Methodenartikel

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

DOI:

10.3791/60784

⸱

25. Januar 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Verhalten von Einzelmolekülen unter mechanischer Störung wurde weithin charakterisiert, um viele biologische Prozesse zu verstehen. Methoden wie die Atomkraftmikroskopie haben jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung, während Förster Resonanzenergieübertragung (FRET) nur die Ableitung von Konformationen zulässt. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle unter verschiedenen Strömungsbedingungen. Unser Protokoll beschreibt die Schritte zur Erfassung von konformen Veränderungen einzelner Biomoleküle in verschiedenen Scherflussumgebungen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Scherstrom wird in mikrofluidischen Kanälen erzeugt und über eine Spritzenpumpe gesteuert. Als Demonstrationen der Methode werden von Willebrand-Faktor (VWF) und Lambda-DNA mit Biotin und Fluorophor gekennzeichnet und dann auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Ihre Konformationen werden unter variablem Scherstrom kontinuierlich mit Derinkintheitierreflexion (TIRF) und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Die reversible Entwirrungsdynamik von VWF ist nützlich, um zu verstehen, wie seine Funktion im menschlichen Blut reguliert wird, während die Konformation der Lambda-DNA Einblicke in die Biophysik von Makromolekülen bietet. Das Protokoll kann auch weit verbreitet werden, um das Verhalten von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen.

Einleitung

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Mechanismen, wie Biomoleküle auf Umweltreize reagieren, wurden umfassend untersucht. Insbesondere in einer Strömungsumgebung regulieren Scher- und Dehnungskräfte die Konformationsveränderungen und potenziell die Funktion von Biomolekülen. Typische Beispiele sind das scherinduzierte Entwirren der Lambda-DNA und der von Willebrand-Faktor (VWF). Lambda DNA wurde als Werkzeug verwendet, um die konforme Dynamik einzelner, flexibler Polymerketten und die Rheologie von Polymerlösungen1,2,3,4zu verstehen. VWF ist ein natürlicher Strömungssensor, der Blutplättchen an Wundstellen von Blutgefäßen mit abnormalen Scherraten und Strömungsmustern aggregiert. Die Auflösung von VWF ist für die Aktivierung der Bindung von Thrombozyten an die A1-Domäne und der Kollagenbindung an den A3-Bereich unerlässlich. Darüber hinaus ermöglicht die hochscherinduzierte A2-Domänenentfaltung die Spaltung von VWF, das seine Molekulargewichtsverteilung im Umlaufreguliert 5,6. Die direkte Visualisierung des Verhaltens dieser Moleküle unter fließendem Fluss kann unser grundlegendes Verständnis ihrer Biomechanik und Funktion erheblich verbessern, was wiederum neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen ermöglichen kann.

Typische Methoden zur Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationen sind optische/magnetische Pinzette, Atomkraftmikroskopie (AFM) und einmolekulare Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)7. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Kraft und Bewegung zu untersuchen, die mit den konformen Veränderungen von Biomolekülen verbunden sind. Es fehlt jedoch die Fähigkeit, allgemeine molekulare Konformationen8abzubilden. AFM ist in der Lage, Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung, ist aber in der zeitlichen Auflösung9,10begrenzt. Darüber hinaus kann der Kontakt zwischen der Spitze und der Probe die durch den Durchfluss induzierte Reaktion verwirren. Andere Methoden wie FRET und Nanopore Analytics bestimmen die Faltung und Entfaltung von Einzelmolekülproteinen auf der Grundlage des Nachweises von intramolekularer Entfernung und ausgeschlossenen Volumina. Diese Methoden stecken jedoch noch in den Kinderschuhen und sind in ihrer direkten Beobachtung der Einzelmolekül-Konformationen11,12,13,14begrenzt.

