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Summary

Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.

Abstract

Das Studium der posttranskriptionalen Regulation ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen Boten-RNA (mRNA) und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Tatsächlich könnten Schwankungen des Transkriptsausdrucks die Übersetzungseffizienz und letztlich die zelluläre Aktivität eines Transkripts verändern. Mehrere experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNA zu untersuchen, obwohl einige dieser Methoden Einschränkungen haben, die die ordnungsgemäße Untersuchung der posttranskriptiellen Modulation verhindern. Ein Promotor-Induktionssystem kann ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors ausdrücken. Diese Methode ermöglicht die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung ohne störende Zellhomöostase. Ein großer Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit, Zellen zu transfekten, was den Einsatz dieser Technik in isolierten Primärzellen einschränkt, die sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken sind. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden ausgiebig verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolar-Epithels zu untersuchen. Die einzigartigen Eigenschaften und der Phänotyp der primären Alveolarzellen machen es wichtig, die posttranskriptionalen Modulationen von Genen zu untersuchen, die für diese Zellen von Interesse sind. Daher war es unser Ziel, ein neuartiges Werkzeug zu entwickeln, um die posttranskriptionischen Modulationen von mRNAs von Interesse in alveolar epitheliaalen Zellen in der Primärkultur zu untersuchen. Wir haben ein schnelles und effizientes transientes Transfektionsprotokoll entwickelt, um ein transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem in primäre Alveolar-Epithelzellen einzufügen. Diese Klonstrategie, die ein virales Epitop verwendet, um das Konstrukt zu markieren, ermöglicht die einfache Diskriminierung des Konstruktausdrucks von der von endogenen mRNAs. Mit der modifizierten Methode des Quantifizierungszyklus (Cq) kann die Expression des Transkripts dann in verschiedenen Zeitintervallen quantifiziert werden, um seine Halbwertszeit zu messen. Unsere Daten zeigen die Effizienz dieses neuartigen Ansatzes bei der Untersuchung der posttranskriptionalen Regulation unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in primären Alveolarepithelzellen.

Introduction

Mehrere Techniken wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Die Puls-Chase-Zerfallstechnik, die markierte mRNAs verwendet, ermöglicht die gleichzeitige Auswertung eines großen Pools von mRNAs mit minimaler zellulärer Störung. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine direkte Schätzung der Halbwertszeit eines einzelnen Gentranskripts und kann nicht implementiert werden, um die posttranskriptionelle Modulation einer mRNA nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren, ROS, Alarminen oder Entzündungen zu untersuchen¹.

Die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, wie Actinomycin D und Amanitin, ist eine relativ einfache Methode zur Messung der mRNA-Abbaukinetik im Laufe der Zeit. Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber früheren Techniken (d. h. Pulse-Chase) beruht auf der Fähigkeit, die Halbwertszeit eines bestimmten Transkripts direkt abzuschätzen und zu vergleichen, wie verschiedene Behandlungen seine Abbaukinetik beeinflussen könnten. Die signifikante schädliche Wirkung von Transkriptionsinhibitoren auf die Zellphysiologie stellt jedoch einen großen Nachteil des Ansatzes²dar. Tatsächlich hat die Hemmung des gesamten Zelltranskriptoms mit diesen Medikamenten die negative Nebenwirkung, die Synthese von Schlüsselelementen, die an der mRNA-Stabilität beteiligt sind, wie z. B. microRNAs (miRNAs), sowie die Expression und Synthese von RNA-bindenden Proteinen, die für den mRNA-Abbau und die Stabilität wichtig sind, zu stören. Die starke Störung der Gentranskription durch diese Medikamente könnte daher die Abbaukurven von Transkripten arteffakt verändern.

