In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.
Einleitung
Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.
In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nie....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Verfahren in diesem Protokoll folgten den Grundsätzen des Tierschutzes der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital. Islet-Transplantat-Empfänger und Spender waren 8- bis 10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse, die vom Medical Animal Center der Provinz Guangdong gekauft wurden. Das Verfahren der Ernte, Isolierung, Kultur oder Verabreichung der geernteten Zellen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
1. Inselvorbereitung
- Bereiten Sie eine Kollagenase Typ V Arbeitslösung vor. Kollagennase Typ V wiegen und mit d-Hank-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen, mit einer spritzenge....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In diesem Protokoll werden zwei Verfahren eingeführt: die Präparation von murinen Inselen und die Inseltransplantation in den ISWAT-Standort. Im ersten Verfahren, nach durchdringenden und verdauenmit Mit Typ V Kollagenase-Lösung, Reinigung mit Histopaque-1119 und Histopaque-1077 und einem zusätzlichen Hand-Picking-Schritt, werden die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation sein (wie in Abbildung 1gezeigt ) und die isolierten Inselchen, die eine hohe Lebensfähigkeit.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfristiges Ü.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,22 μm m spritzenbetriebene Filtereinheit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1,5 mL Zentrifugenröhrchen | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur-Pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL Spritze | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL konisches Röhrchen | Corning | 430829 | |
| 5-0 chirurgisches Nahtmaterial | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL Spritze | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Verdünnung (1:200) |
| Anti-Maus Glucagon Antikörper | Abcam | ab10988 | Verdünnung (1:100) |
| Anti-Maus Insulin Antikörper | Zelle Signaling Technology | 3014s | Verdünnung (1:100) |
| stumpf-spitze Perfusionsnadel | Oloey, China | 005 | 32G, gelb |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL / 6 Mäuse | Medical Animal Center der Provinz | 8 ~ 10 Wochen | |
| Zellkulturschale | BIOFIL, China | TCD000100 | Allgemein, unbehandelt, 87,8 mm Durchmesser |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| Cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| Kollagenase Typ V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's Puffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| Dithizon | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin-Färbemedium | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| Fluoresceindiacetat (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica | DMIL | |
| Pipettenspitzen zum Gelladen | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| Hämatoxylin-Färbemedien | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basalmembran-Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| lichtdichte Kulturschale | DVS, China | AN-5058548 | selbstgebaut, Glasschale mit schwarzer Farbe besprüht |
| Medizinisches Klebeband | Cofoe, China | K12001 | |
| nicht-invasive Mikropinzette | RWD Life Science | F11033-11 und F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic Blutzuckermesssystem | Johnson & Ltd. Johnson | 33391713 | |
| Augenschere | RWD Life Science | S12012-12 und S11001-08 | |
| P/S (Penicillin / Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Pentobarbital-Natrium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidiumiodid | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (Streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Teststreifen | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-konjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Verdünnung (1:200) |
| Gefäßklemme | RWD Life Science | R31006-04 |
Referenzen
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
