In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.
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Methodenartikel
Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.
Einleitung
Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.
In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nierenkapsel, Milz, intramuskuläre Region, subkutaner Raum, Knochenmark und Omentalbeutel für experimentelle IsletTransplantation5,6,7untersucht. Einige der oben genannten Seiten wurden in klinischen Einstellungen getestet8. Obwohl die Letentransplantation in die Leber die am weitesten verbreitete Methode in der klinischen Anwendung derzeit9bleibt, gibt es mehrere wichtige Probleme bei der Verwendung dieser Website zu beheben. Zum Beispiel, wie man den frühen Verlust der transplantierten Inselchen durch die sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) und schlechte Sauerstoffversorgung10,11 und wie man die Insel transplantiert, wenn nötig, zu reduzieren, weil sie diffus in der Leber lokalisieren. Die Nierenkapsel kann ein idealer Ort für Nagetier-Empfänger sein. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender allogener Inselchen beim Menschen, obwohl sie aufgrund der hochgereinigten Poreninselpräparate, die klinisch verwendet werden, besser für die Inselxenotransplantation geeignet seinkann. Daher ist die Suche nach einem geeigneteren Standort für die Letentransplantation im Gange.
Der subkutane Raum kann aufgrund seiner Zugänglichkeit als klinisch anwendbarer Standort für die Letentransplantation genutzt werden. Allerdings ist die Effizienz der Inseltransplantation in den subkutanen Raum extrem gering, so dass eine relativ große Anzahl von Inselchen erforderlich ist, um Hyperglykämie umzukehren13. Kürzlich fand ein japanisches Forscherteam die ISWAT, eine neuartige subkutane Stelle, die für die Letentransplantation in einem murinen Modell im Vergleich zur Leber14überlegen ist. Die ISWAT enthält die epigastrische Arterie und Vene, so dass die reiche Blutversorgung kann Islet Transplantat Revaskularisation gewährleisten. In diesem Manuskript schlagen wir eine einfache Implantationsmethode mit einem Kellermembran-Matrix-Hydrogel vor, um syngene murinische Inselchen im ISWAT zu fixieren. Dieses Protokoll erweist sich als wirksam für die Letentransplantation.
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Protokoll
Alle Verfahren in diesem Protokoll folgten den Grundsätzen des Tierschutzes der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital. Islet-Transplantat-Empfänger und Spender waren 8- bis 10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse, die vom Medical Animal Center der Provinz Guangdong gekauft wurden. Das Verfahren der Ernte, Isolierung, Kultur oder Verabreichung der geernteten Zellen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
1. Inselvorbereitung
- Bereiten Sie eine Kollagenase Typ V Arbeitslösung vor. Kollagennase Typ V wiegen und mit d-Hank-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen, mit einer spritzengetriebenen Filtereinheit von 0,22 m und einer 60 ml Spritze filtern und in Eis vorkühlen. Für jeden Spender ist ein Volumen von 5 ml erforderlich.
- Eine 10 Wochen alte C57BL/6-Maus (23 x 2 g) durch Zervixdislokation einschläfern und den äußeren Teil der Maus mit 75% Ethanol für einige Sekunden besprühen. In der Zwischenzeit eine 5 ml Spritze mit Kollagenaselösung füllen und die Spritzennadel mit einer biegsamen stumpfspitzen Perfusionsnadel (32 G) wechseln.
- Setzen Sie die Spendermaus in die Rückenlage auf einen Eisbeutel unter dem Sezieren, schneiden Sie eine Queröffnung mit geraden, gerichteten Augenscheren in die Haut des Schambereichs und schneiden Sie die Haut vollständig in Richtung des Kopfes. Dann den Bauch über einen V-Schnitt aus der Schamregion zum xiphoiden Prozess komplett öffnen.
- Setzen Sie die Gallenblase und die gesamte Länge des gemeinsamen Gallengangs durch Neupositionierung der Leber aus. Dann die Zwölffingerdarmöffnung des gemeinsamen Gallengangs mit einer Gefäßklemme einklemmen und eine kleine Öffnung in der Gallenblase schneiden.