Andererseits hat die direkte Beobachtung von Makromolekülen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung unter Fluoreszenzmikroskopie unser Verständnis der Einzelmoleküldynamik in vielen biologischen Prozessenverbessert 15,16. So haben Fu et al. kürzlich erstmals eine gleichzeitige Visualisierung der VWF-Dehnung und der Thrombozytenrezeptorbindung erreicht. In ihrer Arbeit wurden VWF-Moleküle auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals durch Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen immobilisiert und unter totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) in unterschiedlichen Scherflussumgebungen abgebildet17. Mit einer ähnlichen Methode wie Fu zeigen wir hier, dass Konformationen von VWF- und Lambda-DNA sowohl unter TIRF- als auch in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie direkt beobachtet werden können. Wie in Abbildung 1dargestellt, werden mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um den Scherfluss zu erzeugen und zu steuern, und Biomoleküle werden auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Bei Anwendung unterschiedlicher Scherraten werden Konformationen desselben Moleküls aufgezeichnet, um die Verlängerungslänge zu messen, siehe auch abbildung 1. Die Methode könnte weit verbreitet angewendet werden, um andere Polymerverhalten unter komplexen Strömungsumgebungen sowohl für rheologische als auch für biologische Studien zu untersuchen.

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Protokoll

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1. Vorbereitung von VWF

  1. Rekonstituieren Sie menschliches Plasma VWF, um es für die Etikettierungsreaktionen vorzubereiten. Fügen Sie 100 l deionisiertes (DI) Wasser zu 100 g lyophilisiertem VWF hinzu, um eine VWF-Lagerlösung mit 1 mg/ml zu erstellen.
  2. Dialyze VWF-Lagerlösung, um überschüssiges Glycin zu entfernen und damit die Biotin- und Fluorophor-Etikettierungseffizienz zu erhöhen.
    1. Übertragen Sie 50 l VWF-Lagerlösung in eine 0,1 ml Dialyseeinheit mit einem 10.000 Molekulargewichtsabschaltung und Abdichtung mit Kappe. Bewahren Sie die Reststofflösung bei -20 °C auf. Die VWF-Aktie bleibt bis zu einem Jahr bei -20 °C stabil.
    2. Dialyse in 500 ml 1x steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) (0,01 M Dinatriumphosphat, 0,0018 Monokaliumphosphat, 0,0027 M Kaliumchlorid, 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4 bei 25 °C) bei 1 h bei 4 °C mit langsamem Rühren laufen lassen. Wiederholen Sie die Dialyse für eine zusätzliche Stunde mit 500 ml frischem PBS.
  3. Beginnen Sie mit der Biotin-Etikettierungsreaktion. Bereiten Sie eine 2 mMLösung von NHS-PEG 4-Biotin vor, indem Sie den Feststoff in DI-Wasser unmittelbar vor der Reaktion auflösen. Wenn NHS-PEG 4-Biotin längere Zeit im Wasser bleiben kann, wird die NHS-Ester-Gruppe hydrolysieren, wodurch die Etikettiereffizienz verringert wird.
    1. Fügen Sie der Dialyseeinheit, die die VWF-Lagerlösung enthält, 2,5 l von 2 mM NHS-PEG4-Biotin hinzu. Dies führt zu einem 20-fachen Molarenüberschuss an Biotin im Vergleich zu VWF-Monomeren. Primäre Afine von VWF reagieren mit den NHS-Ester-Gruppen undbinden damit über Amid-Verbindungen kovalent an PEG 4-Biotin-Gruppen.
    2. Legen Sie die Dialyseeinheit in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Versiegeln Sie die Dialyseeinheit mit der entsprechenden Kappe. Sichern Sie die Rohrdialyse-Baugruppe mit Parafilm. Aufrecht halten und bei Raumtemperatur 40 min lassen.
  4. Starten Sie die Fluorophor-Etikettierungsreaktion. Bereiten Sie eine 2,8 mM Lösung von Alexa 488 Tetrafluorphenyl-Ester (TFP-Ester) Fluoreszenzfarbstoff (Erregungmax = 498 nm, Emissionmax = 519 nm) durch Auflösung des Fluorophorfestes in DI-Wasser vor. Tun Sie dies unmittelbar vor der Reaktion, um zu verhindern, dass die TFP-Ester-Gruppe hydrolysiert.
    1. Fügen Sie der Dialyseeinheit 2,9 l des 2,8 mM 488 Fluorophors hinzu. Dies wird zu einem 34-fachen molaren Überschuss an Fluorophor im Vergleich zu VWF-Monomeren führen. Verbleibende primäre Afine von VWF werden mit den TFP-Ester-Gruppen reagieren und damit kovalent über Amid-Verbindungen an Fluorophore binden.
    2. Die Dialyseeinheit wird mit 2,0 l von 1 M Natriumbicarbonat (in DI-Wasser gelöst) hinzugefügt. Dadurch wird der pH-Wert der Reaktion näher an 8,0 angepasst, was die Effizienz der TFP-Ester- und primären Aminreaktion erhöht.
    3. Sichern Sie die Dialyseeinheit in einem Mikrozentrifugenrohr wie in Schritt 1.3.2. Im Dunkeln aufbewahren, um Photobleichungen zu verhindern und bei Raumtemperatur für 1 h und 30 min aufbewahren.
  5. Die Dialyseeinheit in 900 ml 1x steriles PBS und Dialyse über Nacht bei 4 °C aufstellen. Dies ergibt etwa 70 l gekennzeichneten VWF bei einer Konzentration von 0,71 mg/ml bzw. 2,84 m (Monomerkonzentration).
  6. Übertragen Sie beschriftete VWF in ein Mikrozentrifugenrohr. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und schützen Sie vor Licht. Bei 4 °C lagern. Zur Langzeitlagerung antimikrobielles Mittel Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w/v) hinzufügen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Vorbereitung der Lambda-DNA