Das Promotor-Induktionssystem stellt einen dritten Ansatz zur Messung der Halbwertszeit einer bestimmten mRNA dar. Diese Methode misst den Abbau einer spezifischen mRNA in ähnlicher Weise wie Methoden, die Transkriptionsinhibitoren verwenden. Häufig kommen zwei Arten von Induktionssystemen zum Einsatz: der seruminduzierte c-fos-Promoter³ und das Tet-Off Induzierbare System⁴. Mit dem c-fos-System ist die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, die toxisch für die Zelle sein können, nicht erforderlich. Diese Methode erfordert jedoch eine Zellzyklussynchronisierung, die die Auswertung der tatsächlichen Stabilität eines Transkripts während der Interphase⁵verhindert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Tet-Off-System die starke Expression des Gens von Interesse (GOI) unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors. Dieses System erfordert das Vorhandensein von zwei Elementen, die in die Zelle kotransfiziert werden müssen, um funktionsfähig zu sein. Das erste Plasmid (pTet-Off) drückt das regulatorische Protein tTA-Adv aus, einen hybriden synthetischen Transkriptionsfaktor, der aus dem prokaryotischen Repressor TetR (aus Escherichia coli) besteht, das zu drei Transkriptionstransaktivierungsdomänen aus dem viralen Protein HSV VP16 verschmolzen ist. Die GOI wird unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors (P_Tight) in das pTRE-Tight-Plasmid geklont, das die minimale Sequenz des Cytomegalievirus-Promotors (CMV) umfasst, die zu sieben Wiederholungen der tetO-Operatorsequenz verschmolzen ist. Die Transkription des Gens flussabwärts von P_Tight ist abhängig von der Wechselwirkung von TetR mit tetO. In Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Derivat Doxycyclin verliert der TetR-Repressor seine Affinität zum tetO-Operator, was zu einer Einstellung der Transkription⁴führt. Die Eigenschaften des Tet-Off-Systems machen es zu einem idealen Modell für die Untersuchung der spezifischen mRNA-Expression in eukaryotischen Zellen unter Vermeidung potenzieller pleiottroper Effekte, die sekundär zum Fehlen prokaryotischer regulatorischer Sequenzen in der eukaryotischen Zelle⁶sind. Normalerweise werden doppelt stabile Tet-Off-Zelllinien (HEK 293, HeLa und PC12) mit diesem System verwendet, um Kopien des Reglers und Reaktionsplasmide für einen bequemen Zugriff auf die kontrollierbare Genexpression^7,8,9zu integrieren.

Mehrere Modelle von Alveolar-Epithelzellen in der Kultur wurden verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolarenepithels zu untersuchen. Seit Jahren nutzen Forscher ausgiebig menschliche oder Nagetier-Primärzellen^10,11 sowie verewigte Zelllinien wie menschliche A549- oder Ratten-RLE-6TN-Zellen^12,13. Obwohl sie im Allgemeinen weniger proliferativ und schwieriger zu kultur- und transfektionsmittel sind, bleiben Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur der Goldstandard für die Untersuchung der Funktion und Dysfunktion des Alveolarers epithel unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Tatsächlich weisen verewigte Zelllinien wie A549-Zellen nicht die komplexen Eigenschaften und Phänotypen von Primärzellen auf, während alveolare Epithelzellen in der Primärkultur die Haupteigenschaften des Alveolarenepithels rekapitulieren, insbesondere die Fähigkeit, eine polarisierte und enge Barriere^14,15zu bilden. Leider sind diese Zellen sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken, wie diejenigen, die Liposomen verwenden, was den Einsatz eines Promotor-induzierten Systems wie Tet-Off sehr schwierig macht.

Die posttranskriptionelle Modulation von mRNAs ist eine der effektivsten Methoden zur schnellen Modulation der Genexpression eines Transkripts¹⁶. Die mRNA 3′ unübersetzte Region (3′ UTR) spielt in diesem Mechanismus eine wichtige Rolle. Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zur 5′ UTR eine exponentielle Korrelation zwischen der Länge der 3′ UTR und den zellulären und morphologischen Komplexitäten eines Organismus besteht. Diese Korrelation legt nahe, dass die 3′ UTR, wie die mRNA-Codierungsregionen, einer natürlichen Selektion unterzogen wurde, um eine immer komplexere posttranskriptive Modulation während der gesamten Evolution¹⁷zu ermöglichen. Die 3′ UTR enthält mehrere Bindungsstellen für Proteine und miRNAs, die die Stabilität und Übersetzung des Transkripts beeinflussen.

