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Methodenartikel

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

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DOI:

10.3791/60676

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18. Dezember 2019

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences, University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Manuskript beschreibt, wie Hippocampus-Arteriolen und Kapillaren aus dem Maushirn isoliert werden können und wie man sie für Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekulare Studien unter Druck setzt.

Zusammenfassung

Von subtilen Verhaltensänderungen bis hin zu Demenz im spätstadium entwickelt sich in der Regel eine vaskuläre kognitive Beeinträchtigung nach zerebraler Ischämie. Schlaganfall und Herzstillstand sind bemerkenswert geschlechtsdiamorphe Erkrankungen, und beide induzieren zerebrale Ischämie. Der Fortschritt beim Verständnis der vaskulären kognitiven Beeinträchtigung und der Entwicklung geschlechtsspezifischer Behandlungen wurde jedoch teilweise durch Herausforderungen bei der Untersuchung der Mikrozirkulation des Gehirns aus Mausmodellen in funktionellen Studien begrenzt. Hier stellen wir einen Ansatz zur Untersuchung der Kapillar-Arteriole-Signalisierung in einem ex vivo hippocampalen Kapillar-Parenchymal-Arteriole (HiCaPA)-Präparat vom Maushirn vor. Wir beschreiben, wie man die Mikrozirkulation isoliert, cannulate und unter Druck setzt, um den Arteriolardurchmesser als Reaktion auf die Kapillarstimulation zu messen. Wir zeigen, welche geeigneten funktionellen Kontrollen verwendet werden können, um die Integrität der HiCaPA-Präparation zu validieren und typische Ergebnisse anzuzeigen, einschließlich der Prüfung von Kalium als neurovaskulärem Kopplungsmittel und der Wirkung des kürzlich charakterisierten Inhibitors der Kir2-Inwärtsrektifigungs-Kaliumkanalfamilie ML133. Darüber hinaus vergleichen wir die Reaktionen in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen. Während diese Daten funktionelle Untersuchungen widerspiegeln, kann unser Ansatz auch in molekularbiologischen, Immunchemie- und Elektrophysiologiestudien verwendet werden.

Einleitung

Die piale Zirkulation auf der Oberfläche des Gehirns war Gegenstand vieler Untersuchungen, teilweise wegen seiner experimentellen Zugänglichkeit. Die Topologie der zerebralen Vaskulatur schafft jedoch unterschiedliche Regionen. Im Gegensatz zum robusten pialen Netzwerk reich an Anastomosen mit beträchtlicher Kapazität zur Umleitung des Blutflusses, die intrazerebralen parenchymalen Arteriolen (PAs) bieten eine begrenzte Kollateralversorgung, die jeweils ein diskretes Volumen an Nervengewebe1,2durchdringen. Dies erzeugt einen Engpass-Effekt auf den Blutfluss, die, kombiniert mit einzigartigen physiologischen Merkmalen3,4,5,6,7,8, macht intracerebral arterioles eine entscheidende Stelle für zerebrale Durchblutung (CBF) Regulierung9,10. Trotz der technischen Herausforderungen, die mit der Isolierung und Cannulation von PAs verbunden sind, hat das Interesse an ex vivo funktionellen Studien mit Druckgefäßen11,12,13,14,15,16,17zugenommen. Einer der Gründe für dieses erhöhte Interesse ist der beträchtliche Forschungsaufwand an neurovaskulärer Kopplung (NVC), dem Mechanismus zur Erhaltung der funktionellen Hyperämie des Gehirns18.