  1. Biotinylat lineare Lambda-DNA, indem seine kohäsiven Endstandorte (cos sites) mit Biotin-14-dCTP-Nukleotiden nach Standardprotokollen gefüllt werden, die hier in Schritt 2.118wiederholt werden. Füllen Sie die restlichen cos-Sites mit dATP-, dTTP- und dGTP-Nukleotiden aus.
    1. 1 mM Lösungen von dATP, dTTP, dGTP und biotin-14-dCTP in einem 10x Reaktionspuffer (500 mM Natriumchlorid, 100 mM Trishydrochlorid, 100 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol, pH 7,9 bei 25 °C) vorbereiten.
    2. Legen Sie 48 l 500 ng/l Lambda-DNA in ein PCR-Röhrchen und erhitzen Sie 5 min bei 65 °C. Die cos-Standorte der kreisförmigen Lambda-DNA trennen sich unter Hitze, linearisieren das Molekül und machen einsträngige Überhänge bereit für die Biotinylierung. Unmittelbar danach auf Eis legen, um zu verhindern, dass cos-Sites wieder glühen.
    3. Fügen Sie der Lambda-DNA 5 l von 1 mM dATP, dTTP und dGTP und 4 l mit 1 mM Biotin-14-dCTP hinzu. Fügen Sie auch 2,5 l von 5 U/ L Klenow Fragment (3''5' exo-) hinzu, um die DNA-Synthese zu katalysieren.
    4. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch für 1 h bei 37 °C.
    5. Fügen Sie 1,2 l von 0,5 M EDTA hinzu. Dann erhitzen Sie das Reaktionsgemisch 5 min bei 70 °C. Dadurch werden die Klenow-Fragment- und Biotinylierungsreaktion deaktiviert.
  2. Entfernen Sie überschüssige Nukleotide aus Lambda-DNA mit einer Spin-Säule, die 10-70 l aufnehmen kann und eine Cut-off-Datei von 6.000 Molekulargewichthatungen hat.
    1. Platzieren Sie die Säule in einem 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Säule und das Rohr bei 1000 x g für 2 min. Entsorgen Sie den Durchfluss, der sich im Rohr sammelt.
    2. Ersetzen Sie den Spaltenpuffer durch eine 1x-Lösung desselben Reaktionspuffers aus Schritt 2.1.1. Fügen Sie der Spalte dazu 500 L 1x Puffer hinzu. Zentrifuge für 1 min bei 1000 x g. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diese 2 weiteren Male, so dass der Spalte insgesamt 1500 l hinzugefügt wurden.
    3. Legen Sie die Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie die Lösung aus Schritt 2.1.5 vorsichtig der obersten Ebene der Spalte hinzu. Zentrifuge für 4 min bei 1000 x g.
    4. Sammeln Sie den Durchfluss (40-70 l) aus dem Mikrozentrifugenrohr und legen Sie sie in ein PCR-Rohr. Diese enthält die gereinigte, biotinylierte Lambda-DNA.
  3. Label Lambda DNA mit fluoreszierendem YOYO-1 Farbstoff (Erregungmax = 490 nm, Emissionmax = 509 nm) nach Standardprotokollen, hier in Schritt 2.3.120wiederholt.
    1. Bereiten Sie eine Lösung aus YOYO-1 Farbstoff und Lambda-DNA mit einem Farbstoff zu Basis paar Molar Verhältnis von 1:10. Angenommen, im Reinigungsschritt ging keine DNA verloren, um die Konzentration der Lambda-DNA des Basispaares zu berechnen. Lambda DNA in voller Länge hat 48.502 Basenpaare.
      HINWEIS: Wenn z. B. 50 l lösungsmenge aus Schritt 2.2.4 wiederhergestellt wurden, fügen Sie 7,4 l mit 500 -M YOYO-1 Farbstoff hinzu.
    2. Erhitzen Sie die Lösung für 2 h bei 50 °C im Dunkeln, um die Reaktion zu vervollständigen.
    3. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und schützen Sie vor Licht. Bei 4 °C lagern. Die Lösung kann nun in mikrofluidische Geräte injiziert werden.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Erstellen von mikrofluidischen Kanalformen in Siliziumwafern