HINWEIS: Optimale Nadelplatzierung ist wichtig, um Rückfluss in die Leber und Gallenblase zu verhindern. - Den gemeinsamen Gallengang aus der Gallenblasenöffnung mit der Perfusionsnadel in Schritt 1.2 zu keimen, dann 2 ml Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse injizieren. Danach trennen Sie die durchnässte Bauchspeicheldrüse mit zwei Paaren nichtinvasiver Mikropinezer von Darm, Magen und Milz und legen Sie sie in eine 50 ml kegelförmige Röhre auf Eis.
HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang für alle Spendermäuse. Drei aufeinander folgende durchlässige Bauchspeicheldrüsen (nicht mehr als 40 min voneinander entfernt) können zu einem 50 ml konischen Rohr kombiniert werden, das mit 3 ml Kollagennaselösung für jede Bauchspeicheldrüse vorgefüllt wird. - Fügen Sie 100 l DNase I (10 mg/ml) pro Bauchspeicheldrüse in die 50 ml konischen Röhren und verdauen Sie die Bauchspeicheldrüse in einem Wasserbad bei 37 °C, indem Sie die konischen Röhren 3–5 min schütteln.
HINWEIS: Schütteln Sie die Schläuche in 10 s Intervallen kräftig 40x, um das Gewebe vor der Verdauung im Wasserbad zu trennen, und schütteln Sie die Schläuche dann während der Verdauung mäßig. - Stop-Lösung (2,5 mg/ml BSA-HBSS-Lösung) bis zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen, um die Verdauung zu blockieren, und Pulszentrifugieren Sie die Rohre auf eine Geschwindigkeit von 750 x g bei 4 °C und stoppen Sie schnell.
- Den Überstand abgießen und die Pellets 2x waschen, indem man in 15–25 ml BSA-HBSS sanft wieder aufhält. Pulszentrifugieren Sie das Rohr mit den gleichen Geschwindigkeitsbedingungen wie in Schritt 1.7 für 1 min beschrieben.
- Gießen Sie den Überstand ab und bündeln Sie die Pellets der drei konischen Rohre in ein 50 ml konisches Rohr. Setzen Sie die Pellets in einem Gesamtvolumen von 10 ml Histopaque-1119 wieder aus. Homogen mischen und sequenziell 5 ml Histopaque-1077 und 5 ml HBSS durch langsames Pipetieren entlang der Seite des Rohres hinzufügen.
- Drehen Sie die Proben in der Zentrifuge bei 750 x g bei 4 °C 10 min ohne Bremsen.
- Die Inselchen von der HBSS/histopaque-1077-Schnittstelle in ein 50 ml konisches Rohr mit einer Einweg-5-ml-Pasteur-Pipette aspirieren, BSA-HBSS zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen und Pulszentrifuge bei 750 x g bei 4 °C.
- Den Überstand abgießen und die Inselchen mit 30 ml BSA-HBSS waschen. Zentrifuge für 1 min bei 750 x g bei 4 °C.
- Die Inselchen mit 30 ml Kulturmedium (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) pro Rohr aussetzen und in eine lichtdichte Kulturschale mit 10 cm Durchmesser gießen. Unter einem Stereomikroskop, mit 200 L Gel-Laden Pipetspitzen, handpicken Sie die Inselchen aus der Lösung auf der Grundlage ihrer Morphologie (d. h. sphäroidal, weiß). In ein unbehandeltes Zellkulturgericht mit 10 ml Kulturmedium.
HINWEIS: Eine Sekundenhandpicking kann durchgeführt werden, wenn die Reinheit der erstgereinigten Inselchen nach der ersten Kommissionierung nicht optimal ist. - Überprüfen Sie die Reinheit der handverlesenen Inseln durch Dithionfärbung unter einem Lichtmikroskop und erkennen Sie die Lebensfähigkeit von Inseln durch Fluorescein-Diacetat (FDA)-Propidiumiodid (PI) Färbung unter einem Fluoreszenzmikroskop.
- Kultur die isolierten Inselchen im Kulturmedium (wie in Schritt 1.13) in einem Inkubator bei 37 °C, 95% Luft-5%CO2 vor der Transplantation.
