Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Wei Feng; Andrew Przysinda; Guang Li

doi:10.3791/60647

Method Article

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

DOI:

10.3791/60647

⸱

January 7th, 2020

Wei Feng¹ , Andrew Przysinda¹ , Guang Li¹

¹Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einem wichtigen Instrument auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie geworden. Es wurde erfolgreich verwendet, um seltene Zellpopulationen zu identifizieren, neue Markergene zu entdecken und räumliche und zeitliche Entwicklungsinformationen zu entschlüsseln. Die Einzelzellmethode hat sich in den letzten zwei bis drei Jahren auch von der mikrofluidischen Fluidigm C1-Technologie zu den Tropfen-basierten Lösungen entwickelt. Hier haben wir das Herz als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie man die embryonalen Gewebezellen der Maus mit der tröpfchenbasierten scRNA-Seq-Methode profiliert. Darüber hinaus haben wir zwei Strategien in den Workflow integriert, um mehrere Samples in einem einzigen Experiment zu profilieren. Mit einer der integrierten Methoden haben wir gleichzeitig mehr als 9.000 Zellen aus acht Herzproben profiliert. Diese Methoden werden für den Bereich der Entwicklungsbiologie wertvoll sein, indem sie eine kostengünstige Möglichkeit bieten, einzelne Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen, Entwicklungsstadien oder anatomischen Orten gleichzeitig zu profilieren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Transkriptionsprofil jeder einzelnen Zelle variiert zwischen den Zellpopulationen während der embryonalen Entwicklung. Obwohl die einzelne molekulare In-situ-Hybridisierung verwendet werden kann, um die Expression einer kleinen Anzahl von Genen¹zu visualisieren, bietet die einzellige mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) einen unvoreingenommenen Ansatz zur Veranschaulichung genomweiter Expressionsmuster von Genen in Einzelzellen. Nach der erstveröffentlichung im Jahr 2009²wurde scRNA-Seq in den letzten Jahren zur Untersuchung mehrerer Gewebe in mehreren Entwicklungsstadien^{angewendet 3}^,⁴^,⁵. Da der Atlas der menschlichen Zellen in jüngster Zeit seine entwicklungsorientierten Projekte gestartet hat, werden in naher Zukunft weitere Einzelzelldaten aus menschlichen embryonalen Geweben erwartet.

Das Herz als erstes Organ, das sich entwickelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung. Das Herz besteht aus mehreren Zelltypen und die Entwicklung jedes Zelltyps ist zeitlich und räumlich streng reguliert. In den letzten Jahren wurden der Ursprung und die Zellabstammung von Herzzellen in frühen Entwicklungsstadien charakterisiert⁶, die ein enormes nützliches Navigationswerkzeug für das Verständnis der angeborenen Krankheitspathogenese bieten, sowie für die Entwicklung technologisch fortschrittlicherer Methoden zur Stimulierung der Kardiomyozytenregeneration⁷.

Der scRNA-Seq hat sich in den letzten Jahren rasant erweitert⁸^,⁹^,¹⁰. Mit den neu entwickelten Methoden ist design und analysis of single cell experiments um¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴erreichbarer geworden. Die hier vorgestellte Methode ist ein kommerzielles Verfahren, das auf den Tröpfchenlösungen basiert (siehe Materialtabelle)¹⁵^,¹⁶. Diese Methode verfügt über die Erfassung von Zellen und Sets von eindeutig barcoded Perlen in einem Öl-Wasser-Emulsionströpfchen unter der Kontrolle eines mikrofluidischen Steuerungssystems. Die Rate der Zellbelastung in die Tröpfchen ist extrem niedrig, so dass die Mehrheit der Tröpfchenemulsionen nur eine Zelle¹⁷enthält. Das ausgeklügelte Design des Verfahrens ergibt sich aus der Einzelzelltrennung in Tröpfchenemulsionen, die gleichzeitig mit Barcoding auftreten, was die parallele Analyse einzelner Zellen mit RNA-Seq an einer heterogenen Population ermöglicht.

Die Integration von Multiplexing-Strategien ist eine der wichtigen Ergänzungen des traditionellen Einzelzell-Workflows¹³^,¹⁴. Diese Ergänzung ist sehr nützlich, um Zelldoublets zu verwerfen, die experimentellen Kosten zu senken und Batcheffekte zu eliminieren¹⁸^,¹⁹. Eine lipidbasierte Barcoding-Strategie und eine Antikörper-basierte Barcoding-Strategie (siehe Tabelle der Materialien) sind die beiden meist verwendeten Multiplexing-Methoden. Bestimmte Barcodes werden verwendet, um jedes Beispiel in beiden Methoden zu beschriften, und die beschrifteten Proben werden dann für die Einzelzellenerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung gemischt. Anschließend können die gepoolten Sequenzierungsdaten durch Analyse der Barcodesequenzen getrennt werden (Abbildung 1)¹⁹. Zwischen den beiden Methoden bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Die lipidbasierte Barcoding-Strategie basiert auf lipidmodifizierten Oligonukleotiden, die keine Zelltyppräferenzen haben. Während die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie kann nur die Zellen, die die Antigen-Proteine¹⁹^,²⁰. Darüber hinaus dauert es etwa 10 min, um die Lipide zu färben, aber 40 min, um die Antikörper zu färben (Abbildung 1). Darüber hinaus sind die lipidmodifizierten Oligonukleotide billiger als antikörperkonjugierte Oligonukleotide, aber zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels nicht kommerziell erhältlich. Schließlich kann die Lipid-basierte Strategie 96-Proben in einem Experiment multiplexen, aber die Antikörper-basierte Strategie kann derzeit nur Multiplex 12 Proben.