  1. Verwenden Sie die Photolithographie, um mikrofluidische Kanäle mit entsprechenden Abmessungen (Abbildung 2) auf einem Master-Siliziumwafer nach Standardprotokollen19zu erstellen.

4. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidische Vorrichtung

  1. Fügen Sie 5 Teile Silikon-Elastomer-Basis zu 1 Teil-Härtungsmittel (nach Masse) in einem Wägeboot. Rühren Sie den Inhalt gründlich für 1 min, um vorgehärtete PDMS-Lösung zu erstellen.
  2. Legen Sie den Master-Silizium-Wafer in eine Kunststoff-Petrischale. Gießen Sie die PDMS-Lösung über den Wafer, um eine 5-mm-Schicht zu erstellen. Bedecken Sie die Schale und lassen Sie in einem Trockentrockner unter Vakuum für 1 h Luftblasen zu entfernen.
  3. Bedeckte Petrischale bei 60 °C über Nacht inkubieren, um PDMS in einen flexiblen Feststoff auszuhärten. Die Aushärtung führt dazu, dass an der PDMS-Wafer-Schnittstelle mikrofluidische Kanäle in das PDMS eingegossen werden.
  4. Schneiden Sie 20 x 10 mm Rechtecke mit einem Rasiermesser in das PDMS um jeden mikrofluidischen Kanal. Entfernen Sie die rechteckigen PDMS-Blöcke mit einer Pinzette.
  5. Verwenden Sie eine 25 G stumpfe Endnadel mit geschärften Kanten, um ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 mm an einem Ende des Kanals zu stanzen, um sicherzustellen, dass das Loch vollständig durch den PDMS-Block verläuft (Abbildung 2). Verwenden Sie eine dünne Nadel, um PDMS aus Loch auszustechen. Wiederholen Sie dies am anderen Ende des Kanals. Dadurch wird ein Ein- und Auslass für den Durchfluss durch den Kanal erstellt.
  6. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS-Blocks mit Vinyl-Reinraumband. Druckstickstoffgas über einen Deckel der Nr. 1 1/2, 22 x 50 mm blasen, um Schmutz zu entfernen.
  7. Legen Sie den PDMS-Block mit der Kanalseite nach oben und den Deckelrutsch in die Kammer einer Plasma-Bindungsmaschine. Beginnen Sie die Behandlung.
  8. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, legen Sie den PDMS-Block schnell auf einen Deckel, so dass der Kanal mit dem Schlupf in Berührung kommt. Wenden Sie Druck entlang der Kanten des Blocks an. Legen Sie die Coverslip-PDMS-Baugruppe 15 min bei 115 °C auf eine Kochplatte, um die Dauerbindung zu verstärken.
  9. Legen Sie 10 cm lange, 0,25 mm Innendurchmesser Rohre in das Auslassloch an der Oberseite des PDMS-Blocks ein. Dadurch kann Flüssigkeit leicht aus dem Kanal fließen. Das Gerät ist nun fertig.

