Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie

Summary

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung des Ethanolgehalts in einem Zebrafisch-Embryo mithilfe der Kopfraumgaschromatographie von geeigneten Expositionsmethoden für die Embryoverarbeitung und Ethanolanalyse.

Abstract

Fetale Alkoholspektrumsstörungen (FASD) beschreiben ein hochvariables Kontinuum von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern, einschließlich Gesichtsdysmorphologien und neurologischen Beeinträchtigungen. Bei einer komplexen Pathologie betrifft FASD etwa 1 von 100 Kindern, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten geboren werden. Aufgrund der sehr variablen Natur von FASD haben sich Tiermodelle in unserem aktuellen mechanistischen Verständnis von ethanolinduzierten Entwicklungsfehlern als kritisch erwiesen. Immer mehr Laboratorien konzentrieren sich auf die Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten, genetisch befruchtbaren, durchscheinenden Embryonen. Dies ermöglicht es Forschern, Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition in mehreren genetischen Kontexten präzise zu steuern und die Auswirkungen der embryonalen Ethanol-Exposition durch Live-Bildgebungstechniken zu quantifizieren. Zusammen mit dem hohen Grad an Erhaltung sowohl der Genetik als auch der Entwicklung beim Menschen hat sich der Zebrafisch als ein starkes Modell erwiesen, um die mechanistische Grundlage der Ethanol-Teratogenität zu untersuchen. Die Ethanolexpositionsschemas unterscheiden sich jedoch zwischen verschiedenen Zebrafischstudien, was die Interpretation von Zebrafischdaten in diesen Studien verwirrt hat. Hier ist ein Protokoll zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen mittels Kopfraumgaschromatographie.

Introduction

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschreibt eine breite Palette von neurologischen Beeinträchtigungen und craniofacial Dysmorphologien im Zusammenhang mit embryonalen Ethanol-Exposition¹. Mehrere Faktoren, einschließlich Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition und genetischen Hintergrund, tragen zur Variation von FASD^2,3. Beim Menschen macht die komplexe Beziehung dieser Variablen das Studium und Verständnis der Ätiologie der FASD schwierig. Tiermodelle haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlage der Ethanol-Teratogenit....

Protocol

Alle zebrafischen Embryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden nach den etablierten IACUC-Protokollen²⁷aufgezogen und gezüchtet. Diese Protokolle wurden von der University of Texas at Austin und der University of Louisville genehmigt.

HINWEIS: Die Zebrafischlinie Tg (fli1:EGFP)^y1 wurde in dieser Studie verwendet²⁸. Bei allem Wasser, das in diesem Verfahren verwendet wird, ist steriles Umkehrosmosewasser. Alle statistischen Analysen wurden mit Graphpad Prism v8.2.1 durchgeführt.

1. Herstellung von Embryomedien

1. Um einen 20....

Results

Der Ethanolgehalt im Blut kann bei frühen embryonalen Zebrafischen nicht bestimmt werden, da es an einem voll ausgebildeten Kreislaufsystem fehlt. Um die Ethanolkonzentration in den Zebrafischembryonen zu bestimmen, werden die Ethanolwerte direkt aus homogenisiertem embryonalem Gewebe gemessen. Um die embryonalen Ethanolkonzentrationen richtig messen zu können, muss das embryonale Volumen berücksichtigt werden. Der Embryo (Dotter befestigt) sitzt in der Chorion (Eierschale) umgeben von extraembryonaler Flüssigkeit (

Discussion

Als Entwicklungsmodellsystem sind Zebrafische ideal geeignet, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Entwicklung zu untersuchen. Sie produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, was präzise Timing- und Dosierungsparadigmen in Ethanolstudien ermöglicht. Zusammen mit den Live-Bildgebungsfunktionen und der genetischen und Entwicklungserhaltung mit Menschen machen Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellsystem für teratologische Studien. Described ist ein Protokoll zur Messung embryonaler Etha.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luft			Im Auftrag der Universität zur Verfügung gestellt
Analysenwaage	VWR	10204-962
AutoSampler, CP-8400	Varian		Gaschromatograph Autosampler
Calciumchlorid	VWR	97062-590
Ethanol	Decon Labs	2701
Gaschromatographen-Fläschchen mit Polytetrafluorethylen/Silikon-Septum und Kunststoffkappe 2 mL	Agilent	8010-0198	Kann die Fläschchen nach der Reinigung wiederverwenden, jedoch nicht die Kappen/Septen
Gaschromatograph, CP-3800	Varian
Helium			Im Auftrag der Universität
HP Innowax Kapillarsäule	Agilent	19095N-123I	30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m Film dickes
Hyrdogen			Im Auftrag der Universität zur Verfügung gestellt
Magnesiumsulfat (Heptahydrat)	Fisher Scientific	M63-500
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL	Fisher Scientific	2682002
Mikropipettenspitzen 10 μ L	Fisher Scientific	13611106
Mikropipettenspitzen 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Mikropipettenspitzen 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
Petrischalen 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Mikropipette	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Mikropipette	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Mikropipette	Gilson	FA10001M
Polytetrafluorethylen/Silikon-Septum und Kunststoffkappe	Agilent	5190-7021	Ersatzkappen/Septen für Gaschromatographenfläschchen
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P217-500
Kaliumphosphat (dibasisch)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Siliziumdioxidperlen .5 mm	Biospec Products	11079105z
Siliziumdioxidperlen 1,0 mm	Biospec Products	11079110z
Natriumbicarbonat	VWR	BDH9280-500G
Natriumchlorid	Fisher Scientific	S271-500
Natriumphosphat (zweibasisch)	Fisher Scientific	S374-500
Festphasen-Mikroextraktionsfaserbaugruppe Carboxen/Polydimethylsiloxan	Millipore Sigma	57343-U	Ersatzfasern
Star Chromatography Workstation	Varian		Chromatographie-Software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septen	Millipore Sigma	23154	Ersatz-Einlasssepten