3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

Federica Marasca; Alice Cortesi; Lara Manganaro; Beatrice Bodega

doi:10.3791/60712

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Methodenartikel

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

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DOI:

10.3791/60712

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25. Januar 2020

Federica Marasca¹ , Alice Cortesi¹ , Lara Manganaro¹ , Beatrice Bodega¹

¹Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", INGM

In diesem Artikel

Zusammenfassung

3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.

Zusammenfassung

Eine wichtige Frage in der Zellbiologie ist die genomische Organisation im Kernraum und wie die Chromatinarchitektur Prozesse wie Genexpression, Zellidentität und Differenzierung beeinflussen kann. Viele Ansätze, die zur Untersuchung der 3D-Architektur des Genoms entwickelt wurden, lassen sich in zwei sich ergänzende Kategorien unterteilen: Chromosomen-Konformationserfassungs-basierte Technologien (C-Technologien) und Bildgebung. Während ersteres auf der Erfassung der Chromosomenkonformation und proximalen DNA-Wechselwirkungen in einer Population fester Zellen basiert, ermöglicht letztere, basierend auf DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) auf 3D-konservierten Kernen, eine zeitgemäße Visualisierung mehrere Loci auf einer einzelzelligen Ebene (mehrfarbig), die ihre Wechselwirkungen und Dieverteilung innerhalb des Zellkerns untersuchen (3D-Mehrfarben-DNA-FISCH). Die Technik der 3D-Mehrfarben-DNA FISH hat eine Einschränkung der Visualisierung nur ein paar vorbestimmte loci, nicht erlaubt eine umfassende Analyse der nuklearen Architektur. Angesichts der Robustheit der Ergebnisse ist 3D-Mehrfarben-DNA-FISH in Kombination mit 3D-Mikroskopie und Bildrekonstruktion jedoch eine mögliche Methode, um C-Technologie-basierte Ergebnisse zu validieren und die Position und Organisation spezifischer Loci eindeutig zu untersuchen. auf einer Einzelzellebene. Hier schlagen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode der 3D-Mehrfarben-DNA-FISH vor, die für eine Vielzahl menschlicher Primärzellen geeignet ist, und diskutieren alle praktischen Maßnahmen, entscheidenden Schritte, Vorstellungen von 3D-Bildgebung und Datenanalyse, die erforderlich sind, um eine erfolgreiche und informative 3D-Multicolor-Funktion zu erhalten. DNA FISH in verschiedenen biologischen Kontexten.

Einleitung

Höhere Eukaryoten müssen systematisch eine riesige Menge an genetischen Informationen im winzigen 3D-Raum des Kerns¹^,²^,³^,⁴kondensieren und verdichten. Heute wissen wir, dass das Genom räumlich in Kompartimenten und topologisch assoziierten Domänen⁵ angeordnet ist und dass die verschiedenen Ebenen der DNA-Faltung Kontakte zwischen verschiedenen genomischen Regionen erzeugen, die Chromatin-Schleifenbildung⁶^,⁷beinhalten können. Die 3D-dynamische Schleife von Chro....