Methodenartikel

Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte

DOI:

10.3791/60785

⸱

22. Januar 2020

 ,  , 
1Zietchick Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Präsentiert hier ist ein Protokoll für die Verwendung einer kortikalen Nierenextrakt Präparat und Gesamtprotein Normalisierung, um die Korrelation zwischen vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor und luteinisierendes Hormon in der Säugetierniere zu demonstrieren.

Zusammenfassung

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Vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) hilft, Angiogenese und vaskuläre Durchlässigkeit in der Niere zu kontrollieren. Nierenerkrankungen, wie diabetische Nephropathie, sind mit VEGF-Dysregulation in der Niere verbunden. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen in der Niere regieren, sind nicht gut verstanden. Luteinizing Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen zu regulieren. Da LH-Rezeptoren in der Niere gefunden werden, haben wir am Zietchick Research Institute hier vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in der Niere zu regulieren. Um Beweise zu liefern, wollten wir zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Säugetierniere vorherzusagen. Bei den meisten VEGF-bezogenen Untersuchungen mit der Niere wurden Säugetiere niedrigerer Ordnung als Modelle verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen). Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, wurde beschlossen, die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (d. h. Rinder- und Schweinemodelle) zu untersuchen. Dieses Protokoll verwendet das gesamte Proteinlysat aus dem Nierenkortex. Zu den Schlüsseln zum Erfolg dieser Methode gehören die Beschaffung von Nieren von Schlachthoftieren unmittelbar nach dem Tod sowie die Normalisierung des Analytspiegels (im Nierenextrakt) durch das Gesamtprotein. Diese Studie zeigt erfolgreich eine signifikante lineare Beziehung zwischen LH und VEGF sowohl bei Rinder- als auch in Schweinenieren. Die Ergebnisse sind in zwei verschiedenen Arten reproduzierbar. Die Studie liefert Belege dafür, dass die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete, wirtschaftliche und reichlich vorhandene Ressource für die Untersuchung der Nierenphysiologie ist, insbesondere zur Untersuchung der Korrelation zwischen VEGF und anderen Analyten.

Einleitung

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Vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), hilft, Angiogenese und vaskuläre Permeabilität in der Niere und anderen Organen1,2 (im Folgenden WIRD VEGF-A als VEGF bezeichnet werden) zu regulieren. VEGF-Spiegel in der Niere sind unter strenger panostatischer Kontrolle. Wenn die VEGF-Spiegel der Nieren erhöht oder depressiv sind, kann die Niere fehlamwerden. Zum Beispiel entwickeln Mäuse mit podozytspezifischer Heterozygosität für VEGF innerhalb von 3 Wochen nach der Geburt Endotheliose und blutlose Glomeruli (d. h. Nierenläsionen, die bei menschlicher Präeklampsie beobachtet werden), und Nierenversagen im Endstadium tritt in diesen Heterozygoten im Alter von 3 Monaten auf. Podozyten-spezifische homozygote Knockouts sterben an Hydrops und Nierenversagen innerhalb von 1 Tag nach der Geburt3,4.

Auf der anderen Seite verursacht überexpression von renalem VEGF Proteinurie und glomeruläre Hypertrophie3,4. Zum Beispiel zeigen transgene Kaninchen, die VEGF überexpressen, progressive Proteinurie mit erhöhten glomerulären Filtrationsraten in frühen Stadien der Nephropathie, gefolgt von verringerten glomerulären Filtrationsraten in späteren Stadien3. Diabetische Nephropathie, eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium bei diabetischen Erwachsenen, ist stark mit VEGF-Dysregulation2,5verbunden. Der Rolle der Hypoxie bei der Induktion der VEGF-Expression unter pathologischen Bedingungen wurde große Aufmerksamkeit gewidmet5. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen (sowohl in der Niere als auch in anderen Organen) beeinflussen, sind jedoch nicht gut verstanden2,6. Die Identifizierung dieser Faktoren (mit Ausnahme von Sauerstoff), die an der physiologischen und pathologischen VEGF-Regulierung beteiligt sind, ist ein wichtiges Unterfangen.