In der vorliegenden Arbeit haben wir ein Werkzeug entwickelt, um die Rolle hochkonservierter Domänen in der 3′ UTR einer GOI zur Kontrolle der Transkriptstabilität zu untersuchen. Wir konzentrierten uns auf den epithelialen Natriumkanal, die Alpha-Untereinheit (ENaC), die eine Schlüsselrolle in der alveolar epithelialen Physiologie¹⁸spielt. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden erfolgreich transfiziert mit den beiden Komponenten des Tet-Off-Systems transfiziert, was die Untersuchung der Rolle der 3′ UTR in der mRNA-Stabilität mit einem System ermöglicht, das die Zellphysiologie und den Stoffwechsel im Vergleich zur Verwendung von Transkriptionsinhibitoren mit anderen Protokollen minimal beeinflusst. Es wurde eine Klonstrategie entwickelt, um die Expression der goI von der des endogenen Gens unter Verwendung eines nicht endogen exprimierten Epitops (V5) zu unterscheiden. Die Reaktions- und regulatorischen Plasmide wurden dann mit hilfe einer Pipettenelektroporationstechnik in Alveolar-Epithelzellen übertragen. Anschließend wurde die Expression des Transkripts durch Inkubation der Zellen mit Doxycyclin in unterschiedlichen Zeitintervallen gemessen. Die Halbwertszeit des Transkripts wurde von RT-qPCR mit einer modifizierten Cq-Methode unter Verwendung des transfizierten tTA-Ad mRNA-Produkts zur Normalisierung bewertet. Durch unser Protokoll bieten wir eine bequeme Möglichkeit, die posttranskriptionelle Modulation eines Transkripts unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen und die Einbeziehung der nicht übersetzten Regionen genauer zu definieren.

Protocol

Alle tierischen Eingriffe wurden nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee des Research Center of Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM) genehmigt.

1. Entwurf und Generierung des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse ausdrückt (GOI)

1. Verwenden Sie einen induzierbaren Tetracyclin-Off-Vektor, z. B. pTRE-Tight.
2. Analysieren Sie die Reihenfolge der GOI und der Multiple-Klon-Site (MCS) des Vektors, um die Einschränkungssites im MCS zu identifizieren, die intern nicht in der unternehmenseigenen Stelle vorhanden sind.
3. Isolieren Sie primäre Alveolar-Epithelzellen aus männlichen Sprague-Dawley-Rattenlungen, wie zuvor beschrieben^19,20.
4. Reinigen Sie die gesamte RNA aus den Alveolar-Epithelzellen durch RNA-Extraktion mit einer Standardmethode, wie phenol/chloroform-Extraktion oder der Verwendung von Siliziumdioxid-basierten RNA-Spin-Säulen.
5. Reverse-Transcribe der mRNA in komplementäre DNA (cDNA) mit Oligo(dT) und High-Fidelity Reverse Transkriptase.
6. Verwenden Sie Hochtreue-Taq-Polymerase und Standard-Überlappungs-PCR-Techniken, um die GOI mit zwei ausgewählten Restriktions-Enzymerkennungsstellen mit entworfenen Primern zu flankieren.
   1. Lassen Sie die Vorwärtsgrundierung eine Kozak-Konsensribosome-Bindungsstelle²¹ enthalten, um die Expressionskonzentration enparieren zu lassen, um die Proteinexpression parallel zur mRNA-Stabilität zu untersuchen. Eine Sequenz, die das V5-Epitop vor der goI kodiert, muss enthalten sein, um den Ausdruck der transfizierten goI von endogenen Expressionen (Tabelle 1) zu unterscheiden.
   2. Lassen Sie die umgekehrte Grundierung ein Polyadenylierungssignal nach dem Stop-Codon enthalten.
7. Mutanten können durch sequenzielles Löschen erzeugt werden, um die Auswirkungen verschiedener 3′ UTR-Regionen auf die Stabilität der mRNA der GOI mit Reverse Primern zu untersuchen, die eine Polyadenylierungsstelle kodieren, die das 3′ Ende der GOI 3′ UTR schrittweise löscht (Abbildung 6). Alternativ kann PCR-gesteuerte Mutagenese verwendet werden, um eine bestimmte Interessensregion in der 3′ UTR²²anzusprechen.
8. Verdauen Sie den induzierbaren Vektor und den Einsatz mit den zuvor gewählten Restriktionsenzymen bei der entsprechenden Inkubationstemperatur für 1 h, gefolgt von der Behandlung mit Phosphatase während der Vektorreaktion für 30 min, um eine Selbstligation zu vermeiden.
9. Trennen Sie den verdauten Vektor und fügen Sie Segmente durch Elektrophorese in einem 1-1,5% Agarose-Gel ein (Konzentration abhängig von der Größe des Einsatzes).
10. Sammeln Sie mit einer Klinge und einem UV-Licht die DNA-Fragmente, die den gewünschten Einsatz und vektor enthalten.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
11. Reinigen Sie die gesammelten Segmente aus dem Agarose-Gel mit einem pcR-Reinigungskit auf Kieselsäurebasis und messen Sie die Konzentration mittels Spektrophotometrie bei 260 nm.
12. Ligate die GOI und den induzierbaren Vektor mit T4 DNA Ligase mit einem Vektor: einfügen Molar Verhältnis von 1:3, um die Wahrscheinlichkeit der Ligation zu erhöhen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (RT) für 3 h.
13. Verwandeln Sie die Ligationsreaktion in kompetente E. coli (DH5).
    1. Fügen Sie 1-10 ng Vektor und Gen in eine Röhre mit 100 l kompetenten Zellen. Inkubieren Sie die Zellen 30 min auf Eis und dann Wärmeschockzellen bei 42 °C für 45 s. Legen Sie die Röhre für 2 min auf Eis und fügen Sie 900 l RT LB Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 °C mit Schütteln bei 225 Rpm.
    2. Verteilen Sie 100 l der Reaktion auf eine LB-Agarplatte mit einem geeigneten Antibiotikum (z. B. 100 g/ml Ampicillin für den pTRE-Tight-Vektor), um die transformierten Bakterien auszuwählen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C.
    3. Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer Impfschleife oder einer 20-L-Spitze aus und inkubieren Sie über Nacht in 5 ml LB-Medium, das das geeignete Antibiotikum bei 37 °C mit Schütteln enthält. Die transformierten Bakterien können in Glycerinvorräten bei -80 °C im Verhältnis 400:600 lb Medium zu Glycerin gelagert werden.
14. Extrahieren Sie die Plasmid-DNA mit Kieselsäure-basierten Plasmidsäulen und messen Sie die Konzentration mittels Spektrophotometrie bei 260 nm. Bestätigen Sie die Einfügung der goI durch Restriktionsanalyse und ihre Ausrichtung sowie das Fehlen von Mutationen, die möglicherweise während der RT-PCR durch Sequenzierung eingeführt werden.

