Identifizieren von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split Luciferase Assay System

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virusmitteln vor, die die HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split-Luziferase-Assay-System hemmen. Dieses System ermöglicht den einfachen Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen und eignet sich zur Identifizierung von Inhibitoren solcher Wechselwirkungen.

Zusammenfassung

Es besteht ein dringender Bedarf an neuartigen therapeutischen Wirkstoffen für die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV). Obwohl derzeit verfügbare Nukleos(t)ide Analoge die Virusreplikation stark hemmen, haben sie keine direkte Wirkung auf die Expression viraler Proteine, die aus einer viralen kovalent geschlossenen kreisförmigen DNA (cccDNA) transkribiert wurden. Da eine hohe virusfreie Antigenbelastung bei dieser chronischen und HBV-bedingten Karzinogenese eine Rolle spielen kann, ist das Ziel der HBV-Behandlung die Ausrottung viraler Proteine. Das HBV-Regulierungsprotein X (HBx) bindet an das an den Wirt dna schädigende Protein 1 (DDB1) Protein, um die strukturelle Erhaltung der Chromosomen 5/6 (Smc5/6) zu abbauen, was zu einer Aktivierung der viralen Transkription aus cccDNA führt. Hier präsentieren wir mit Einem Split Luciferase Complementation Assay System ein umfassendes zusammengesetztes Screening-System zur Identifizierung von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung. Unser Protokoll ermöglicht eine einfache Erkennung der Interaktionsdynamik in Echtzeit in lebenden Zellen. Diese Technik kann ein wichtiger Test werden, um neue therapeutische Wirkstoffe für die Behandlung von HBV-Infektion zu entdecken.

Einleitung

Die Hepatitis-B-Infektion (HBV) ist weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit: Jährliche Schätzungen von 240 Millionen chronisch mit HBV infizierten Menschen und 90.000 Todesfällen aufgrund von Komplikationen durch die Infektion, einschließlich Zirrhose und Hepatozellulärem Karzinom (HCC)¹. Obwohl die derzeitigen Anti-HBV-Therapeutika, Nukleos(t)ide-Analoga, die virale Reverse-Transkription ausreichend hemmen, erreichen sie selten die Eliminierung viraler Proteine, was das langfristige klinische Ziel ist. Ihre schlechte Wirkung auf die virale Proteinelimination ist auf ihre fehlende direkte Wirkung auf die virale Transkription ....

Protokoll

ANMERKUNG: Eine schematische Darstellung des Split-Luziferase-Assays ist in Abbildung 1Adargestellt, und der Assay-Prozess ist in Abbildung 1Bdargestellt. Die Interaktionsdynamik kann in Echtzeit ohne Zelllyse gemessen werden.

1. Zellvorbereitung

1. Pflegen Sie kultivierte HEK293T-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch 10% v/v fetales Rinderserum (FBS), 1x Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in 20% O₂ und 5% CO₂.
2. 5 x 10⁶ Zellen in eine 100-mm-Schale mit 1....

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse nach der Verwendung dieses Protokolls sind in Abbildung 2A,B dargestellt. Das Signal-Hintergrund-Verhältnis war größer als 80 und der Z-Faktor⁹ (der Goldstandard-Qualitätsindex für Dasperthemmierungs-Hochdurchsatz) war größer als 0,5, was darauf hindeutet, dass dieses Assay-System für das Screening mit hohem Durchsatz akzeptabel war. Mit der Schwelle auf >40% Hemmung im Vergleich zur Kontro.......

Diskussion

Wir entwickelten ein praktisches Screening-Verfahren mit einem Split-Luziferase-Assay, um HBx-DDB1-Bindungshemmer zu finden. Die Interaktionsdynamik kann in Echtzeit in lebenden Zellen ohne Zelllyse nachgewiesen werden. Die Hemmung der HBx-DDB1-Wechselwirkung führt zur Wiederherstellung von Smc5/6, was zur Unterdrückung der viralen Transkription, Proteinexpression und cccDNA-Produktion⁷führt. Dieser neuartige Mechanismus der antiviralen Wirkung kann die Unzulänglichkeiten der aktuellen HBV-Therapi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effecten-Transfektionsreagenz	Qiagen	301425	Enthält DNA-Kondensationspuffer, Enhancer-Lösung und Transfektionsreagenz
FBS	Nichirei
GloMax 96 Mikroplatten-Luminometer	Promega	E6521
HBx– LgBit-exprimierendes DNA-Plasmid	Unser Labor		Auf Anfrage verfügbar
HEK293T Zellen	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI-Startersysteme	Promega	N2015	Enthält Nano-Glo Reagenz für lebende Zellen
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Im Manuskript als "gepuffertes Zellkulturmedium" beschrieben
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-zugelassene Arzneimittelbibliothek V2 Version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Die hier verwendeten Verbindungen waren wie folgt: Mequinol, Mercaptopurinhydrat, Mesna, Mestranol, Metaproterenol-Hemisulfat, Metaraminolbitartrat, Metaxalone, Methacholinchlorid, Methazolamid, Methenaminhipurat, Methocarbamol, Methotrexat, Methoxsalen, Methscopolaminbromid, Methsuximid, Methyclothiazid, Methylaminolevulinat und Middot; HCl, Methylergonovinmaleat, Metolazon, Metyrapon, Mexiletin und Middot; HCl, Glimmerpilz, Miconazol, Midodrin&Middot; HCl, Miglitol, Milnacipran & Middot; HCl, Mirtazapin, Mitotan, Moexipril & Middot; HCl, Mometasonfuroat, Mupirocin, Nadolol, Nafcillin & Middot; Na, Naftifine & Middot; HCl, Naratriptan&Middot; HCl, Natamycin, Nebivolol & Middot; HCl, Nelarabin, Nepafenac, Nevirapin, Niacin, Nikotin, Nilotinib, Nilutamid, Nitazoxanid, Nitisinon, Nitrofurantoin, Nizatidin, Nortriptylin und Middot; HCl, Olsalazin & Middot; Na, Orlistat, Oxaprozin, Oxtriphyllin, Oxybutyninchlorid, Oxytetracyclin & Middot; HCl, Paliperidon, Palonosetron & Middot; HCl, Paromomycinsulfat, Pazopanib & Middot; HCl, Pemetrexed-Dinatrium, Pemirollast-Kalium, Penicillamin, Penicillin-G-Kalium, Pentamidin-Isethionat, Pentostatin, Perindopril-Erbumin, Permethrin, Perphenazin, Phenelzinsulfat, Phenylephrin, Phytonadion, Pimecrolimus, Pitavastatin-Calcium und Podofilox
SmBit– DDB1-exprimierendes DNA-Plasmid	Unser Labor		Auf Anfrage verfügbar
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049