Method Article

Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie

DOI:

10.3791/60744

⸱

February 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In mehreren transgenen Zebrafischmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC) kann Hepatomegalie in frühen Larvenstadien beobachtet werden. Die Quantifizierung der Larvenlebergröße in Zebrafisch-HCC-Modellen bietet eine Möglichkeit, die Auswirkungen von Medikamenten und anderen Manipulationen auf einen Onkogen-bezogenen Phänotyp schnell zu bewerten. Hier zeigen wir, wie man Zebrafischlarven fixiert, das Gewebe, das die Leber umgibt, seziert, Lebern mittels Hellfeldmikroskopie fotografiert, leberfarbene Flächen misst und Ergebnisse analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, präzise Quantifizierung der Lebergröße. Da diese Methode die Messung des Leberbereichs beinhaltet, kann es Unterschiede im Lebervolumen unterschätzen, und ergänzende Methoden sind erforderlich, um zwischen Veränderungen der Zellgröße und Veränderungen der Zellzahl zu unterscheiden. Die hier beschriebene Dissektionstechnik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um Leber, Darm und Bauchspeicheldrüse in ihren natürlichen Positionen für unzählige nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und In-situ-Hybridisierung, zu visualisieren. Die beschriebene Strategie zur Quantifizierung der Larvenlebergröße ist auf viele Aspekte der Leberentwicklung und -regeneration anwendbar.

Introduction

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Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist die häufigste primäre Malignität der Leber1 und die dritthäufigste Ursache der krebsbedingten Mortalität2. Um Mechanismen der Hepatokarzinogenese besser zu verstehen und mögliche HCC-Therapeutika zu identifizieren, haben wir und andere transgene Zebrafische entwickelt, bei denen hepatozytenspezifische Expression von Onkogenen wie z.B. '-Catenin3,4, Kras(V12)5,6, Myc7oder Yap18 zu HCC bei erwachsenen Tieren führt. Bei diesen Zebrafischen wird die Lebervergrößerung bereits 6 Tage nach der Befruchtung (dpf) festgestellt, was eine einfache Plattform für die Erprobung der Auswirkungen von Medikamenten und genetischen Veränderungen auf das Onkogen-getriebene Leberüberwuchern bietet. Genaue und genaue Messung der Larvenlebergröße ist wichtig für die Bestimmung der Auswirkungen dieser Manipulationen.

Lebergröße und -form können halbquantitativ bei festen Zebrafischlarven mit CY3-SA-Kennzeichnung9 oder bei lebenden Zebrafischlarven mit hepatozytenspezifischen Fluoreszenzreportern und Fluoreszenzsezierender Mikroskopie5,6bewertet werden. Die letztgenannte Methode ist relativ schnell, und ihre mangelnde Präzision kann durch fotografieren und messen die Fläche jeder Leber mit Bildverarbeitungssoftware7,10behandelt werden. Es kann jedoch technisch schwierig sein, alle lebenden Larven in einem Experiment einheitlich zu positionieren, so dass der zweidimensionale Leberbereich eine genaue Darstellung der Lebergröße darstellt. Eine ähnliche Technik zur Quantifizierung der Lebergröße beinhaltet die Verwendung von Lichtblattfluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Larvenlebervolumens8, was genauer sein kann, um Größenunterschiede zu erkennen, wenn die Leber in verschiedenen Dimensionen ungleichmäßig erweitert wird. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann verwendet werden, um die Anzahl der fluoreszierend gekennzeichneten Hepatozyten und andere Leberzelltypen in Larvenlebern8,11zu zählen. Bei dieser Methode werden Larvenleber gepoolt und dissoziiert, so dass Informationen über die größe und Form der einzelnen Leber verloren gehen. In Kombination mit einer anderen Methode zur Bestimmung der Lebergröße ermöglicht FACS die Unterscheidung zwischen erhöhter Zellzahl (Hyperplasie) und erhöhter Zellgröße (Hypertrophie). Alle diese Methoden verwenden teure Fluoreszenztechnologie (Mikroskop oder Zellsortierer) und erfordern, mit Ausnahme der CY3-SA-Kennzeichnung, die Kennzeichnung von Hepatozyten mit einem fluoreszierenden Reporter.

Hier beschreiben wir detailliert eine Methode zur Quantifizierung von Zebrafisch-Larvenleber-Bereich mit Hellfeldmikroskopie und Bildverarbeitungssoftware3,12,13,14. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Quantifizierung des Bereichs der einzelnen Lebern in situ ohne den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie. Bei der Analyse der Lebergröße blenden wir die Bildidentität, um die Voreingenommenheit der Ermittler zu reduzieren und die wissenschaftliche Strenge zu verbessern15.

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Protocol

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Tierversuche werden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt wurden.