2. Transfektion des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse (GOI) in primäre Alveolar-Epithelzellen ausdrückt

1. Isolieren Sie Typ II Alveolare Epithelzellen aus rattenlunge.
2. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/cm² in 100 mm Petrischalen mit komplettem minimalen essentiellen Medium (komplettes MEM). Komplettes MEM ist MEM, ergänzt durch 10% FBS, 0,08 mg/L Tobramycin, Septra (3 g/mL Trimethoprim und 17 g/ml Sulfamethoxazol), 0,2% NaHCO₃, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) und 2 mM L-Glutamin. Die Zellen für 24 h bei 37 °C in 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator skulturen.
3. Am nächsten Tag 500 l komplettes MEM ohne Antibiotikum in jeden Brunnen einer neuen 12-Brunnenplatte legen und die Platte 30 min bei 37 °C vorwärmen. Während dieses Schritts ist es wichtig, fetales Rinderserum frei von kontaminierenden Tetracyclinen oder mit einem zu niedrigen Niveau zu verwenden, um die Induzierbarkeit zu stören.
4. Bereiten Sie 1,5 ml-Röhrchen vor, die das Plasmid mit dem induzierbaren GOI (GOI-Plasmid) und dem regulatorischen Vektor (z. B. pTet-Off) enthalten, indem Sie 1 g GOI-Plasmid und 1 g regulatorischen Vektor pro Bohrwert bei RT hinzufügen. Für Coexpression-Experimente mit RNA-bindenden Proteinen (RBP) wird dem DNA-Mix 1 g eines konstitutiven Vektors (z.B. pcDNA3), der das RPB von Interesse ausdrückt, zugesetzt (Abbildung 7).
5. Das Medium ansaugen und die Zellen vorsichtig mit PBS (ohne Kalzium und Magnesium) vorwärmiert bei 37 °C abspülen.
6. Fügen Sie 5 ml 0,05% Trypsin vorgewärmt bei 37 °C hinzu und inkubieren Sie die Zellen, bis die Zellen abgetrennt sind (2-4 min). Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 ml komplettes MEM ohne Antibiotikum hinzufügen.
7. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml Rohr, waschen Sie die Petrischale mit 4 ml Medium, um so viele verbleibende Zellen wie möglich zu sammeln, und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
8. Den Überstand vorsichtig ansaugen und entsorgen und das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zählen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet im Resuspensionspuffer in einer Konzentration von 4 x 10⁷ Zellen/ml wieder aufsetzen. Fügen Sie die Zellen aus dem 1,5 ml Rohr in Schritt 2.4 bei einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Brunnen vorbereitet und mischen Sie sie sanft durch Pipettieren nach oben und unten.
10. Legen Sie das Rohr in die Elektroporationsvorrichtung und füllen Sie es mit 3,5 ml Elektrolysepuffer.
11. Legen Sie eine vergoldete Elektrodenspitze durch vollständiges Drücken des Kolbens in eine Pipette ein. Mischen Sie den Inhalt des 1,5 ml Rohres vorsichtig und saugen Sie die Zellen vorsichtig mit der Pipette an. Achten Sie darauf, dass Luftblasen nicht in die Spitze gelangen, da dies während der Elektroporation zu lichten Lichtbögen führt und zu einer verminderten Transfektionseffizienz führt.
12. Legen Sie die Pipette in die Elektroporationsstation ein, bis ein Klickgeräusch vorliegt.
13. Wählen Sie das entsprechende Elektroporationsprotokoll für alveolare Epithelzellen, das einer Pulsspannung von 1.450 V und 2 Impulsen mit einer Breite von 20 ms entspricht, und drücken Sie auf dem Touchscreen Start.
14. Unmittelbar nach der Transfektion die Pipette entfernen und die Zellen in einen zuvor mit komplettem MEM gefüllten Brunnen ohne Antibiotikum übertragen, das auf 37 °C vorgewärmt wurde.
15. Wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.14 für die verbleibenden Proben.
16. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig über die Brunnenoberfläche zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Ersetzen Sie das Medium nach 2 Tagen durch komplettes MEM durch Antibiotika.
17. Bestätigen Sie den Erfolg der Transfektion, indem Sie die Expression von eGFP unter einem Fluoreszenzmikroskop oder durch Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor(Abbildung 1) beobachten.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und erfordert einen zusätzlichen Transfektionsschritt mit einem anderen Plasmid, das eGFP exsep, wie pcDNA3-EGFP, exzessischt.