Regional kann CBF nach lokaler neuronaler Aktivierung schnell ansteigen19. Die zellulären Mechanismen und Signaleigenschaften, die NVC steuern, sind unvollständig verstanden. Wir identifizierten jedoch eine bisher unerwartete Rolle für die Hirnkapillaren während NVC bei der Erfassung der neuronalen Aktivität und der Übersetzung in ein hyperpolarisierendes elektrisches Signal zur Ausgliederung der vorgelagerten Arteriolen20,21,22. Aktionspotentiale23,24 und Öffnung von Großleitfähigkeit Ca2+-aktivierten K+ (BK) Kanälen auf den astrozytischen Endfüßen25,26 erhöhen die interstitielle Kaliumionenkonzentration [K+]o, was zur Aktivierung starker nachinnen gleichrichternder K+ (Kir) Kanäle im vaskulären Endothel von Kapillaren führt. Dieser Kanal wird durch externes K+, aber auch durch Hyperpolarisation selbst aktiviert. Der hyperpolarisierende Strom, der sich durch Spaltknoten ausbreitet, regeneriert sich dann in benachbarten Kapillaren-Endothelzellen bis zur Arteriole, wo er Myozytenentspannung und CBF-Erhöhung20,21verursacht. Die Untersuchung dieses Mechanismus führte uns dazu, ein unter Druck stehendes kapillar-parenchymale Arteriol (CaPA) Präparat zu entwickeln, um den arteriolaren Durchmesser während der Kapillarstimulation mit vasoaktiven Wirkstoffen zu messen. Das CaPA-Präparat besteht aus einem kanülierten intracereralen Arteriolsegment mit einer intakten, nachgeschalteten Kapillarverzweigung. Die Kapillarenden werden durch eine Mikropipette gegen den Kammerglasboden verdichtet, die die gesamte Gefäßbildung verdichtet und stabilisiert20,21.

Wir haben zuvor instrumentale Innovationen durch die Abbildung CaPA-Präpa-Präpa-Präpa-Präpaden aus dem Mauskortex20,21 und Arteriolen aus der Rattenamygdala13 und hippocampus16,17gemacht. Da die Hippocampus-Vaskulatur aufgrund ihrer Anfälligkeit für pathologische Bedingungen mehr Aufmerksamkeit erhält, bieten wir hier eine Schritt-für-Schritt-Methode zur CaPA-Vorbereitung aus dem Maus-Hippocampus (HiCaPA), die nicht nur in funktionellen NVC-Studien, sondern auch in der Molekularbiologie, Immunchemie und Elektrophysiologie eingesetzt werden kann.

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Protokoll

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, genehmigt und nach den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt.

1. Lösungen

  1. Verwenden Sie MOPS-gepufferte Saline für die Sezierung und halten Sie Proben bei 4 °C vor ihrer Nutzung. Vergasen Sie die Lösung nicht. Bereiten Sie MOPS gepufferte Saline mit folgender Zusammensetzung vor: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM Glukose, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM Pyruvat, 10 mg/mL Rinderserumalbumin, pH 7,3 bei 4 °C.
  2. Verwenden Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) als Badlösung und Pipettenlösung. Gas sowohl aCSF und Ca2+-frei aCSF mit 5% CO2, 20% O2, und N2 Balance. Bereiten Sie die Lösung mit der folgenden Zusammensetzung vor: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM Glucose, 2 mM CaCl2, pH 7.3 (mit Belüftung mit 5% CO2, 20% O2und N2 Balance).
  3. Erhalten Sie die maximale Dilatation in nominell Ca2+-frei aCSF (0 mM [Ca2+]o, 5 mM EGTA).

2. Orgelkammervorbereitung

  1. Borosilikatglaskapillaren (Außendurchmesser = 1,2 mm; Innendurchmesser = 0,69 mm; Länge = 10 cm) in einen Glasabzieher einlegen. Ziehen Sie die Kapillare, um eine lange, dünne Spitze an einem Ende zu machen.
  2. Auf einer Seite der Kammer, fügen Sie eine Kanüle, die zu einer Miniatur-Peristaltikpumpe verbinden kann, um das Gefäß luminally unter Druck zu setzen. Unter einem Seziermikroskop die Spitze der Kanüle so brechen, dass sie klein genug ist, um in das Gefäß des Interesses zu passen, aber groß genug, um Lösungen durch die Spitze fließen zu lassen. Stellen Sie sicher, dass die Spitze einen Durchmesser von ca. 10-15 m hat.
  3. Füllen Sie die Kanüle mit einer Spritze mit einem angeschlossenen 0,22 m Filter mit sauerstoffhaltigem aCSF. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen oder Schmutz in der Kanüle befinden.
  4. Fügen Sie auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer zwei weitere Kanülen hinzu. Brechen Sie nicht ihre Spitzen.

