Milz- als auch in Tumorproben. Die Zugabe von PMA und Ionomycin erhöhte jedoch den % der intrazellulären IFN-Detektion in Milz- und Tumor-abgeleiteten CD4+- und CD8+ T-Zellen.

Splenic CD4+ und CD8+ T-Zellen, die als Positivkontrolle verwendet werden, haben eine relativ höhere IFN-Produktion als tumorinfiltrierende T-Zell-Teilmengen, mit einem Durchschnitt von 6,60 x 1,5 % und 12,97 % bei 3,4 % im Vergleich zu 4,81 % bei 1,0 % und 4,13 % bei 1,3 %, was darauf hindeutet, dass eine Immunsuppression innerhalb des Tumors auftritt(Abbildung 3B und 4A). Mit der gleichen Strategie für TNF haben wir visualisiert, dass ein hoher Anteil an Milz-CD4+ T-Zellen für intrazelluläre TNF -(65,93 x 2,3%) positiv ist, verglichen mit tumorinfiltrierenden CD4+ T-Zellen (22,45 x 5,4%). Splenic und tumorinfiltrierende CD8+ T-Zellen erzeugen ähnliche TNF-Werte (25,15 % bis 3,7 % bzw. 19,91 % bzw. 5,1 %) (Abbildung 3C, Abbildung 4B).

Schließlich ist CD107a ein endosomaler Marker, der während der Exozytose von zytotoxischen Granulaten und Zytokinen vorübergehend auf der Zelloberfläche exprimiert wird, als solches wird er als Ersatzmarker für Zytotoxizität verwendet. Der Vorteil der Färbung für CD107a während der Stimulation besteht darin, dass alle vorübergehend zelloberflächenausgedrückten CD107a vom Fluoreszenz-Antikörper erfasst werden. Die Basalwerte von CD107a werden in Brefeldin A/Monensin nur behandelten Zellen gezeigt. Bei Milz-CD8+ T-Zellen erhöht die Stimulation mit PMA/Ionomycin den nachgewiesenen CD107a-Spiegel, wobei die stärkste Aufregulationinregulation in CD8+ Zellen, die 23,95 x 3,5 % CD107a+waren, im Vergleich zu 5,8 x 1,9 % bei tumorinfiltrierenden CD8+ Zellen, was auf eine größere Degranulationsrate hindeutet. Auf der anderen Seite, Splenic und Tumor-infiltrierende CD4+ ausgedrückt vergleichbare Niveaus von CD107a 9,37 - 1,5 % und 11,50 x 1,8 % (Abbildung 3D und 4C).

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass orthotopische Tumoren aus der Injektion einer sehr geringen Anzahl (1.000) Tumorzellen in die Bauchspeicheldrüse erzeugt werden können. Diese Tumoren können schnell für die Isolierung von T-Zellen zur Ex-vivo-Stimulation verdaut werden. Der Nachweis von intrazellulären Zytokinen ist möglich und hebt den Basalgehalt der Immunsuppression infiltrierender T-Zellen hervor, verglichen mit T-Zellen in sekundären Lymphorganen.