1. Arven fixieren

  1. Nach 3–7 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Larven mit Tricain-Methansulfonat einschläfern (0,03%) und sammeln Bis zu 15 Larven in einem 2 ml Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe.
  2. Larven zweimal mit 1 ml Kalt (4 °C) 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) auf Eis waschen. Für jede Wäsche so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe entfernen und dann 1 ml kalte SPBS in das Rohr geben.
  3. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe, und fügen Sie 1 ml kalt (4 °C) 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzu.
    VORSICHT: PFA ist reizend und vermutet krebserregend. Handschuhe sollten beim Umgang mit PFA getragen werden, und konzentrierte Lösungen sollten in einer chemischen Rauchhaube behandelt werden.
  4. Bei 4 °C mindestens über Nacht (aber bis zu mehreren Monaten) mit sanftem Schaukeln inkubieren.

2. Sezieren von Geweben umgebender Leber

  1. Larven aus PFA entfernen, indem man 3x mit 1 ml kalt (4 °C) PBS spülen und 5 min zwischen den Spülungen schaukeln.
    HINWEIS: Es ist in Ordnung, die vorgespülten Larven in PBS für ein oder zwei Tage bei 4 °C zu halten.
  2. Mehrere Larven in PBS in einen Brunnen einer 9-Well-Rundbodenglasschale geben.
  3. Entfernen Sie die Haut, die die Leber umgibt.
    1. Verwenden Sie feine Zange, um Larven auf dem Rücken zu halten (Bauch nach oben), greifen auf beiden Seiten des Kopfes so sanft wie möglich. Dann verwenden Sie sehr feine Zange in der anderen Hand, um die Haut nur über dem Herzen zu greifen.
    2. Ziehen Sie die Haut diagonal zum Schwanz des Fisches und zum Boden der Schale auf der linken oder rechten Seite des Fisches. Wiederholen Sie dies für die andere Seite (rechte oder linke Seite).
    3. Greifen Sie weiter Klappen der Haut und ziehen Sie nach unten / zurück, bis die gesamte Haut und Melanophoren über oder in der Nähe der Leber entfernt wurden.
  4. Entfernen Sie Dasgelb, falls vorhanden.
    1. Für 5-6 dpf Larven, heben Sie Dasgelb in einem Stück, indem Sie den Fisch mit feinen Zangen auf dem Rücken und mit den sehr feinen Zangen, um das Eigelb sanft zu prod.
    2. Für 3-4 dpf Larven, kratzen Sie das Eigelb in Stücke. Halten Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken und verwenden Sie die sehr feine Zange, um das Eigelb zu streicheln, beginnend von der ventralen Seite.
  5. Mit einer Glaspipette und Einer Pipettenpumpe sezierte Larven in frische kalte PBS geben.

3. Imaging

  1. Um Larven zu montieren, gießen Sie ein paar ml 3% Methylcellulose auf den Deckel einer sauberen Kunststoff-Petrischale.
  2. Verwenden Sie eine Glaspipette und Pipettenpumpe, um Larven in die Methylcellulose einzutragen und so wenig PBS wie möglich mit den Larven hinzuzufügen.
  3. Unter einem Sezieren Mikroskop bei geringer Vergrößerung, verwenden Sie feine Zange, um die Fische so zu orientieren, dass sie auf ihrer rechten Seite liegen, nach links.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Fische perfekt auf ihrer Seite ausgerichtet sind oder die Lebermessungen möglicherweise nicht genau sind.
  4. Nehmen Sie ein Foto von jedem Fisch.
    1. Bestätigen Sie, dass der zu fotografierende Fisch perfekt ausgerichtet ist, wobei ein Auge direkt auf dem anderen Auge ist. Verwenden Sie bei Bedarf feine Zangen, um leicht auf Kopf oder Schwanz von Fischen zu tippen, um die Ausrichtung anzupassen. Wenn der Schwanz des Fisches gebogen ist, entfernen Sie den Schwanz, indem Sie ihn mit Kräftigen zangen, um ihn zu entfernen, so dass der Fisch flach liegt.
    2. Zoomen Sie auf eine hohe Vergrößerung und konzentrieren Sie sich auf die Leber, um sicherzustellen, dass die Kontur der Leber deutlich sichtbar ist.
    3. Fangen Sie ein Bild, und speichern Sie die Datei.
    4. Wiederholen Sie dies für alle Fische, um sicherzustellen, dass die Vergrößerung für jedes Bild gleich ist.
    5. Nehmen Sie ein Bild eines Mikrometers mit der gleichen Vergrößerung auf (siehe Abbildung 2H).