3. Hippocampus-Sektion und Isolierung

  1. Eine Maus verleiten und enthaupten. Verwenden Sie für dieses Experiment eine 8 Wochen alte C57BL6/J-Maus, um Unterschiede zwischen Männern und Frauen zu vergleichen. Injizieren Sie die Maus mit Pentobarbital und enthaupten Sie mit chirurgischer Schere.
  2. Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Sezierschere entlang der Mittellinie an der Oberseite ihres Kopfes. Bewegen Sie die Haut an den Seiten.
  3. Beginnend an der kaudalen Seite des Schädels, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie, bis die olfaktorischen Zwiebeln erreicht sind. Entfernen Sie Teile des Schädels, bis das Großhirn freigelegt ist.
  4. Entfernen Sie langsam das Gehirn, beginnend in der Nähe der Nase der Maus. Trennen Sie das Gehirn von den Riechzwiebeln, Denhirnnerven und dem Rückenmark, indem Sie die Strukturen mit der kleinen Sezierschere durchschneiden.
  5. Legen Sie das Gehirn in eine Sezierplatte mit genügend MOPS-Lösung, um es vollständig zu versenken. Platzieren Sie das Gehirn mit einem Seziermikroskop in der Mitte der Sezierplatte mit der ventralen Seite nach unten.
  6. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie das Gehirn in der Hälfte entlang der Längsspalte. Halten Sie die Klinge so, dass die scharfe Kante parallel zur Unterseite der Sezierplatte verläuft. Drücken Sie die Klinge auf einen Schlag durch das Gehirn. Bewegen Sie eine Hemisphäre zur Seite der Platte.
  7. Führen Sie die folgenden Schritte für jede Hemisphäre einzeln oder parallel aus.
    1. Platzieren Sie eine Hemisphäre in der Mitte der Platte, so dass die Mittellinie nach unten gerichtet ist. Dann verwenden Sie die Rasierklinge entlang der Querspalte entlang, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen. Drücken Sie die Klinge gerade durch das Gewebe.
    2. Drehen Sie die Halbkugel so, dass die mediale Seite nach oben gerichtet ist (Abbildung 1A). Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten. Mit einem zweiten Spachtel, legen Sie die Spitze unter dem Corpus callosum und Schaufel darunter, um den Thalamus, Septum, und Hypothalamus zu entfernen, abdeckung der Hippocampus (Abbildung 1B).
    3. Stellen Sie sicher, dass der Hippocampus nun als gekrümmte Struktur in der Nähe der hinteren Seite des Großhirns sichtbar ist. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Großhirn an Ort und Stelle zu halten, verwenden Sie den zweiten Spachtel, um den Hippocampus aus dem Großhirn zu schaufeln (Abbildung 1C).
  8. Übertragen Sie das Hippocampi auf eine neue Sezierplatte, die etwa zur Hälfte mit MOPS-Lösung gefüllt ist. Entsorgen Sie den Rest des Gehirns.

4. Hippocampal Arteriole Isolierung

  1. Führen Sie die folgenden Schritte für jeden Hippocampus aus.
    1. Setzen Sie einen der Hippocampi mit kleinen Stiften an jedem Ende des Abschnitts. Die Hippocampus-Arterie steht nach oben.
    2. Mit sehr scharfen Zangen, sanft dehnen kleine Abschnitte des Hippocampus. Dadurch wird das Gewebe, das die Arteriolen umgibt, gelöst, wodurch es einfacher wird, sie zu sezieren.
    3. Durchsuchen Sie das dorsale Hippocampusgewebe, um die äußere Querarterie zu identifizieren (Abbildung 1C)16,27.
    4. Greifen Sie vorsichtig die äußere Querarterie und ziehen Sie sie langsam aus dem Gewebe, um die Arteriolen und Kapillaren zu sammeln, die den CA3-Bereich des Hippocampus durchdringen.
    5. Sobald es keine Gefäße mehr aus dem Gewebe entfernt werden, entsorgen Sie die Hippocampi. Halten Sie die Gefäße auf Eis in Platten, während nicht in Gebrauch.