3. Induktion der Transkriptionshemmung der GOI

HINWEIS: Die Zellen können mit den gewünschten Behandlungen vor doxycyclin induktion vorbehandelt werden, um ihre Auswirkungen auf die mRNA-Stabilität zu bewerten (Abbildung 5).

1. Bereiten Sie eine Doxycyclin-Stammlösung von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor. Bewahren Sie die Lagerlösung bei -20 °C vor Licht schutzfrei auf. Doxycyclin, ein Tetracyclin-Derivat, wird anstelle von Tetracyclin verwendet, weil es eine längere Halbwertszeit (2x) als Tetracyclin hat. Darüber hinaus ist eine geringere Konzentration von Doxycyclin für die vollständige Inaktivierung des Tet Operon²³erforderlich.
   HINWEIS: Doxycyclin könnte die mRNA-Expression der endogenen GOI beeinflussen. Um dies zu überprüfen, sollte die Wirkung einer 24-h-Behandlung mit Doxycyclin auf Alveolarzellen getestet werden, um das Fehlen von Veränderungen der GOI-Expression zu bestätigen (Abbildung 2).
2. Bereiten Sie eine frische 1 g/ml Doxycyclin-Lösung in vollständiger MEM 72 h-Posttransfektion vor und erwärmen Sie sie auf 37 °C.
3. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml vollständiges MEM, das 1 g/ml Doxycyclin pro Brunnen enthält, um die Transkription der GOI zu hemmen.
4. Inkubieren Sie mehrere Brunnen bei 37 °C in 5%_CO2 für verschiedene Zeitmengen von 15 min-6 h, um die mRNA-Halbwertszeit der goI zu bewerten.
5. Am Ende der Behandlung die Zellen mit eiskaltem PBS waschen und mit einem handelsüblichen Phenol-Chlorform-RNA-Extraktionskit lysieren, indem Sie 500 l Puffer pro Brunnen hinzufügen und die Platte schütteln, um die Zellen zu homogenisieren.
6. Isolieren Sie die RNA gemäß dem Herstellerprotokoll. Bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 nm. RNA-Proben mit 260:230 bzw. 260:280 Verhältnissen von 1,8 bzw. 2,0 gelten als rein.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Bestimmung der mRNA-Stabilität der GOI