5. Behandlung der Oberfläche von mikrofluidischen Geräten

  1. Injizieren Sie in sterile 1x PBS gelöste Injizung von 10 g/ml biotinylatiertem Rinderserumalbumin (BSA-Biotin) in den Einlass von mikrofluidischen Geräten für VWF-Experimente. Injizieren Sie <10 l von 1 mg/ml BSA-Biotin für Lambda-DNA-Experimente. Halten Sie nach der Injektion ein paar Mikroliter BSA-Biotin in der Pipettenspitze zurück und lassen Sie die Spitze in den Einlass einbetten.
    1. Halten Sie immer ein Tröpfchen DI-Wasser um die Spitze. Dadurch wird verhindert, dass Luftblasen in den Kanal gelangen. Wenden Sie diese Technik jedes Mal an, wenn eine neue Lösung in den Kanal injiziert wird.
    2. BSA-Biotin 2 h im Gerät brüten lassen. Die BSA bindet nicht spezifisch an die Deckbedeckungsoberfläche (Abbildung 3A).
  2. Entfernen Sie die Pipettespitze. In jilt;10 l Casein-Blockierlösung in den Kanal einspritzen und 30 min inkubieren lassen. Das Großstein wird alle freien Standorte blockieren und die unspezifische Bindung von Biomolekülen an die Oberfläche reduzieren (Abbildung 3B).
  3. Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie <10 l von 10 g/ml Streptavidin, gelöst in sterilem 1x PBS, in den Kanal für VWF-Experimente. Verwenden Sie 100 g/ml Streptavidin für Lambda-DNA-Experimente. 10 min inkubieren. Das Streptavidin bindet an die Biotingruppen des BSA-Biotins (Abbildung 3C).
  4. Entfernen Sie die Spitze und injizieren <10 l 1x Waschmittellösung (0,05% Tween 20 in PBS) in den Kanal, um überschüssiges Streptavidin wegzuwaschen.
  5. Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie <10 l von entweder 28,4 nM VWF verdünnt in Casein-Lösung oder Lambda-DNA aus Schritt 2.3.3. Inkubieren SIE VWF für 3 min. Inkubieren Lambda DNA für 45 min (Abbildung 3D).
  6. Entfernen Sie die Spitze und injizieren <10 l von 5 mM freies Biotin in Casein-Lösung verdünnt. Freies Biotin blockiert überschüssige Streptavidin-Bindungsstellen auf Kanaloberfläche (Abbildung 3E).