5. Hippocampal Kapillare-parenchymale Arteriole-Kannulation

  1. Finden Sie eine Arterie mit einem Ast, der mit Kapillaren endet. Übertragen Sie es in die Orgelkammer. Stellen Sie sicher, dass das Arteriol bei vollständiger Erweiterung ca. 15-30 m beträgt (Abbildung 1D).
  2. Montieren Sie das Blutgefäß vorsichtig, indem Sie die Kanülenspitze durch die Arterienwand unterhalb des Zielbereichs schieben. Schieben Sie das Gefäß vorsichtig auf die Kanüle, bis genügend Gewebe vorhanden ist, um die Krawatte aufzubringen.
  3. Machen Sie einen lockeren Knoten mit 12-0 Nylon Nähte, so dass es über das Blutgefäß und Kanüle passt. Verwenden Sie einen Halben-Hitch-Knoten, um Krawatten zu sichern. Ziehen Sie dann die Enden, um den Knoten zu ziehen und die Arterie an der Kanüle zu sichern. Entfernen Sie alle überflüssigen Gefäßzweige unter der Krawatte, indem Sie sie vorsichtig mit Zangen ziehen.
  4. Machen Sie eine weitere Krawatte und sichern Sie es am anderen Ende der Arterie, um sie zu versiegeln.
  5. Senken Sie die Kanüle mit dem befestigten Gefäß, bis es flach gegen den Deckelrutsch auf der Unterseite der Kammer ist. Achten Sie darauf, die Kanüle nicht zu stark zu senken, oder es wird brechen.
  6. Mit einer Kanüle auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer, senken Sie es, so dass der Punkt davon die Krawatte am Ende der Arterien festsetzt.
  7. Verwenden Sie die dritte Kanüle, um den Kapillarzweig an den Deckelzuschlag festzunageln. Platzieren Sie die Spitze nahe am Ende des Asts, während Sie die Enden der Kapillaren exponiert lassen (nicht unter der Kanüle).

6. Druckmyographie

  1. Bewegen Sie die Kammer mit der Aufnahmesoftware vom Sezierbereich auf das Mikroskop.
  2. Schließen Sie den Zu- und Abflussschlauch zur Durchblutung an die Kammer an. Beginnen Sie die Perfusion mit erhitztem aCSF (37 °C) bei einer Durchflussrate von 4 ml/min.
  3. Befestigen Sie die Druckkanüle an einer peristaltischen Pumpe gepaart mit einem Druckaufnehmer und bringen Sie den Innendruck auf 20 mm Hg.
  4. Starten Sie die Aufnahmesoftware. Passen Sie die Einstellungen für das Mikroskop und die Bildgebung an, um ein möglichst klares Bild zu erhalten. Beginnen Sie die Aufzeichnung, sobald die Einstellungen für die Erkennungssoftware optimiert sind.
  5. Erhöhen Sie den Druck des Behälters auf bis zu 40 mm Hg, während Sie den Arteriendurchmesser mit einer Kantenerkennungssoftware aufzeichnen.
  6. Lassen Sie die MOPS-Lösung mit einem CSF aus der Kammer waschen und lassen Sie die HiCaPA-Zubereitung ausgleichen und myogenen Ton entwickeln.
  7. Um die Lebensfähigkeit eines Behälters zu testen, wenden Sie 1 M NS309-Lösung auf die Badperfusion an (siehe Abbildung 2A,B und Abschnitt Repräsentative Ergebnisse). Das arteriolar Segment muss sich erweitern und zeigt etwa 30-40% myogenen Ton, wie zuvor beschrieben3,14,20.

7. Fokale Stimulation von Kapillarenden

  1. Sobald der Ausgangston für die Artezolalermittelte festgelegt und die Endothelfunktion bewertet wurde, testen Sie das Ansprechen der Kapillarstimulation.
  2. Mit einem Glasabzieher, machen Kanülen, so dass es einen feinen Punkt an einem Ende. Brechen Sie die Spitze aus einer Kanüle, so dass das getestete Medikament durch die Spitze reibungslos bei 5 psi fließen kann.
  3. Füllen Sie die Kanüle mit der Wirkstofflösung von Interesse und fügen Sie sie zu einem 3-Achsen-Mikromanipulator am Mikroskop befestigt. Schließen Sie die Schläuche vom Druckauswurfsystem an die Kanüle an.
  4. Senken Sie langsam die Kanüle in das Bad in der Nähe der Kapillaren, achten Sie darauf, keinen Teil des Gefäßes oder Hardware in der Kammer zu treffen. Manövrieren Sie die Spitze der Kanüle neben den Enden der Kapillaren, ohne sie zu berühren. Halten Sie die Spitze der Kanüle direkt neben dem Deckelschlupf, um zu verhindern, dass das Gefäß stimuliert wird, wenn die Kanüle austritt.
  5. Wenn Sie bereit sind, die Kapillaren zu stimulieren, senken Sie die Kanüle auf den Deckelrutsch und direkt neben den Kapillaren. Aktivieren Sie das Druckauswurfsystem mit der gewünschten Auswurfzeit (hier 20 s). Sobald die Stimulation abgeschlossen ist, heben Sie die Kanüle leicht an, um eine weitere Stimulation zu vermeiden.
  6. Wiederholen Sie die Stimulation bei Bedarf. Ändern Sie die Kanüle des Druckauswurfsystems, um verschiedene Wirkstoffverbindungen zu testen.
  7. Um zu bestätigen, dass nur die Kapillaren stimuliert werden, füllen Sie die Kanüle mit 1 M NS309 Lösung und wiederholen Sie die oben genannten Schritte.
    HINWEIS: Kapillaren-Endothelzellen drücken keine K+ Kanäle aus, die durch NS309 aktiviert werden, so dass die Arteriole nicht auf die Stimulation reagieren darf. Wenn sich die Arteriole datiert, muss die Kanüle neu positioniert werden, oder der Durchmesser der Bohrung muss kleiner sein (siehe Abbildung 2A,B und abschnitt repräsentative Ergebnisse).