2. ISWAT-Islet-Transplantation
- Induzieren Sie Diabetes bei den 8 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen (22 x 2 g) durch eine einmalige Injektion von Streptozotocin (STZ). Am Tag -4 die Mäuse für 4–6 h schnell und bereiten Sie dann eine 2% STZ-Lösung mit 0,1 M Citratpuffer (pH 4,4) vor. Wiegen, im Puffer wieder aussetzen und die Mäuse intraperitoneal in einer Dosis von 180 mg/kg injizieren.
HINWEIS: Die STZ-Lösung muss vor dem Gebrauch frisch zubereitet und aufgrund ihrer Lichtempfindlichkeit mit Aluminiumfolie überzogen werden. Es sollte sofort verwendet werden, da es aktivität innerhalb von 15-20 min verliert. - Punktieren Sie die kaudalen Venen der STZ-injizierten Mäuse, um etwas Blut um etwa 10 Uhr tag-1 und Tag 0 zu sammeln und den nicht fastenden Blutzuckerspiegel mit einem Teststreifen und einem grundlegenden Blutzuckermessgerät zu messen. Die Mäuse werden als Empfänger der Letzentransplantation verwendet, wenn der Blutzuckerspiegel der beiden aufeinanderfolgenden Testtage beides mindestens 20 mmol/L beträgt.
- Wiegen und markieren Sie am 0. Tag alle Empfängermäuse. Anästhetisieren Sie jeden Empfänger durch Injektion von 60 mg/kg Pentobarbital-Natrium intraperitoneal.
HINWEIS: Verabreichen Sie eine Zehenprise, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen. Wenn die Empfängermaus keinen Entzugsreflex hat, reicht das Niveau der Anästhesie für eine Operation aus. Ist dies nicht der Fall, verabreichen Sie zusätzlich 10 mg/kg Pentobarbital-Natrium. Das verwendete Pentobarbital-Natrium wurde in steriler physiologischer Saline in der Konzentration von 2% (m/v) verdünnt. - Nehmen Sie das Hydrogel aus einem -20 °C Gefrierschrank und halten Sie es auf Eis, um das Auftauen zu ermöglichen. Das Hydrogel ist bei 4–10 °C flüssig und erstarrt bei einer höheren Temperatur.
- Wählen Sie für jeden Empfänger 450–500 Islet-Äquivalente (IEQ) in ein steriles 1,5 ml Zentrifugenrohr unter dem Stereomikroskop (wie in Schritt 1.13) mit 200 L Kulturmedium und halten Sie auf Eis, bis es für die Transplantation bereit ist.
- Wischen Sie den linken Leistenbereich des Empfängers mit 75% Ethanol ab. Legen Sie es in die Supine-Position und fixieren Sie die vier Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband. Rasieren Sie die Haare um die chirurgische Stelle mit elektrischen Clippern ab und wischen Sie den Bereich mit Iodophor ab.
- Machen Sie einen vertikalen Hautschnitt in diesem Bereich mit der Ophthalmschere und nichtinvasiven Mikropinezer, identifizieren Sie die minderwertige epigastrische Arterie und Vene im ISWAT und erstellen Sie eine kleine Tasche über den Gefäßen.
- Drehen Sie das Inselrohr für 30 s bei 200 x g und entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich. 20 L vollständig aufgetautes Hydrogel ansaugen und mit den Inselchen in das Rohr laden. Setzen Sie die Inselchen vorsichtig aus, um Blasen zu vermeiden.
- Liefern Sie das gesamte Islet-Hydrogel-Gemisch im Rohr mit einer 200-L-Pipettenspitze in die Tasche (Schritt 2.7) des Empfängers.
HINWEIS: Bei diesem Prozess sind zwei Techniker erforderlich, einer zum Aufheben der Ränder der Tasche mit nichtinvasiven Mikrowirbelzern und der andere für die Lieferung der Isletmischung in die Tasche. - Fügen Sie 20 l Cephalosporin (ca. 5–10 mg) in die Transplantationsstelle ein, nachdem das Insel-Hydrogel-Gemisch vollständig erstarrt ist, und verwenden Sie dann eine 5-0 chirurgische Naht, um den Muskel und die Haut mit der kontinuierlichen Nahtmethode zu schließen.