1. Behandeln Sie 1 g Gesamt-RNA mit RNAse-freier DNAse I (Verstärkungsgrad), um jede Spur von Plasmid-DNA zu entfernen, die die nachfolgende DNA-Verstärkung stören könnte.
   1. Kombinieren Sie in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen 1 g RNA, 1 l 10x DNase I-Reaktionspuffer, 1 l DNAse I (1 U/L) und RNAse-freies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 10 l zu erhalten.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion bei RT für 20 min.
   3. Deaktivieren Sie DNAse I, indem Sie dem 10-L-Reaktionsmix 1 l von 25 mM EDTA hinzufügen und die Reaktion bei 70 °C für 10 min inkubieren.
2. Reverse-Transcribe die DNA-erschöpfte Gesamt-RNA in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen cDNA-Synthese-Kit mit einer Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Hexamer-Primern, um die Reverse-Transkriptionseffizienz zu verbessern.
   1. Fügen Sie kurz 4 l 5x Reaktionsmischung, 1 l Reverse-Transkriptase und 4 l RNAse-freies Wasser zu 11 l des DNA-erschöpften gesamten RNA-Mixes hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 l zu erhalten. Mischen Sie die Reaktion gut, indem Sie sie nach oben und unten pipetieren.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion für 5 min bei 25 °C, gefolgt von 20 min bei 46 °C, und inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie sie bei 95 °C für 1 min inkubieren. Jede Reaktion ergibt 50 ng/l cDNA-Produkt.
   3. Verdünnen Sie die cDNA-Reaktion auf eine Konzentration von 5 ng/l, indem Sie dem 20-L-Reaktionsmix 180 l molekularbiologisches Wasser zusetzen. Bewahren Sie die cDNA-Produkte bei -80 °C auf oder führen Sie sofort die quantitative PCR (qPCR) in Echtzeit durch.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Entwerfen Sie qPCR-Primer speziell für die GOI vorwärts und rückwärts.
   1. Aufgrund der endogenen Expression der goI in den Zellen müssen die Primer so ausgelegt sein, dass sie ein 100-150 bp Amplikon des Ang.:A5-Epitops verstärken, das an die goI gekoppelt ist (Tabelle 1).
   2. Interne Referenzgenprimer müssen auch als Normalisierungskontrollen verwendet werden. Üblicherweise werden Haushaltsgene wie Beta-Actin und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1-Gene als Referenzgene verwendet. Diese können jedoch aufgrund der Variation der Transfektionseffizienz nicht mit diesem Induktionssystem verwendet werden. Stattdessen wird die Expression des tTA-Ad-Transkripts zum Zwecke der Normalisierung bewertet, da seine Expression in Zellen aufgrund der Aktivität des Cytomegalievirus-Promotors konstitutiv ist. Jede Variation in seiner Expression, gemessen mit qPCR, ist repräsentativ für die Transfektionseffizienz (Primer: vorwärts 5′-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3′ und reverse 5′-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp Amplicon) und ermöglicht die Normalisierung der Expression der transfizierten Klone (Abbildung 3).
4. Bereiten Sie jede qPCR-Reaktion in Dreifacharbeit mit einem SYBR Green Farbstoff-Master-Mix vor.
   1. Verdünnen Sie die 5 ng/l cDNA-Mischung mit molekularbiologischem Wasser auf eine Konzentration von 1,25 ng/l.
   2. Kombinieren Sie 5 l SYBR Green Farbstoff-Master-Mix (2x), 0,1 l molekularbiologisches Wasser, 0,45 l von 7,5 ‘M Vorwärtsprimer, 0,45 ‘L von 7,5 ‘M Reverse Primer und 4 ‘L von 1,25 ng/l cDNA, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 ‘L zu erhalten. Verwenden Sie optische Klebefolie, um sicherzustellen, dass die Plattenabdeckung versiegelt ist und um Verunreinigungen und Verdunstung zu verhindern.
   3. Drehen Sie den Reaktionsmix kurz durch Zentrifugation nach unten und legen Sie die Platte in einen qPCR Thermocycler.
5. Verstärken Sie die V5-getaggten GOI- und tTA-Ad-Amplicons mit den folgenden qPCR-Bedingungen: 95 °C für 10 min als Denaturierungsschritt, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s, 58 °C für 15 s und 72 °C für 20 s. Nach der Auswertung der Amplifikationszyklen muss eine hochauflösende Schmelzkurve erzeugt werden, um die spezifischen Schmelztemperaturen der gewünschten Amplikonen zu bewerten und das Fehlen von Rauschamplikonspitzen zu gewährleisten.
   1. Schließen Sie negativgesteuerte Kontrollen für die qRT-PCR ein, indem Sie qPCR mit RNA als Vorlage ohne Reverse-Transkriptase durchführen, um als Kontrolle für eine mögliche Plasmid-DNA-Kontamination zu dienen, und qPCR ohne cDNA, die dem qPCR-Mix hinzugefügt wird, um sicherzustellen, dass das Fehlen von Primer-Dimeren oder Kontaminanten.
   2. Die optimale cDNA-Konzentration, Primereffizienz und Konzentration muss entsprechend der GOI durch einen Standard-Kurventest optimiert werden. Führen Sie dazu eine serielle Verdünnung mit cDNA aus unbehandelten Zellen (kultiviert ohne Doxycyclin) durch. Die Standardkurve wird erzeugt, indem die Cq-Werte mit dem Protokoll des cDNA-Verdünnungsfaktors dargestellt werden, und die Amplifikationseffizienz (E) wird entsprechend der Steigung der Standardkurve mit der folgenden Formel berechnet:
      E = 10^-1/Steigung
      HINWEIS: Die Verstärkungseffizienz sollte etwa 0,9 bis 1,05 betragen. Andernfalls müssen die Primer neu gestaltet werden.
6. Analysieren Sie die qPCR-Daten mit der vergleichenden Cq-Methode, indem Sie die Expressionswerte der GOI auf die Expression von tTA-Ad normalisieren, um die relativen Expressionsniveaus der GOI zu erhalten und ihre Expression als Prozentsatz der mRNA-Expression der GOI in Zellen desselben Tieres am Startpunkt (t = 0) zu melden (Abbildung 4).
7. Die Halbwertszeit wird aus der Ratenkonstante (K) der GOI mRNA Abbaukurve mit der folgenden Gleichung bestimmt:
   t_1/2 = ln 2/K.