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Ergebnisse

Endotheliale Kleinleitfähigkeit (SK) und Zwischenleitfähigkeit (IK) Ca2+-sensitive K+ Kanäle üben einen dilatatorischen Einfluss auf den Durchmesser von PAs aus. Badapplikation von 1 M NS309, einem synthetischen IK- und SK-Kanalagonisten, verursachte eine nahezu maximale Dilatation (Abbildung 2A,B). Kapillaren-Endothelzellen fehlen jedoch keine IK- und SK-Kanäle und haben als Reaktion auf NS30920k...

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Diskussion

Die unter Druck stehende HiCaPA (hippocampal kapillar-parenchymale Arteriole) Präparation, die in diesem Manuskript beschrieben wird, ist eine Erweiterung unseres etablierten Verfahrens zur Isolierung, Unterdruck bildung und Untersuchung von parenchymalen Arteriolen29. Wir berichteten vor kurzem, dass Kir2.1 Kanäle in Gehirnkapillaren Endothelzellen Wahrnehmen steigt in [K+]o mit neuronaler Aktivierung verbunden, und erzeugen ein aufsteigendes hyperpolarisierendes Signal, das...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Jules Morin für die aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde durch Auszeichnungen der gemeinnützigen Organisation CADASIL Together We Have Hope, des Center for Women es Health and Research und des NHLBI R01HL136636 (FD) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.22&Mikro; m SpritzenvorsatzfilterCELLTREAT Scientific Products229751
12-0 Nylon (12cm) SchwarzMicrosurgery Instruments, IncS12-0 NYLON
Automatischer TemperaturreglerWarner InstrumentsTC-324B
Borosilikatglas Außendurchmesser: 1,2 mm, Innendurchmesser: 0,68 mmSutter InstrumentsB120-69-10
RinderserumalbuminSigma-AldrichA7030
CaCl2 DihydratSigma-AldrichC3881
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG5767
DissektionsbereichOlympusSZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — komplette Pumpe mit Antrieb und MS/CA 4-12 PumpenkopfIsmatecISM 1090
EGTASigma-AldrichE4378
Feine Schere - SharpFine Science Tools14063-09
Inline-WarmwasserbereiterWarner InstrumentsSH-27B
Integra&Trade; Miltex&Handel; GewebezangeFisher Scientific12-460-117
KClSigma-AldrichP9333
KH2PO4Sigma-AldrichP5379
Magnesiumsulfat-HeptahydratSigma-AldrichM1880
MgCl wasserfreiSigma-AldrichM8266
MikromanipulatorNarishigeMN-153
ML 133 HydrochloridTocris4549
MOPSSigma-AldrichM1254
NaClSigma-AldrichS9625
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS8875
NS309Tocris3895
Picospritzer III - Intrazelluläre Mikroinjektions-Dosiersysteme, 2-KanalParker Hannifin052-0500-900
Druckservoregler mit SchlauchpumpeLiving Systems InstrumentierungPS-200
NatriumpyruvatSigma-AldrichP3662
SuperfeinzangeFine Science Tools11252-20
Chirurgische Schere - Scharf-BluntFine Science Tools14001-13
Vertikaler MikropipettenabzieherNarishigePP-83

Referenzen

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