Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.

Abstract

Das Verhalten von Einzelmolekülen unter mechanischer Störung wurde weithin charakterisiert, um viele biologische Prozesse zu verstehen. Methoden wie die Atomkraftmikroskopie haben jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung, während Förster Resonanzenergieübertragung (FRET) nur die Ableitung von Konformationen zulässt. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle unter verschiedenen Strömungsbedingungen. Unser Protokoll beschreibt die Schritte zur Erfassung von konformen Veränderungen einzelner Biomoleküle in verschiedenen Scherflussumgebungen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Scherstrom wird in mikrofluidischen Kanälen erzeugt und über eine Spritzenpumpe gesteuert. Als Demonstrationen der Methode werden von Willebrand-Faktor (VWF) und Lambda-DNA mit Biotin und Fluorophor gekennzeichnet und dann auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Ihre Konformationen werden unter variablem Scherstrom kontinuierlich mit Derinkintheitierreflexion (TIRF) und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Die reversible Entwirrungsdynamik von VWF ist nützlich, um zu verstehen, wie seine Funktion im menschlichen Blut reguliert wird, während die Konformation der Lambda-DNA Einblicke in die Biophysik von Makromolekülen bietet. Das Protokoll kann auch weit verbreitet werden, um das Verhalten von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen.

Introduction

Mechanismen, wie Biomoleküle auf Umweltreize reagieren, wurden umfassend untersucht. Insbesondere in einer Strömungsumgebung regulieren Scher- und Dehnungskräfte die Konformationsveränderungen und potenziell die Funktion von Biomolekülen. Typische Beispiele sind das scherinduzierte Entwirren der Lambda-DNA und der von Willebrand-Faktor (VWF). Lambda DNA wurde als Werkzeug verwendet, um die konforme Dynamik einzelner, flexibler Polymerketten und die Rheologie von Polymerlösungen^1,2,3,4zu verstehen. VWF ist ein natürlicher Strömungssensor, der....

Protocol

1. Vorbereitung von VWF

1. Rekonstituieren Sie menschliches Plasma VWF, um es für die Etikettierungsreaktionen vorzubereiten. Fügen Sie 100 l deionisiertes (DI) Wasser zu 100 g lyophilisiertem VWF hinzu, um eine VWF-Lagerlösung mit 1 mg/ml zu erstellen.
2. Dialyze VWF-Lagerlösung, um überschüssiges Glycin zu entfernen und damit die Biotin- und Fluorophor-Etikettierungseffizienz zu erhöhen.
   1. Übertragen Sie 50 l VWF-Lagerlösung in eine 0,1 ml Dialyseeinheit mit einem 10.000 Molekulargewichtsabschaltung und Abdichtung mit Kappe. Bewahren Sie die Reststofflösung bei -20 °C auf. Die VWF-Aktie bleibt bis zu einem Jahr bei -20 °C stabil.
   2. Dialy....

Results

Die Beobachtung des dynamischen Verhaltens von Biomolekülen wie VWF und Lambda DNA hängt in hohem Maße von der Optimierung ihrer Bindung an die Geräteoberfläche ab. Die Inkubation von Oberflächenbehandlungen für die empfohlenen Zeiten im mikrofluidischen Gerät ist entscheidend, um eine Bindung mit wenigen Verankerungspunkten zu erhalten, so dass moleküle sich bei wechselndem Fluss frei ausdehnen und entspannen können. Wenn die Proteine oder die DNA zu stark mit mehreren Verbindungen gebunden sind, werden sie sich entwede.......

Discussion

Um qualitativ hochwertige Daten von konbildenden Veränderungen einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, wie in dieser Methode beschrieben, ist es wichtig, das Molekül für die entsprechende Zeit zu inkubieren, seine unspezifischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu minimieren. und stellen Sie Mikroskopeinstellungen ein, die das Photobleichen reduzieren. Die Fähigkeit des Moleküls, die Konformation frei zu verändern, hängt mit der Anzahl der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen zusammen, die .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Markierungskit	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 Gelsäulen	Bio-Rad	7326221
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Als freies Biotin in Schritt 5.6
verwenden Biotin-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-Biotin	Sigma-Aldrich	A8549
Deckgläser	VWR	48393-195	Nr. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set	Invitrogen	10297018
Schwimmbojen für Mini-Dialysegerät	Thermo Scientific	69588
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S	Verwendung für 10X Reaktionspuffer in Schritt 2.1.1 und 1X Reaktionspuffer in Schritt 2.2.2
Lambda DNA	New England BioLabs	N3011S
Mini-Dialysegerät	Thermo Scientific	69570	10K MWCO, 0,1 mL Volumen
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-Biotin	Thermo Scientific	21330
Protocatechuat 3,4-Dioxygenase	Sigma-Aldrich	P8279
Protocatechusäure	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
Silikonelastomer-Kit für die PDMS-Herstellung	The Dow Chemical Company	4019862
Streptavidin	Sigma-Aldrich	85878
Die Blockierungslösung	CANDOR Bioscience	110 050	Verwendung als Kasein-Blockierungslösung während des gesamten
Protokolls Vinyl-Reinraumband	Fisher Scientific	19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 Farbstoff	AAT Bioquest	17580
0,25 mm Schlauch mit Innendurchmesser	Cole-Parmer	EW-06419-00
25 Gauge Nadel	Thomas Scientific	JG2505X