Representative Results

Discussion

Die niedrige Transfektionsrate von Alveolarenepithelzellen in der Primärkultur war eine ernsthafte Einschränkung für die Verwendung des Tet-Off-Systems zur Beurteilung der mRNA-Stabilität in diesen Zellen. Diese Einschränkung wurde jedoch durch die Pipettenelektroporation überwunden, die eine Transfektionseffizienz von 25-30 % ermöglichte (Abbildung 1 und Abbildung 3)²⁶.

Die Messung der Transkriptstabilität ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen mRNA und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Die Variation der Bioverfügbarkeit einer goI kann die Übersetzungseffizienz verändern und einen direkten Einfluss auf die Expression der goI in der Zelle haben. Aus diesen Gründen wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Wie oben erläutert, hat jede dieser Techniken Einschränkungen und Einschränkungen, die die ordnungsgemäße Untersuchung einer Transkriptvon interesse verhindern. Im Vergleich zu anderen Techniken hat das hier entwickelte TET-off-Modell den Vorteil, dass die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung möglich ist. Es erlaubt uns jedoch nicht, die Stabilität eines endogene Transkripts direkt zu untersuchen. Um diese Einschränkung so weit wie möglich zu überwinden, wird vorgeschlagen, die 5′ UTR- und 3′ UTR-Sequenzen der Transkription in das Plasmid aufzunehmen, damit das Konstrukt den endogenen Transkripten so ähnlich wie möglich ist. Die Zugabe des V5-Epitops ermöglicht die spezifische Amplifikation der Ziel-mRNA durch RT-qPCR im Vergleich zur endogenen Transkription. Was die Klonstrategie betrifft, so ist die Wahl der sequenzielle Sequenz, die vor dem Gen von Interesse eingefügt wird, entscheidend, um die Amplifikation unspezifischer Signale zu verhindern. Die Zugabe der V5-Epitopsequenz 5′ des ORF ist für die spezifische qPCR-Verstärkung des Konstrukts aufgrund seiner kurzen Länge und des Fehlens seiner Expression in Alveolar-Epithelzellen notwendig. Diese Strategie bietet auch die Möglichkeit, die Modulation der Proteintranslation mit dem gleichen induzierbaren System zu untersuchen. Trotz der geringen Größe des V5-Epitops (42 nt) ist es immer noch möglich, dass dies die Stabilität der Transkription beeinträchtigen kann. Aus diesem Grund wird vorgeschlagen, auch andere Epitope zu testen, wie z. B. das humane Influenza-Hemagglutinin (HA) oder eine andere Sequenz, die nicht im Transkriptom der Alveolar-Epithelzellen gefunden wird.