Die empfohlene Zellzahl zum Multiplex in einem einzigen Experiment sollte niedriger als 2,5 x 10⁴sein, da sie andernfalls zu einem hohen Anteil an Zelldoublets und einer potenziellen mRNA-Kontamination in der Umgebung führt. Durch die Multiplexing-Strategien werden die Kosten für die Einzelzellerfassung, cDNA-Generierung und Bibliotheksvorbereitung für mehrere Samples auf die Kosten für eine Probe reduziert, aber die Sequenzierungskosten bleiben gleich.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Tierverfahren entspricht dem Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der University of Pittsburgh (IACUC).

1. Maus Embryonale Herzsektion und Einzelzellsuspension Separpreparation

HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Anzahl der zu sezierenden Embryonen einige Stunden dauern.

Um E18.5 embryonale Herzen zu erwerben, einschläfern Sie eine schwangere CD1-Maus durch_{CO2-Verabreichung.} Verwenden Sie ein Rasiermesser, um die unerwünschten Haare im Bauchbereich zu entfernen und die Haut mit 70% Ethanol zu desinfizieren.
Schneiden Sie die Darmhaut mit einer sterilisierten Schere ab und sezieren Sie die Embryonen vorsichtig aus und legen Sie sie schnell in kalte phosphatgepufferte Saline (PBS) auf Eis.
Isolieren Sie die Herzen von jedem einzelnen Embryo sorgfältig in einer 10 cm Schale, die mit kaltem PBS unter einem stereoskopischen Mikroskop gefüllt ist, mit Zangen und Schere.
HINWEIS: Halten Sie die vier Kammern intakt, indem Sie die Lunge mit Herz zusammen sezieren und nicht direkt fangen / ziehen Sie das Herz mit chirurgischen Instrumenten.
Übertragen Sie 10 Hearts in eine neue 10 cm Schale, gefüllt mit kaltem PBS und mikrosezieren Sie die Herzen in den linken Vorhof, rechten Vorhof, linken Ventrikel und rechten Ventrikel.
HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass dies mehr als 1 x 10⁶ Zellen aus jeder Probe ergibt. Wir empfehlen, mit mindestens 1 x 10⁵ Zellen pro Probe zu beginnen.
Jedes der 4 Kammergewebe in ein 1,5 ml-Rohr geben und mit einer Schere in Stücke schneiden. Zentrifuge bei 300 x g für 3 min, um das Gewebe zu sammeln.
Nach dem Ansaugen des Überstandes 1 ml 0,25% Trypsin/EDTA zu jedem Rohr geben und in einem 37 °C-Wasserbad für 10 min inkubieren. 7-8 Mal mit einer P1000 Pipette auf und ab pfeifen.
Wenn das embryonale Stadium älter als E11.5 ist, 1 ml 10 mg/ml Kollagennase A/B-Mischung hinzufügen und bei 37 °C für 10-20 min inkubieren. Sanft nach oben und unten pipet, bis die meisten Zellen getrennt sind.
Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Rohr und fügen Sie 8 ml Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) hinzu, um die Enzyme zu verdünnen. Drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Rohr. Filtern Sie die Zellen mit einem 40-m-Zellsieb.
Nehmen Sie 15 l Volumen aus jeder Probe und mischen Sie mit der gleichen Menge von 0,04% Trypan blau. Laden Sie diese auf eine Zellzählkammer, und zählen Sie die Zellen in einem Zellzähler.
HINWEIS: Um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen, wird empfohlen, die Zelllebensfähigkeit über 95 % zu erhöhen.

2. Single Cell Multiplexing Barcoding

HINWEIS: Dieser Schritt dauert mindestens 40 min, was je nach Anzahl der verarbeiteten Proben variiert. Für Vorverstärkungsschritte ist ein mit RNase-Dekontaminationslösung behandelter sauberer Bankbereich erforderlich (Schritt 2.11 bis 3.11), und für die Nachverstärkungsschritte (die Schritte nach 3.11) ist ein separater Sauberer Tischbereich erforderlich.