HINWEIS: Das Hydrogel benötigt ca. 3 min, um sich aufgrund der Körpertemperatur zu erstarren. - Legen Sie den Empfänger in einen sauberen Käfig und halten Sie sich mit einem Thermopad warm. Halten Sie die Überwachung aufrecht, bis sich der Empfänger vollständig erholt und beginnt, sich autonom zu bewegen. Dann verabreichen 0,03 mg/ml Buprenorphin mit steriler physiologischer Salzmittel intraperitoneal, nach 0,1 mg/kg Dosis.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.11 für jede Empfängermaus.
- Messen Sie den nicht fastenden Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse (wie in Schritt 2.2) 3–4x pro Woche für den ersten Monat und 1x pro Woche danach.
- Am Ende der Nachbeobachtung (100 Tage nach der Transplantation) wird unter Anästhesie (durchgeführt wie in Schritt 2.3) die ISWAT, die das Transplantat von den Empfängern trägt, nach den in Schritt 2.6 beschriebenen sterilen Schritten verbrauchen. Fixieren Sie das Gewebe in Formalin und Paraformaldehyd gemäß den histologischen Protokollen für Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung und Immunfluoreszenz von Insulin und Glucagon.
- Cephalosporin hinzufügen und den Schnitt der Empfänger wie in Schritt 2.10 schließen, dann wie in Schritt 2.11 auf die Genesung vorbereiten.
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Ergebnisse
In diesem Protokoll werden zwei Verfahren eingeführt: die Präparation von murinen Inselen und die Inseltransplantation in den ISWAT-Standort. Im ersten Verfahren, nach durchdringenden und verdauenmit Mit Typ V Kollagenase-Lösung, Reinigung mit Histopaque-1119 und Histopaque-1077 und einem zusätzlichen Hand-Picking-Schritt, werden die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation sein (wie in Abbildung 1gezeigt ) und die isolierten Inselchen, die eine hohe Lebensfähigkeit...
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Diskussion
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfristiges Ü...
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Offenlegungen
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,22 μm m spritzenbetriebene Filtereinheit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1,5 mL Zentrifugenröhrchen | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur-Pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL Spritze | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL konisches Röhrchen | Corning | 430829 | |
| 5-0 chirurgisches Nahtmaterial | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL Spritze | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Verdünnung (1:200) |
| Anti-Maus Glucagon Antikörper | Abcam | ab10988 | Verdünnung (1:100) |
| Anti-Maus Insulin Antikörper | Zelle Signaling Technology | 3014s | Verdünnung (1:100) |
| stumpf-spitze Perfusionsnadel | Oloey, China | 005 | 32G, gelb |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL / 6 Mäuse | Medical Animal Center der Provinz | 8 ~ 10 Wochen | |
| Zellkulturschale | BIOFIL, China | TCD000100 | Allgemein, unbehandelt, 87,8 mm Durchmesser |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| Cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| Kollagenase Typ V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's Puffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| Dithizon | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin-Färbemedium | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| Fluoresceindiacetat (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica | DMIL | |
| Pipettenspitzen zum Gelladen | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| Hämatoxylin-Färbemedien | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basalmembran-Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| lichtdichte Kulturschale | DVS, China | AN-5058548 | selbstgebaut, Glasschale mit schwarzer Farbe besprüht |
| Medizinisches Klebeband | Cofoe, China | K12001 | |
| nicht-invasive Mikropinzette | RWD Life Science | F11033-11 und F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic Blutzuckermesssystem | Johnson & Ltd. Johnson | 33391713 | |
| Augenschere | RWD Life Science | S12012-12 und S11001-08 | |
| P/S (Penicillin / Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Pentobarbital-Natrium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidiumiodid | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (Streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Teststreifen | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-konjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Verdünnung (1:200) |
| Gefäßklemme | RWD Life Science | R31006-04 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