6. Visualisierung der VWF- und Lambda-DNA unter Fluoreszenzmikroskopie

  1. Bereiten Sie 1 ml Casein-Blockierlösung mit 2,2 mM Protokateatchusäure und 37 nM Protocatechuat-3,4-Dioxygenase vor (zur Minimierung der Photobleichung). In eine Spritze geben und in einer Spritzenpumpe sichern. Nehmen Sie 30 cm lange, 0,25 mm Innendurchmesser Schläuche und befestigen Sie ein Ende an der Spritzennadel. Durchfluss in der Lösung, um Luftblasen zu entfernen. Befestigen Sie das andere Ende des Rohres am Einlass des mikrofluidischen Geräts. Es wird empfohlen, dies 3 Minuten nach Schritt 5.6 zu tun.
  2. Wählen Sie das höchste Vergrößerungsobjektiv (d. h. 60-100X) einer gesamten inneren Reflexion (TIRF) oder eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops aus. Fügen Sie bei Bedarf einen Tropfen Tauchöl auf sein Ziel. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf die Mikroskopstufe, so dass der Deckelschlupf bündig mit dem Objektiv ist.
  3. Starten Sie die Hellfeldmikroskopie. Passen Sie den Fokus so an, dass alle Features, wie Schmutz und Blasen, sichtbar sind. Passen Sie dann die Bühne in X- und Y-Richtung an, bis der Rand des mikrofluidischen Kanals sichtbar ist und den Rahmen zerschneidet.
  4. Wechseln Sie zum 488-Kanal (FITC). Passen Sie den Z-Level- und TIRF-Winkel nach Bedarf an, bis einzelne grüne, kugelförmige Moleküle unterschieden werden können. Dabei handelt es sich entweder um VWF- oder Lambda-DNA-Moleküle.
  5. Passen Sie Belichtungszeit und Laserintensität an, um fluoreszierende Moleküle zu visualisieren, ohne sie zu schnell zu photobleicht zu machen. Stellen Sie den Kontrast ein, um Moleküle auch klarer zu visualisieren.
  6. Startfluss von der Spritzenpumpe, so dass die Casein-Blockierlösung in den Kanal und aus dem Auslass fließt. Tun Sie dies genau 5 Minuten nach Schritt 5.6. Stoppen und starten Sie den Fluss, um die Veränderungen in der Konformation von Molekülen zu beobachten. Bei der Anwendung des Durchflusses werden Die Raten zwischen 5.000 und 30.000 l/h verwendet. Wiederholen Sie dies in verschiedenen Bereichen des mikrofluidischen Geräts. Setzen Sie diesen Prozess fort, um Moleküle zu lokalisieren, die sich auf mehrere Zyklen des Anhaltens und Startens des Flusses ausdehnen und entspannen können.
  7. Beachten Sie, wie lange es dauert, bis Moleküle die maximale Ausdehnung erreichen und sich vollständig in Globuli entspannen. Nehmen Sie Videos über das kontinuierliche Verhalten von Molekülen unter Scherfluss auf und wählen Sie die beste Belichtungszeit, Belichtungshäufigkeit und Videodauer aus, die den gesamten Bereich des Erweiterungsverhaltens erfassen und Photobleichungen minimieren.
  8. Speichern Sie die Videos als . AVI-Dateien mit einer Maßstabsleiste.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

7. Bildanalyse von Konformationsänderungen

  1. Berechnen Sie diefigure-protocol-1Wandscherrate ( ), die auf Makromoleküle angewendet wird, mit der Durchflussrate (Q) und der Höhe (h) und der Breite (w) des rechteckigen mikrofluidischen Kanals. Verwenden Sie dazu die folgende Gleichung:
    figure-protocol-2
  2. Bestimmen Sie die Länge eines Biomoleküls unter verschiedenen Scherraten mit einem angepassten MATLAB-Code (siehe Ergänzende Dateien). Erstellen Sie einen Ordner mit dem Titel Videos Analyse, die die folgenden MATLAB-Codes enthält: main.m, save_each_frame.m, get_length.m und get_length.fig. Erstellen Sie einen Unterordner in der Videoanalyse mit dem Titel Videos, und fügen Sie hinzu. AVI-Dateien, die darin analysiert werden sollen.
  3. Öffnen Sie main.m mit MATLAB 2019a und führen Sie den Code aus. Geben Sie den Namen der zu analysierenden Videodatei in das Befehlsfenster unter Bitte geben Sie die zu analysierende Datendatei ein:.
  4. Legen Sie in der geöffneten grafischen Benutzeroberfläche (GUI) den Schwellenwert (Text im Feld oben rechts im Fenster) auf 20 fest und klicken Sie auf die Schaltfläche Schwellenwert festlegen, um dies zu bestätigen.
  5. Verwenden Sie den Datencursor in der oberen Werkzeugleiste des Fensters, um ein Pixel an einer beliebigen Stelle auf der Maßstabsleiste auszuwählen. Klicken Sie im Abschnitt Maßstabsleiste auf der rechten Seite des Fensters auf Startpunkt. Die (x,y) Position des gewählten Pixels wird rechts neben der Schaltfläche angezeigt. Klicken Sie auf die Pixel-Schaltfläche . Die Pixelgröße muss nur einmal in jedem Video gemessen werden.
  6. Wählen Sie ein beliebiges Pixel auf dem Molekül von Interesse. Klicken Sie auf Startpunkt im VWF-Bereich. Nachdem die Position des gewählten Pixels im Textfeld rechts angezeigt wird, klicken Sie auf das linke Ende, das rechte Ende und die String-Länge, um die molekulare Länge im Bild zu erhalten.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann verwendet werden, um die konformen Veränderungen eines Biomoleküls zu analysieren, obwohl der Code einen bestimmten Abschnitt namens VWFenthält.
  7. Überprüfen Sie das linke und rechte Ende des Moleküls. Vergrößern Sie den Datencursor, um die Pixelposition zu überprüfen. Wählen Sie das Pixel manuell als Ende aus und berechnen Sie bei Bedarf die Länge (in Pixel).
  8. Zeichnen Sie die Pixelgröße in der Pixelzahl und die Zeichenfolgenlänge in Pixelzahl in ein Excel-Blatt auf, und berechnen Sie die Zeichenfolgenlänge in m.
  9. Wiederholen Sie die obigen Schritte für jedes Bild. Verwenden Sie die Schaltfläche Letzte, Weiter in der unteren rechten Ecke der GUI, um zwischen Bildern in derselben Videodatei zu wechseln. Klicken Sie auf Schließen, um das GUI-Fenster zu schließen.