Lipidbasiertes Barcoding-Verfahren (optionales Verfahren 1)
1. Auf der Grundlage der Zellkonzentration, halten Sie weniger als 5 x 10⁵ Zellen pro Probe. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension frei von Schmutz und Zellaggregaten ist.
2. Bereiten Sie für jede Probe 2 -M Anker-/Barcode-Lagerlösung und 2 -M-Co-Anchor-Stock-Lösung für jede Probe vor (Tabelle 1).
  HINWEIS: Der Anker und der Co-Anchor wurden freundlicherweise von Dr. Zev J. Gartner Lab geschenkt. Um diese lipidmodifizierten Oligonukleotide zu synthetisieren, wurden DNA-Sequenzen mit Fettsäure auf einer festen Stütze konjugiert und durch umgekehrte Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)¹⁸^,¹⁹gereinigt.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und sammeln Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Suspend Zellen in 180 l PBS.
4. Fügen Sie 20 L Anker/Barcode-Lagerlösung und Pipette sanft nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen. 5 min auf Eis bebrüten.
5. Fügen Sie 20 L Co-Anker-Lagerlösung und Pipette nach oben und unten sanft nach oben und unten zu mischen, dann auf Eis für weitere 5 min inkubieren.
6. 1 ml kalte PBS mit 1% BSA und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen. Mindestens 2 weitere Male mit eiskalt 1% BSA in PBS waschen.
7. Kombinieren Sie alle Proben zusammen und filtern Sie sie durch 40 m Zellsiebe. Zählen Sie die Zellen und halten Sie die Zellsuspension auf Eis, um sie in Abschnitt 3 zu verwenden.
Antikörperbasiertes Barcoding-Verfahren (optionales Verfahren 2)
1. Zentrifuge 1 x 10⁶-2 x 10⁶ Zellen für jede Probe (ab Schritt 1,8) bei 300 x g für 5 min und hängen sie in 100 l Färbepuffer (Tabelle 1) in 1,5 ml Niedrigbindungsrohren auf.
2. Fügen Sie 10 L Fc-Blockierreagenz hinzu und brüten Sie 10 min bei 4 °C.
3. Bereiten Sie Antikörper (siehe Materialtabelle) durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min bei 2-8 °C vor.
4. Fügen Sie 1 g von jedem oligokonjugierten Antikörper zu 50 l Zellfärbepuffer hinzu, um eine Antikörper-Färbelösung zu bilden²⁰. Fügen Sie jedem Probenröhrchen eine Antikörper-Färbelösung hinzu. 30 min bei 4 °C inkubieren.
5. 3mal mit 1 ml PBS die Zellen waschen, 5 min bei 350 x g bei 4 °C drehen.
6. Alle Proben in gewünschten Proportionen in 1 ml Färbepuffer bündeln, 5 min bei 350 x g bei 4 °C drehen.
7. ResuspendZellen in PBS in entsprechender Konzentration (bis zu 1.500 Zellen/L) und Filterzellen durch ein 40-m-Zellsieb. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.

3. Tröpfchengenerierung und mRNA Reverse Transkription

HINWEIS: Dieser Schritt dauert etwa 90 min für eine Multiplex-Reaktion.

Die Gelperlen (siehe Materialtabelle)auf Raumtemperatur für 30 min ausstatten. Nehmen Sie Reagenzien aus dem Kit für Gelperlen-in-Emulsion (GEMs) heraus (siehe Materialtabelle)und halten Sie sie auf ihrer angegebenen Temperatur.
Montieren Sie den Chip B in einen Chiphalter (siehe Materialtabelle).
Geben Sie 75 l 50% Glycerinlösung in die ungenutzten Brunnen in Reihe 1; 40 l in Zeile 2; 280 l in Zeile 3. Fügen Sie Glycerin nicht in alle Erholungsbrunnen in der oberen Reihe des Chips hinzu.
Bereiten Sie die Master-Mischung auf Eis nach Tabelle 1vor. Fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellsuspension und nukleasefreies Wasser hinzu, um die Mischung nach einem Zellsuspensionsvolumenrechner Tabelle¹⁷ zu meistern und die Mischung sanft zu pipetten. Geben Sie 75 l Zellgemisch in die untere Mitte der Probe gut in Zeile 1, ohne Blasen einzuführen.
Vortex die Gelperlen für 30 s mit einem Wirbeladapter und langsam geben 40 l Gelperlen in der unteren Mitte der Gelperle gut in Reihe 2 ohne Blasen.
HINWEIS: Es ist wichtig, 30 s zwischen dem Hinzufügen von Zellen und Gelperlen zu warten, um einen Benetzungsfehler zu vermeiden.
Für den Trennölbrunnen in Reihe 3 280 L Trennöl durch die Seitenwand des Brunnens geben.
ANMERKUNG: Das Laden von weniger als 270 l Trennöl führt zu einer abnormalen GEMs-Generierung.
Befestigen Sie die Dichtung am Chip, drücken Sie nicht auf die Dichtung und halten Sie sie horizontal, um eine Benetzung der Dichtung zu vermeiden.
Laden Sie den montierten Chip mit der Dichtung in den Chromregler und führen Sie das Chrom-Einzelzellen-B-Programm (siehe Tabelle der Materialien)aus, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn das Programm abgeschlossen ist.
Nehmen Sie den Chip heraus und entsorgen Sie die Dichtung. Falten Sie den Deckel zurück, um Brunnen bei 45° freizulegen, überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand, um sicherzustellen, dass keine Clogs vorhanden sind.
Saugen Sie langsam 100 l GEMs von den tiefsten Punkten des Bergungsbrunnens an und überprüfen Sie die Homogenität der GEMs. Geben Sie GEMs in ein neues Polymerase-Kettenreaktionsrohr (PCR) auf Eis mit den Pipettenspitzen gegen die Seitenwand des Rohres.
HINWEIS: Wenn überschüssige wässrige Schicht beobachtet wird, wird empfohlen, die Proben neu vorzubereiten. Wichtig ist, nehmen Sie ein Bild der Mischung, wenn die GEMs noch in den Pipettenspitzen sind. Dieses Bild kann erkennen, ob es einen Benetzungsfehler, teilweise emulgierte GEMs und Reagenzien-Clogs gibt. Das Foto kann auch als Nachweis verwendet werden, um eine Rückerstattung von der Reagenzienfirma mit Ersatzreagenzien und Chips zu erhalten.
Legen Sie das Rohr in einen thermischen Cycler und führen Sie die umgekehrte Transkriptionsprozedur durch (Tabelle 2).
HINWEIS: Stoppen Sie hier oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Das PCR-Produkt kann bis zu einer Woche bei -20 °C gelagert werden.