Eine Einschränkung des Systems ist die Verwendung von Doxycyclin, um die Transkription einer goI zu hemmen. Mehrere Berichte zeigen, dass Doxycyclin einen signifikanten Einfluss auf den Zellstoffwechsel haben könnte. Die Verwendung dieses Antibiotikums in 16HBE14 Bronchialzellen reduziert die Proliferation und erhöht die Sterblichkeit durch Apoptose²⁷. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Doxycyclin bereits an der Modulation der LPS-Entzündungsreaktion beteiligt ist²⁸. Daher könnte dieses Antibiotikum Außerhalb des Ziels Effekte haben, die die mRNA-Stabilität einer bestimmten goI beeinflussen können. Aus diesen Gründen bewerteten wir die Auswirkungen von 1 g/ml Doxycyclin über einen Zeitraum von 24 h auf nicht transfizierte Zellen und stellten fest, dass sie keine Veränderung der endogenen ENaC-mRNA-Expression induzierten (Abbildung 2). Diese Konzentration wurde gewählt, weil sie weit verbreitet ist, um die Transkription des Tet-Off-Systems vollständig zu hemmen und wird empfohlen, zytotoxische Wirkungen zu minimieren²⁹. Wir empfehlen, diese Konzentration in Alveolar-Epithelzellen zu verwenden und empfehlen, die optimale Konzentration für die Untersuchung anderer Gene oder die Verwendung anderer Zelltypen mit dem Tet-Off-System zu validieren.

Unser System nutzt die konstitutive Expression der GOI, bis ihre Transkription durch Doxycyclin gehemmt wird. Es wurde vorgeschlagen, dass übermäßige mRNA-Konzentrationen für die Zelle toxisch sein und ihren Stoffwechsel beeinflussen können. Dies könnte zu einer Änderung der Stabilität des GOI-Transkripts führen, was zu einer schnellen Verschlechterung durch nichtphysiologische Überexpression³⁰führen könnte. Im Fall unseres Tet-Off-Modells wurde eine solche Toxizität nicht beobachtet, da die transfizierten Zellen eine Morphologie zeigten, die der von gesunden nicht transfizierten Zellen ähnelte (Daten nicht dargestellt). In Übereinstimmung mit Tani et al.³¹, der die Gültigkeit des Tet-Off-Systems bei der Bestimmung der Halbwertszeit einer mRNA nachgewiesen hat, zeigten unsere Ergebnisse, dass das Tet-Off-System in alveolarepitheliale Zellen nicht toxisch ist und eine Halbwertszeit für die “ENaC mRNA” ergibt, die nicht die Überstabilisierung widerspiegelt, die in Gegenwart von Transkriptionsinhibitoren wie Actinomycin Dberichtetwurde .

Die Entwicklung dieses Systems zur Messung der Halbwertszeit von mRNA stellt die Ergebnisse in Frage, die beobachtet wurden, wenn die Stabilität von Transkripten in Gegenwart von Transkriptionsinhibitoren wie Actinomycin D gemessen wurde. Diese Methode zeigt, dass eine Transkript-Halbwertszeit viel kürzer sein kann als bisher gemessen.

Unser Modell eignet sich sehr gut für die Untersuchung der posttranskriptionischen Modulation eines bestimmten Transkripts unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich pro-inflammatorische Erkrankungen oder RBP-Überexpression, sowie nach der Behandlung mit Silencing RNA. Darüber hinaus ermöglicht es die Charakterisierung von unübersetzten Regionen, die für die posttranskriptrale Modulation von mRNAs unter pathophysiologischen Bedingungen, die alveolare Epithelzellen beeinflussen, wesentlich sind.

Materials

Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Chloroform – Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast	Leica	–
DNase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068015
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Ethanol – Molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol – Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	I9516
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB Broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, powder	Gibco	61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets	ThermoFisher Scientific	51025413
Mupid-exU electrophoresis system	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
pTet-Off Advanced vector	Takara Bio	631070
pTRE-Tight vector	Takara Bio	631059
Purified alveolar epithelial cells	n.a.	n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	R&D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Approved FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Water, Molecular biology Grade	Wisent Bioproducts	809-115-EL