Das vorliegende Manuskript beschreibt, wie Hippocampus-Arteriolen und Kapillaren aus dem Maushirn isoliert werden können und wie man sie für Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekulare Studien unter Druck setzt.
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Methodenartikel
Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Von subtilen Verhaltensänderungen bis hin zu Demenz im spätstadium entwickelt sich in der Regel eine vaskuläre kognitive Beeinträchtigung nach zerebraler Ischämie. Schlaganfall und Herzstillstand sind bemerkenswert geschlechtsdiamorphe Erkrankungen, und beide induzieren zerebrale Ischämie. Der Fortschritt beim Verständnis der vaskulären kognitiven Beeinträchtigung und der Entwicklung geschlechtsspezifischer Behandlungen wurde jedoch teilweise durch Herausforderungen bei der Untersuchung der Mikrozirkulation des Gehirns aus Mausmodellen in funktionellen Studien begrenzt. Hier stellen wir einen Ansatz zur Untersuchung der Kapillar-Arteriole-Signalisierung in einem ex vivo hippocampalen Kapillar-Parenchymal-Arteriole (HiCaPA)-Präparat vom Maushirn vor. Wir beschreiben, wie man die Mikrozirkulation isoliert, cannulate und unter Druck setzt, um den Arteriolardurchmesser als Reaktion auf die Kapillarstimulation zu messen. Wir zeigen, welche geeigneten funktionellen Kontrollen verwendet werden können, um die Integrität der HiCaPA-Präparation zu validieren und typische Ergebnisse anzuzeigen, einschließlich der Prüfung von Kalium als neurovaskulärem Kopplungsmittel und der Wirkung des kürzlich charakterisierten Inhibitors der Kir2-Inwärtsrektifigungs-Kaliumkanalfamilie ML133. Darüber hinaus vergleichen wir die Reaktionen in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen. Während diese Daten funktionelle Untersuchungen widerspiegeln, kann unser Ansatz auch in molekularbiologischen, Immunchemie- und Elektrophysiologiestudien verwendet werden.
Einleitung
Die piale Zirkulation auf der Oberfläche des Gehirns war Gegenstand vieler Untersuchungen, teilweise wegen seiner experimentellen Zugänglichkeit. Die Topologie der zerebralen Vaskulatur schafft jedoch unterschiedliche Regionen. Im Gegensatz zum robusten pialen Netzwerk reich an Anastomosen mit beträchtlicher Kapazität zur Umleitung des Blutflusses, die intrazerebralen parenchymalen Arteriolen (PAs) bieten eine begrenzte Kollateralversorgung, die jeweils ein diskretes Volumen an Nervengewebe1,2durchdringen. Dies erzeugt einen Engpass-Effekt auf den Blutfluss, die, kombiniert mit einzigartigen physiologischen Me....
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Protokoll
Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, genehmigt und nach den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt.
1. Lösungen
- Verwenden Sie MOPS-gepufferte Saline für die Sezierung und halten Sie Proben bei 4 °C vor ihrer Nutzung. Vergasen Sie die Lösung nicht. Bereiten Sie MOPS gepufferte Saline mit folgender Zusammensetzung vor: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM Glukose, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM Pyruvat, 10 mg/mL Rinderserumalbumin, pH 7,3 bei 4 °C....
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Ergebnisse
Endotheliale Kleinleitfähigkeit (SK) und Zwischenleitfähigkeit (IK) Ca2+-sensitive K+ Kanäle üben einen dilatatorischen Einfluss auf den Durchmesser von PAs aus. Badapplikation von 1 M NS309, einem synthetischen IK- und SK-Kanalagonisten, verursachte eine nahezu maximale Dilatation (Abbildung 2A,B). Kapillaren-Endothelzellen fehlen jedoch keine IK- und SK-Kanäle und haben als Reaktion auf NS30920k.......
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Diskussion
Die unter Druck stehende HiCaPA (hippocampal kapillar-parenchymale Arteriole) Präparation, die in diesem Manuskript beschrieben wird, ist eine Erweiterung unseres etablierten Verfahrens zur Isolierung, Unterdruck bildung und Untersuchung von parenchymalen Arteriolen29. Wir berichteten vor kurzem, dass Kir2.1 Kanäle in Gehirnkapillaren Endothelzellen Wahrnehmen steigt in [K+]o mit neuronaler Aktivierung verbunden, und erzeugen ein aufsteigendes hyperpolarisierendes Signal, das.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken Jules Morin für die aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde durch Auszeichnungen der gemeinnützigen Organisation CADASIL Together We Have Hope, des Center for Women es Health and Research und des NHLBI R01HL136636 (FD) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0.22&Mikro; m Spritzenvorsatzfilter | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Schwarz | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatischer Temperaturregler | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilikatglas Außendurchmesser: 1,2 mm, Innendurchmesser: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 Dihydrat | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissektionsbereich | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — komplette Pumpe mit Antrieb und MS/CA 4-12 Pumpenkopf | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Feine Schere - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline-Warmwasserbereiter | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra&Trade; Miltex&Handel; Gewebezange | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesiumsulfat-Heptahydrat | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl wasserfrei | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Mikromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 Hydrochlorid | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intrazelluläre Mikroinjektions-Dosiersysteme, 2-Kanal | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Druckservoregler mit Schlauchpumpe | Living Systems Instrumentierung | PS-200 | |
| Natriumpyruvat | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Superfeinzange | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Chirurgische Schere - Scharf-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertikaler Mikropipettenabzieher | Narishige | PP-83 |
Referenzen
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