4. cDNA-Verstärkung

HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 150 min.

Nach der Rektion der einzelnen Zelle
1. Nehmen Sie die cDNA-Amplifikationsreagenzien aus dem GEMs-Kit (siehe Materialtabelle)heraus und halten Sie sie auf ihrer angegebenen Temperatur.
2. Fügen Sie der Probe bei Raumtemperatur 125 l Desrückgewinnungsmittel hinzu, um eine biphasische Mischung zu erhalten. Es sollte keine undurchsichtige Flüssigkeit beobachtet werden und das Pipettieren oder Wirbeln des Gemischs vermeiden.
3. Nachdem Sie auf 60 s gewartet haben, entfernen Sie langsam 125 L des Wiederherstellungsmittels von der Unterseite des Rohres.
4. Wirbel die magnetischen Perlen (siehe Tabelle der Materialien) gründlich für 30 s und sofort verwenden, um Perlen Reinigung Mischung vorzubereiten ( Tabelle1). Reagenzien sollten sequenziell wie aufgeführt hinzugefügt werden.
5. Wirbel die Perlen Cleanup-Mischung und fügen Sie 200 l in die Probe. Pipette die Mischung 10 mal dann inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
6. Fügen Sie die Reagenzien sequenziell wie in Tabelle 1 aufgeführt hinzu, um die Elutionslösung vorzubereiten und die cDNA wie folgt zu ergänzen.
  1. Legen Sie die Proben auf den Magneten (hohe Position) (siehe Materialtabelle), bis die Lösung sich entfernt, und entfernen Sie dann den Überstand.
  2. Fügen Sie dem Pellet 200 l 80 % Ethanol hinzu. Warten Sie 30 s, dann entfernen Sie das Ethanol.
  3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.6.2 für weitere 2 Mal. Zentrifuge kurz und auf den Magneten legen (niedrige Position). Entfernen Sie das restliche Ethanol vorsichtig und trocknen Sie die Luft für weniger als 2 min.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Lufttrocknung nach 2 min, sonst verringert sich die Elutionseffizienz.
  4. Entfernen Sie die Probe vom Magneten. Fügen Sie 35,5 l Elutionslösung und Pipette hinzu, um 15 Mal zu mischen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Legen Sie die Probe auf den Magneten (hohe Position), bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 35 l der Probe auf einen neuen Rohrstreifen.
    HINWEIS: Dieses Reinigungsverfahren wird auch in den Schritten 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 und 6.2.6 verwendet. Achten Sie auf die Konzentration von magnetischen Perlen und das Volumen von EB-Puffer / Reinstwasser verwendet, um die Proben bei jedem Schritt zu elute.
7. Quantifizieren Sie die Größe, Konzentration und Integrität der eluierten cDNA mit einem automatisierten Elektrophorese-Instrument²¹ (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2).
Amplifikation von cDNA
1. cDNA-Verstärkung mit der lipidbasierten Barcoding-Strategie (optionales Verfahren 1)
  1. Amplifikationsreaktionsmischung (Tabelle 1) auf Eis vorbereiten.
  2. Fügen Sie das Amplifikationsreaktionsgemisch zu 35 l cDNA-Proben hinzu (ab Schritt 4.1.6.7). Die Mischung anpfeifen und kurz zentrieren. Inkubieren Sie das Gemisch in einem thermischen Cycler nach dem cDNA-Amplifikationsverfahren (Tabelle 2).
  3. Nach gründlicher Wirbelung 120 l ausgewähltes Reagenz und 100 l Reinstwasser zu 100 l Probe hinzufügen, um eine 0,6-fache Konzentration von ausgewählten Reagenzen zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien). Pipette die Mischung für 15 Mal.
  4. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann die Probe auf den Magneten legen, bis die Lösungen klar werden.
    HINWEIS: Endogene cDNA in der Perlenfraktion und Multiplexing-Barcode-cDNA ist im Überstand.
  5. Übertragen Sie den Überstand in ein 1,5 ml Niedrigbindungsrohr für Multiplexing-Barcode-cDNA-Bibliotheksbau bei Schritt 6.1.
  6. Reinigen Sie die endogene cDNA, indem Sie die Schritte in 4.1.6 befolgen und sie mit 40 l EB-Puffer löschen.
  7. Führen Sie 1 L gereinigte cDNA-Probe auf einem automatisierten Elektrophorese-Instrument (siehe Tabelle der Materialien) aus, um die cDNA zu analysieren/quantifizieren.
  8. Aliquot 10 l cDNA in ein neues PCR-Rohr für den endogenen Bibliotheksbau.
    HINWEIS: Stoppen Sie hier oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Die restliche Probe kann bis zu 4 Wochen in -20 °C gelagert werden, um bei Bedarf zusätzliche Bibliotheken zu generieren.
2. cDNA-Verstärkung in der Antikörper-basierten Barcode-Strategie (optionales Verfahren 2)
  1. Fügen Sie 2 pmol HTO und ADT Additivprimer und 15 l cDNA-Primer zu 50 l Amplifikationsreaktionsmischung hinzu (Tabelle 1) und führen Sie cDNA-Verstärkung mit dem cDNA-Amplifikationsverfahren durch (Tabelle 2).
  2. Verwenden Sie 0.6x Select Reagenz, um endogene cDNA (Perlenfraktion) und Multiplexing Barcode cDNA (im Überstand) zu trennen. Denken Sie daran, den Überstand zu speichern, um den Konstruktionsaufbau einer Barcoding-Bibliothek in Schritt 6.2 durchzuführen.
  3. Reinigen und elute die endogene Transkript cDNA, indem Sie die Schritte in 4.1.6, führen Sie Qualitätskontrolle (QC) der Bibliotheken und aliquot 10 l in eine neue PCR-Röhre für den endogenen Bibliotheksbau.