4. Bildanalyse

  1. Messen Sie die Fläche der Leber jedes Fisches mit Bildverarbeitungssoftware.
    1. Blind alle Leberbilder, um potenzielle Ermittler Voreingenommenheit zu vermeiden und fördern wissenschaftliche Strenge15. Dieser Schritt kann manuell von einem anderen Lab-Mitglied oder mit einem Computerprogramm (Ergänzendes Material) durchgeführt werden. Benennen Sie Dateien nach dem Zufallsprinzip um und erstellen Sie eine "Randomisierungsdatei", die eine Liste der ursprünglichen Dateinamen und der entsprechenden geblendeten Dateinamen enthält.
    2. Öffnen Sie randomisierte Dateien in der Reihenfolge, beginnend mit Datei 1.
    3. Wählen Sie das Freihandauswahl-Tool und skizzieren Sie jede Leber.
    4. Drücken Sie Strg-M, um den Bereich jeder Leber zu messen.
    5. Für alle Lebern, die nicht genau gemessen werden können, legen Sie eine Platzhaltermessung ein (sehr klein oder sehr groß, so dass sie später leicht ausgeschlossen werden kann).
    6. Speichern Sie die Messungen in einer Textdatei ("Messdatei").
  2. Blinden- und Analysedaten
    1. Öffnen Sie "Messdatei" und "Randomisierungsdatei" in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Fügen Sie eine neue Spalte in die "Messdatei" ein und fügen Sie die ursprünglichen Dateinamen für die geblendeten Dateien mithilfe der "Randomisierungsdatei" hinzu. Speichern Sie diese Datei als "Unblinded measurements file".
    3. Sortieren Sie Daten nach dem ursprünglichen Dateinamen.
    4. Achten Sie darauf, alle Lebermessungen auszuschließen, für die Bilder unzureichend waren (siehe Abbildung 2A–G).
    5. Konvertieren Sie ggf. Messwerte in die gewünschte Skala (z. B. mm2).
      1. Öffnen Sie die Maßstabsleiste in der Bildverarbeitungssoftware.
      2. Verwenden Sie das gerade Werkzeug, um 1 mm auf der Waage zu messen. Die Bildverarbeitungssoftware misst in den gleichen Einheiten wie die Leber (Pixel), was einen Umrechnungsfaktor ergibt.
      3. Verwenden Sie den Umrechnungsfaktor, um Messungen in der Datei "Unblinded measurements" zu konvertieren.
    6. Mit dem Tabellenkalkulationsprogramm oder Einfügen von Daten in eine wissenschaftliche Graphik- und Statistiksoftware bestimmen Sie Mittelwert und Standardabweichung und berechnen p-Wert(e).

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Results

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Transgene Zebrafische, die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes -Catenin (Tg(fabp10a:pt---cat) Zebrafisch)3 und nicht-transgene Kontrollgeschwister exzensieren, wurden mit 6 dpf eingeschläfert und der Leberbereich wurde mit Hilfe von Brightfield-Mikroskopie- und Bildverarbeitungssoftware quantifiziert. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße (0,0006 cm2) im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern (0,0004 cm2, p < 0,0001;

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Discussion

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Quantifizierung der Lebergröße ist entscheidend in Studien zum Verständnis der Leberentwicklung, Regeneration, und Onkogenese. Das hier beschriebene Protokoll ist eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Technik zur Quantifizierung der Lebergröße bei Larvenzebrafischen. Die angemessene Vorsicht bei der Durchführung bestimmter Aspekte des Protokolls kann zu einer höheren Genauigkeit der Ergebnisse und einer verminderten Frustration führen.

Die richtige Fixierung der Larven ist entsche...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten Maurine Hobbs und die Centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) an der University of Utah für die Bereitstellung von Zebrafischhaltung, Laborraum und Ausrüstung zur Durchführung von Teilen dieser Forschung danken. Die Erweiterung des CZAR wird zum Teil durch den NIH-Zuschuss Nr. 1G20OD018369-01 unterstützt. Wir möchten auch Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum und dem Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility für die Pflege von Zebrafischen danken. Wir danken Kenneth Kompass für die Unterstützung bei der R-Programmierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien der Huntsman Cancer Foundation (in Verbindung mit dem Stipendium P30 CA042014 an das Huntsman Cancer Institute) (KJE) und NIH/NCI R01CA222570 (KJE) finanziert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kamera für PräpariermikroskopLeica, z.B
. Fine (Dumont #5) PinzetteFine Science Tools11254-20
GlaspipettenVWR14672-608
BildanalysesoftwareImage J/FIJIImageJ/FIJI kann kostenlos heruntergeladen werden: https://imagej.net/Welcome
MethylcelluloseSigmaM0387
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Phosphatgepufferte KochsalzlösungVerschiedene Anbieter
PipettenpumpeVWR53502-233
Petrischalen aus KunststoffUSA Scientific Inc2906
Pyrex 9-Well-Glasschale mit rundem BodenVWR89090-482
Software zum Verblindenvon Dateien R projectR kann kostenlos heruntergeladen werden: https://www.r-project.org/
Wissenschaftliche Grafik- und StatistiksoftwareGraphPad Prism
TabellenkalkulationsprogrammMicrosoft Excel
Tricain-Methansulfonat (Tricain-S)Western Chemical200-226
Sehr feine (Dumont #55) PinzetteFine Science Tools11255-20
. Präpariermikroskop Leica, z.B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

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