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Ergebnisse

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Die Beobachtung des dynamischen Verhaltens von Biomolekülen wie VWF und Lambda DNA hängt in hohem Maße von der Optimierung ihrer Bindung an die Geräteoberfläche ab. Die Inkubation von Oberflächenbehandlungen für die empfohlenen Zeiten im mikrofluidischen Gerät ist entscheidend, um eine Bindung mit wenigen Verankerungspunkten zu erhalten, so dass moleküle sich bei wechselndem Fluss frei ausdehnen und entspannen können. Wenn die Proteine oder die DNA zu stark mit mehreren Verbindungen gebunden sind, werden sie sich entwede...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um qualitativ hochwertige Daten von konbildenden Veränderungen einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, wie in dieser Methode beschrieben, ist es wichtig, das Molekül für die entsprechende Zeit zu inkubieren, seine unspezifischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu minimieren. und stellen Sie Mikroskopeinstellungen ein, die das Photobleichen reduzieren. Die Fähigkeit des Moleküls, die Konformation frei zu verändern, hängt mit der Anzahl der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen zusammen, die ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch eine Nationale Wissenschaftsstiftung unterstützt, die DMS-1463234, die Nationalen Gesundheitsinstitute HL082808 und AI133634 und die interne Finanzierung der Lehigh University gewährt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 488 MarkierungskitInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 GelsäulenBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501Als freies Biotin in Schritt 5.6
verwenden Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
DeckgläserVWR48393-195Nr. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP SetInvitrogen10297018
Schwimmbojen für Mini-DialysegerätThermo Scientific69588
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212SVerwendung für 10X Reaktionspuffer in Schritt 2.1.1 und 1X Reaktionspuffer in Schritt 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini-DialysegerätThermo Scientific6957010K MWCO, 0,1 mL Volumen
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuat 3,4-DioxygenaseSigma-AldrichP8279
ProtocatechusäureSanta Cruz Biotechnologysc-205818
Silikonelastomer-Kit für die PDMS-HerstellungThe Dow Chemical Company4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
Die BlockierungslösungCANDOR Bioscience110 050Verwendung als Kasein-Blockierungslösung während des gesamten
Protokolls Vinyl-ReinraumbandFisher Scientific19-120-3217
von Willebrand Factor, Human PlasmaMillipore Sigma681300
YOYO-1 FarbstoffAAT Bioquest17580
0,25 mm Schlauch mit InnendurchmesserCole-ParmerEW-06419-00
25 Gauge NadelThomas ScientificJG2505X

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

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