5. Endogene Transkriptbibliothek Vorbereitung

HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 120 min.

Halten Sie die Reagenzien der Genexpression-Bibliothekskonstruktion aus dem Bibliothekskit (siehe Tabelle der Materialien) bei ihrer angegebenen Temperatur.
Bereiten Sie die Fragmentierungsmischung (Tabelle 1) auf Eis, Pipette zu mischen und Zentrifugen kurz vorzubereiten.
Fügen Sie der 10-L-gereinigten cDNA-Probe (ab Schritt 4.2.1.8 oder 4.2.2.3) einen 25-L-EB-Puffer hinzu und fügen Sie dann das neu hergestellte 15-L-Fragmentierungsgemisch in die Probe ein, pipetteieren Sie das Gemisch 15 Mal auf Eis und Zentrifugen kurz.
Übertragen Sie die Probe in einen vorgekühlten Thermocycler und initiieren Sie das PCR-Programm für Fragmentierung, Endreparatur und A-Tailing (Tabelle 2).
Vortex das ausgewählte Reagenz, um magnetische Perlen aufzuhängen und sukzessive 0,6x und 0,8x select reagenzien zu verwenden, um eine doppelseitige Größenauswahl gemäß der Bedienungsanleitung¹⁷^,²²zu treffen. Verwenden Sie 50 l EB-Puffer, um die DNA zu löschen.
Adaptor-Ligationsmischung vorbereiten (Tabelle 1), dann Pipette die Mischung gründlich und Zentrifuge kurz.
Fügen Sie 50 l Adaptor-Ligationsmischung zu 50 l Probe, Pipette-Mix wieder für 15 Mal und Zentrifuge kurz. Führen Sie die Adapterligation gemäß dem Protokoll in einem thermischen Cycler (Tabelle 2) durch.
Verwenden Sie 0,8x Reagenz, um das Ligationsprodukt zu reinigen und die gereinigte Probe mit 30 l EB-Puffer zu reinigen (siehe Schritt 4.1.6).
Bereiten Sie die Probenindex-PCR-Mischung vor (Tabelle 1) und fügen Sie der gereinigten Probe 60 l hinzu. Fügen Sie der Probe 10 L Probenindex, Pipettenverwechslung 5-mal und Zentrifuge für 5 Mal und Zentrifugen kurz hinzu, inkubieren Sie in einem thermischen Cycler nach dem Probenindexprotokoll (Tabelle 2).
HINWEIS: Stoppen Sie hier oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn mehr als ein Brunnen verwendet wird, wählen Sie für jeden Brunnen einen bestimmten Beispielindex (siehe Materialtabelle). Denken Sie daran, die Index-ID aufzuzeichnen, die für jeden Brunnen verwendet wird, und stellen Sie sicher, dass es keine Überlappung in einem multiplexen Sequenzierungslauf gibt.
Verwenden Sie sukzessive 0,6x und 0,8x ausgewählte Reagenzien, um eine doppelseitige Größenauswahl zu treffen, um 35 l gereinigte endogene Zellbibliothek DNA¹⁷zu erwerben.
QC die endogene Zellbibliothek vor der Sequenzierung (Abbildung 2).