Abbildung 1: Erzeugung orthotopischer Bauchspeicheldrüsentumoren. (A) Zeitplan der In-vivo-Experimente. (B) Das makroskopische Auftreten von orthotopischen Tumoren in der Bauchhöhle (links) und nach der Exzision (rechts), bei der der gezeigte Tumor halbiert wurde. (C) Hinweise auf Kellermembranlecks während der Operation können tumoren verursachen, die durch die Haut sichtbar sind (oberes Foto) und sich an der Peritonealwand bilden (unteres Foto). (D) Orthotopische Bauchspeicheldrüsentumorgewichte, die von Mäusen geerntet wurden, die einen Endpunkt erreicht hatten (n=22). Jeder Datenpunkt stellt eine einzelne Maus dar, Balkendiagramm zeigt den Mittelwert sem. Die Daten in dieser Abbildung wurden aus der zuvor veröffentlichten Arbeit10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematic der Verarbeitung von orthotopischen Tumoren zur Ex-vivo-T-Zellstimulation. Nach der Ernte werden Bauchspeicheldrüsentumoren in Kollagennase (2 mg/ml) und DNase (0,025 mg/ml) 20 min bei 37 °C schnell verdaut. Anschließend werden die Zellen bei 2 x 106/ml in kompletten RPMI-Medien resuspendiert und in einer U-Bodenplatte plattiert. Ein Stimulationscocktail aus PMA und Ionomycin wird für 5 h hinzugefügt, an dem punktgleich auch der Anti-Maus-CD107a-Antikörper in die Kultur aufgenommen werden kann. Nach 1 h Inkubation werden die intrazellulären Transportblocker, Brefeldin A und Monensin, hinzugefügt. Nach ex vivo Stimulation werden die Zellen für 20 min 4 °C in eine V-Bodenplatte zur Färbung mit dem fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (in PBS) übertragen. Die Zellen werden im FACS-Puffer gewaschen und in Anti-CD16/32 (FcR-Block) für 15 min (im FACS-Puffer) inkubiert und dann mit extrazellulärfluoreszierend konjugierten Antikörpern für weitere 30 min (im FACS-Puffer) inkubiert. Die Zellen werden im FACS-Puffer wieder gewaschen und im intrazellulären Fixationspuffer für 20 min wieder ausgesetzt. Danach werden Zellen einmal im FACS-Puffer und einmal im 1x Permeabilisierungspuffer gewaschen. Zellen werden bei RT für 1 h in intrazellulär-fluoreszierend konjugierten Antikörpern für 1 h (in 1x Permeabilisationspuffer) resuspendiert. Zellen werden einmal im 1x Permeabilisationspuffer und einmal im FACS-Puffer gewaschen, bevor sie im FACS-Puffer zur Erfassung auf dem Durchflusszytometer innerhalb von 24 h wieder aufhängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Durchflusszytometrieanalyse von ex vivo stimulierten Milz- und tumorabgeleiteten T-Zellen. (A) Flow Zytometrie-Gating-Strategie für Milz (Positive Kontrolle) und orthotopische Tumorproben verwendet. Zellen werden mit FSC-A/SSC-A von Ablagerungen diskriminiert und einzelne Zellen werden mit FSC-A/FSC-H und SSC-A/SSC-W weiter isoliert. Tote oder apoptotische Zellen werden mit dem fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff -FVD506 ausgeschlossen und Immunzellen werden mit CD45+abgezäut. Im Anschluss daran werden CD3+ T-Zellen und CD4+ und CD8+ Teilmengen definiert. Die Daten wurden auf einer BD Fortessa erfasst. (B) Die Gating-Strategie zur Quantifizierung von IFN-Zellen+ CD4+ und CD8+ T. Eine fluoreszierende Minus-Eins-Steuerung (FMO) wird bei vollständig stimulierten Proben (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Zur Bestimmung der Basalzytokinproduktion wird eine brefeldin A/monensin only control (nur B+M) verwendet. Die vollständig stimulierte Probe wird dann verwendet, um die % IFN- + T-Zellen zu berechnen. (C) Die Gating-Strategie zur Quantifizierung von TNF-+ CD4+ und CD8+ T-Zellen. Eine FMO-Kontrolle wird an vollständig stimulierten Proben (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Zur Bestimmung der Basalzytokinproduktion wird eine brefeldin A/monensin only control (nur B+M) verwendet. Die vollständig stimulierte Probe wird dann verwendet, um die % TNF+ T-Zellen zu berechnen. (D) Die Gating-Strategie zur Definition von CD107a+ CD4+ und CD8+ T-Zellen. Eine FMO-Kontrolle wird an vollständig stimulierten Proben (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Zur Bestimmung der Basaldegranulation wird eine Brefeldin-A/Monensin-Kontrolle (nur B+M) verwendet. Die vollständig stimulierte Probe wird dann verwendet, um die % CD107a+ T-Zellen zu berechnen. Alle Flow-Zytometrie-Daten wurden auf FlowJo Version 10.6.1 analysiert. Die Daten in dieser Abbildung wurden aus der zuvor veröffentlichten Arbeit10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantifizierung der Ex-vivo-Milz- und Tumor-abgeleiteten T-Zellaktivität. Der Anteil der CD4+ und CD8+ T-Zellen positiv für (A) IFN- (B) TNF-+ und (C) CD107a+ wurde in der Milz (n=4) und Tumor (n=7) von orthotopisch-tumortragenden Mäusen quantifiziert. Jeder Datenpunkt stellt einen individuellen Maus- und Fehlerbalken-Anzeigemittelwert - SEM dar. Statistische Signifikanz wurde mit einem ungepaarten t-Test getestet, wobei * = p<0.05 und *** = p<0.001. Alle Daten wurden mit Prism 8 analysiert. Die Daten in dieser Abbildung wurden aus der zuvor veröffentlichten Arbeit10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.