6. Vorbereitung von Multiplexing Sample Barcode cDNA Bibliotheken

HINWEIS: Dieser Schritt dauert mindestens 120 min.

Beispiel-Barcode-Bibliotheksgenerierung für die lipidbasierte Multiplexing-Strategie (optionales Verfahren 1)
1. Fügen Sie 520 l ausgewähltere Reagenz und 360 l Isopropanol zu Probe-Barcode-cDNA ab Schritt 4.2.1.5 hinzu, um eine 3,2-fache Select-Reagenzkonzentration zu erhalten. Pipette die Mischung 10 Mal und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
2. Legen Sie das Rohr auf ein magnetisches Rack und warten Sie, bis die Lösung klar ist. Dann entsorgen Sie den Überstand.
3. Verwenden Sie 500 l 80% Ethanol, um Perlen zweimal auf einem Magneten zu waschen und nach jeder Wäsche 30 s zu warten.
4. Kurz zentrifugieren Sie die Perlen und legen Sie sie auf einen Magneten. Entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer P10-Mikropipette und lassen Sie Perlen für 2 min.
5. Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetgestell und setzen Sie die Perlen in 50 l EB-Puffer wieder auf. Pipetten Sie nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
6. Stellen Sie das Rohr zu einem Magneten zurück und warten Sie, bis die Lösung abgeklärt ist. Übertragen Sie den Überstand (Sample Barcode cDNA) auf ein neues PCR-Rohr. Achten Sie darauf, keine Perlen zu übertragen.
7. Quantifizieren Sie die Konzentration des Proben-Barcodes cDNA²³.
8. Bereiten Sie Lipid-Barcode-Bibliotheksmischung (Tabelle 1), 3,5 ng gereinigte Barcode-cDNA (ab Schritt 6.1.6) und nukleasefreies Wasser für ein Gesamtvolumen von 50 l hinzu.
9. Bewahren Sie es in einem Thermocycler nach der lipidbasierten Barcode-Bibliothek PCR (Tabelle 2).
10. Verwenden Sie 1.6x Select Reagenz, um das PCR-Produkt zu reinigen und die DNA mit 25 L EB-Puffer zu reinigen (siehe Schritt 4.1.6).
11. Quantifizieren Sie die Bibliothekskonzentration mit einer hochempfindlichen DNA-Analysemethode²⁴ aus der anfänglichen Verdünnung von 1:5 (Abbildung 2).
Beispiel-Barcode-Bibliotheksgenerierung für die Antikörper-basierte Multiplexing-Strategie (optionales Verfahren 2)
1. Fügen Sie dem Überstand, der Proben-Barcodes enthält, die ab Schritt 4.2.2.3 erworben wurden, zusätzliches 1,4-faches Reaktionsvolumen des ausgewählten Reagenzes hinzu, um ein 2x select Reagenzverhältnis zu erhalten.
2. Waschen Sie die Perlen mit 80% Ethanol, indem Sie den Schritten in 4.1.6 folgen und die Barcode-cDNA mit reinem Reinstwasser ausdünnen.
3. Führen Sie das Auswahlprotokoll mit 2x Select Reagenz ein zweites Mal und Elute mit Reinstwasser.
4. Bereiten Sie antikörper barcode library mixture (Tabelle 1) vor, und fügen Sie 45 l gereinigte barcoded cDNA aus dem letzten Schritt hinzu.
5. Inkubieren in einem thermischen Cycler nach der Antikörper-Barcode-Bibliothek PCR (Tabelle 2)²⁰.
6. Verwenden Sie 1.6x Select Reagenz, um das PCR-Produkt zu reinigen und die gereinigte Probe mit 30 l Reinstwasser zu reinigen (siehe Schritt 4.1.6).

7. Bibliothekssequenzierung

HINWEIS: Mehrere Sequenzierungsplattformen der nächsten Generation wie HiSeq 4000 und NovaSeq können verwendet werden, um die endogenen Transkriptbibliotheken und Multiplexing-Barcodebibliotheken zu sequenzieren.

Verwenden Sie eine Sequenzierungsplattform der nächsten Generation ihrer Wahl, um die endogenen Transkriptbibliotheken und Multiplexing-Barcodebibliotheken zu sequenzieren.
Verdünnen Sie die Bibliotheken gemäß den Empfehlungen eines Experten eines Sequenzierungsunternehmens oder einer Sequenzierungseinrichtung. Für die endogene Transkriptbibliothek werden mindestens 20.000 Lesevorgänge pro Zelle und für die Barcode-Bibliotheken 3000 empfohlen.

8. Datenanalyse

HINWEIS: De-multiplex die Sequenzierungsdaten mit der cloudbasierten Ressource BaseSpace oder durch Ausführen des bcl2fastq-Pakets auf einem UNIX-Server.

Endogene Transkriptom-Datenanalyse
1. Mit den fastq-Daten, die von der Entmultiplexing-Software generiert werden, führen Sie "mkfastq" auf der kommerziell verfügbaren Datenanalysepipeline (siehe Tabelle der Materialien) aus, um jeden GEMs-Barcode weiter zu entmultiplexen.
2. Führen Sie "Count" aus, um die Ausrichtung, Filterung, Barcodezählung und UMI-Zählung durchzuführen.
3. Führen Sie optional "aggr" aus, um mehrere Sequenzierungsspuren aus einem einzelnen Experiment zu aggregieren.
4. Verwenden Sie "Zellbrowser" (siehe Tabelle der Materialien), um Daten zu visualisieren, Zellen zu bündeln, differenziell exprimierte Gene zu identifizieren und tSNE- oder Genexpressions-Heatmap-Plots zu generieren.
5. Optional verwenden Sie eine gut gepflegte R-basierte Plattform²⁵ (siehe Materialtabelle), um Daten zu normalisieren und zu skalieren, differenziell exprimierte Gene zu identifizieren und tSNE/UMAP-Plots und Heatmaps für Genexpression zu generieren (Abbildung 3).
Multiplexing Barcode-Datenanalyse
1. Analyse der Daten aus der lipidbasierten Barcode-Strategie
  1. Verwenden Sie die kommerziell erhältliche Datenanalysepipeline oder das DeMULTIplex R-Paket (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq), um die Beispiel-Barcode-FASTQ-Dateien in eine Beispiel-Barcode-UMI-Zählmatrix zu konvertieren.
  2. Laden Sie die Barcode-UMI-Zählmatrix zusammen mit endogenen Transkriptomdaten auf eine R-basierte Plattform (siehe Materialtabelle) für die Integrationsanalyse (Abbildung 3).
2. Analyse der Daten aus der antikörperbasierten Barcode-Strategie
  1. Verwenden Sie "Count" aus der kommerziell verfügbaren Datenanalysepipeline, um die Barcodes zuzuordnen, indem Sie die CSV-Datei der Bibliothek und die Hashtag-Feature-Referenz-CSV-Datei bereitstellen.
  2. Laden Sie die ausgabeeinheitliche Feature-Barcode-Matrix, die Genexpressionszahlen zusammen mit Feature-Barcode-Zahlen für jeden Zell-Barcode enthält, auf eine R-basierte Plattform für die nachgelagerte Analyse.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie verwendeten wir mausembryonales Herz als Beispiel, um zu zeigen, wie multiplexierte einzelzellige mRNA-Sequenzierung durchgeführt wurde, um die verschiedenen Proben aus separaten Teilen eines Organs gleichzeitig zu verarbeiten. E18.5 CD1 Mausherzen wurden isoliert und in linkes Atrium (LA), rechtes Atrium (RA), linke Herzkammer (LV) und rechte Herzkammer (RV) seziert. Die vorgerichtlichen und ventrikulären Zellen wurden dann unabhängig mit einem lipidbasierten Barcoding-V...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie haben wir ein Protokoll zur Analyse von einzelzelligen Transkriptionsprofilen demonstriert. Wir haben auch zwei optionale Methoden für Multiplex-Proben im scRNA-Seq-Workflow bereitgestellt. Beide Methoden haben sich in verschiedenen Labors als machbar erwiesen und Lösungen für ein kostengünstiges und batcheffektfreies Einzelzellexperiment¹⁸^,²⁶geliefert.

Es gibt ein paar Schritte, die sorgfältig befolgt werden sollten, ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken David M. Patterson und Christopher S. McGinnis vom Labor Dr. Zev J. Gartner für ihre Art und Weise der Bereitstellung der lipidbasierten Barcoding-Reagenzien und Vorschläge zu den experimentellen Schritten und der Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (HL13347202) gegründet.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween-20	Bio-Rad	1610781
10x Chiphalter	10x Genomics	120252 330019
10x Chromium Controller	10x Genomics	120223
10x Magnetseparator	10x Genomics	120250 230003
10x Vortex Adapter	10x Genomics	330002, 120251
10x Vortex Clip	10x Genomics	120253 230002
4200 TapeStation-System	Agilent	G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626	University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo	Integrated DNA Technologies	Einzelsträngige DNA	25 nmol
Puffer EB	Qiagen	19086
CD1 Mäuse	Chales River	Stamm Code 022	bestellt trächtige Mäuse
Zentrifuge 5424R	Appendorf	2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns	10x Genomics	1000073	Bei Umgebungstemperatur lagern
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns	10x Genomics	120262	lagern bei -20 ° C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns	10x Genomics	1000094	Lagern bei -20 ° C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3	10x Genomics	1000095	Lagern bei -20 ° C
Chrom Single Cell 3' v3 Gel Beads	10x Genomics	2000059	Lagern bei -80 ° C
Kollagenase A	Sigma/Millipore	10103578001	Pulver bei 4 & Grad lagern; C, lagern bei -20 & Grad; C nach dem Auflösen
Kollagenase B	Sigma/Millipore	11088807001	Pulver bei 4 & Grad lagern; C, lagern bei -20 & Grad; C nach dem Auflösen
von D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL	Eppendorf	022431021
DNA LoBind Tube Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 mL	Eppendorf	022431048
Dynabeads MyOne SILANE	10x Genomics	2000048	Bei 4 Grad lagern; C, verwendet in Beads Cleanup Mix (Tabelle 1)
DynaMag-2 Magnet	Theromo Scientific	12321D
Ethanol, rein (200 Proof, wasserfrei)	Sigma	E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Zentrifugenröhrchen	Corning Cellgro	14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Zentrifugenröhrchen	Corning Cellgro	14-959-49A
Fötales Rinderserum, qualifiziert, United States	Fisher Scientific	26140079	Store bei -20 ° C
Finnpipette F1 Mehrkanalpipetten, 10-100μ l	Theromo Scientific	4661020N
Finnpipette F1 Mehrkanalpipetten, 1-10μ l	Theromo Scientific	4661000N
Flowmi Zellsieb	Sigma	BAH136800040	Porosität 40 μ m, für 1000 μl Pipettenspitzen, Packung mit je 50
Glycerin (Glycerin), 50% (v/v)	Ricca Chemical Company	3290-32
HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium	Thermo Fisher Scientific	14170112
Human TruStain FcX (Fc-Rezeptor-Blockierungslösung)	BioLegend	422301	Hinzufügen 5 & Mikro; l humanes TruStain FcX pro Million Zellen in 100 & Mikro; l Färbevolumen
Isopropanol (IPA)	Fisher Scientific	A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)	Fisher Scientific	NC0295239	Bei -20 & Grad lagern; C, wird in einer Mischung aus Lipid-getaggten Barcode-Bibliotheken verwendet (Tabelle 1)
Lipid-Barcode-Primer (Multi-Seq-Primer)	Integrierte DNA-Technologien	Einzelsträngige DNA	100 nmol
Puffer mit niedrigem TE-Gehalt (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA)	Thermo Fisher Scientific	12090-015
MasterCycler Pro	Eppendorf	950W
Nukleasefreies Wasser (Ambion)	Thermo Fisher Scientific	AM9937
PCR-Röhrchen 0,2 ml 8-Röhrchen-Streifen	Eppendorf	951010022
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X ohne Calcium & Magnesium	Corning Cellgro	21-040-CV
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 10% Rinderalbumin (Alternative zum Thermo Fisher Produkt)	Sigma-Aldrich	SRE0036
Pipette 4er-Pack (0,1– 2,5 Mio. Jahre L, 0,5-10 μm; L, 10– 100 Mio. Jahre L, 100– 1.000 μm L Pipetten mit variablem Volumen	Fisher Scientific	05-403-151
Selection Reagenz (SPRIselect Reagenzienkit)	Beckman Coulter	B23318 (60ml)
Template Switch Oligo	10x Genomics	3000228	Lagern bei -20 ° C, wird im Master Mix verwendet (Tabelle 1)
Die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie wird auch als Cell Hashing
Der Zellbrowser ist Loup Cell Browser	10x Genomics		https://support.10xgenomics. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
Die kommerziell verfügbare Analyse-Pipline in Schritt 8.1 ist Cell Ranger	10x Genomics		https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ latest/what-is-cell-ranger
Die lipidbasierte Barcoding-Strategie ist auch als MULTI-seq
. Die gut gepflegte R-Plattform ist Seurat V3	satijalab		https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL Ultra Low Retention Filter Pipettenspitze	USA Scientific	1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL Ultra Low Retention Filter Pipettenspitze	USA Scientific	1182-1730
TipOne RPT 200 ul Ultra Low Retention Filter Pipettenspitze	USA Scientific	1180-8710
TotalSeq-A0301 Anti-Maus Hashtag 1 Antikörper	BioLegend	155801	0,1 - 1,0 µ g Antikörper in 100 & Mikro; l Färbepuffer pro 1 Million Zellen
TotalSeq-A0302 Anti-Maus Hashtag 2 Antikörper	BioLegend	155803	0,1 - 1,0 µ g Antikörper in 100 & Mikro; l Färbepuffer pro 1 Million Zellen
TotalSeq-A0302 Anti-Maus Hashtag 3 Antikörper	BioLegend	155805	0,1 - 1,0 µ g Antikörper in 100 & Mikro; l Färbepuffer pro 1 Million Zellen
TrueSeq RPI-Primer	Integrated DNA Technologies	Einzelsträngige DNA	100 nmol, verwendet in einem Lipid-tagged Barcode Library Mix (Tabelle 1)
Trypanblau-Lösung, 0,4 %	Fisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot	Fisher Scientific	25200-056
Universal I5	Integrated DNA Technologies	Einzelsträngige DNA	100 nmol

von bezeichnetbekannt

References

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Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

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