Luteinisierendes Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, die physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen wie Eierstock und Hoden7,8zu regulieren. Frühere Studien haben Beweise dafür erbracht, dass LH auch hilft, VEGF in nicht-reproduktiven Organen zu regulieren, wie die Augen6,9,10. LH-Rezeptoren finden sich in der Medulla und Demkorteder der Niere11,12. Bemerkenswert ist, dass nierenröhrenförmige Epithelzellen sowie der LH-Rezeptor VEGF11,12,13,14ausdrücken. Unter Berücksichtigung dieser beiden Beobachtungen haben wir vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in derNiere zuregulieren 13,14. Um Beweise für diese LH/VEGF-Beziehung zu liefern, soll das vorgestellte Protokoll zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Niere vorherzusagen. Viele frühere VEGF-bezogene Untersuchungen mit der Niere haben Säugetiermodelle niedrigerer Ordnung verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen)2. Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, untersucht die Studie die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (hier Rinder- und Schweinemodelle). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das Gesamteproteinlysat aus der Kortexregion von Rinder- und Schweinenieren hergestellt.

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Protokoll

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Für diese Studie wurden keine lebenden oder experimentellen Tiere verwendet.

1. Gewebehandhabung

  1. Beschaffen Sie Rinder und Schweine ganze Nieren unmittelbar nach der Schlachtung aus einem Schlachthof. Transport auf Eis zum Labor.
  2. Bei der Ankunft im Labor die Nieren mit 50 ml eiskaltem Phosphat gepufferter Saline (PBS) abspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um Blut vollständig zu entfernen.
  3. Halten Sie die Nieren bis zur weiteren Extraktion auf Eis (oder gekühlt).

2. Dissektion der Nieren

  1. Verwenden Sie sterile Schere, Zangen, ein Messer und Petrischalen, um die Nieren zu sezieren und die erforderliche Gewebeportion zu verbrauchen.
  2. Bereiten Sie RIPA-Lysepuffer vor der Nierensektion vor. 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% Natriumdesoxycholat und 10% SDS in doppelt destilliertem Wasser auflösen, dann gründlich mischen. Kühlen Sie den RIPA-Lysepuffer, wenn er nicht verwendet wird.
  3. Schneiden Sie die Niere vorsichtig in die Hälfte (sagittale Ebene) und schneiden Sie ein Stück Gewebe (50-70 mm2) aus dem Kortexbereich in der Mitte der Niere (mit einem Gewicht von 80-100 mg durch Nassgewicht).
  4. Den Gewebeblock mit einem Messer in kleine Stücke zerkleinern, um den Homogenisierungsprozess zu unterstützen.
  5. Nach dem Zerminieren des Gewebes in ein Mikrofugenrohr mit 1 ml eiskaltem 1x RIPA-Lyseextraktionspuffer. Legen Sie die Rohre bis zur weiteren Extraktion in Eis.

3. Gewebehomogenisierung

  1. Beschriften Sie die Mikrofugenröhrchen mit spezifischen Probendetails für die Gewebeüberstandsammlung.
  2. Mit einem Handhomogenisator mit einer sterilen Sonde, dann homogenisieren Sie das Gewebe für 1-2 min bei kalten Bedingungen (Proben auf Eiskübel), bis keine Teile von Geweben sichtbar sind.
  3. Die Gewebeextrakte sofort zur Zentrifugierung in der gekühlten Zentrifuge bei 9.600 x g für 5 min bei 4 °C unterziehen.
  4. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf den Eiskübel.
  5. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen beschrifteten Mikrofugenrohr und lagern Sie auf Eis. Entsorgen Sie das Pellet.
  6. Bereiten Sie separate Aliquots der Überstande für LH- und VEGF-A-Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA) bzw. die gesamte Proteinanalyse vor, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.

4. Rinder und Schweine LH ELISA Assay

  1. Bewahren Sie alle ELISA-Assay-Komponenten im handelsüblichen luteinisierenden Hormon (LH) ELISA-Kit (siehe Materialtabelle) bei 2-8 °C auf. Dazu gehören Antikörper, HRP-Konjugat, Assayplatte (96 gut), Kalibratoren, Waschpuffer (20x Konzentrat), Substrat A, Substrat B und Stop-Lösung. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  2. Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und Assayplatten auf Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen für den Assay, Versiegeln und halten Sie die ungenutzten Brunnen bei 4 °C bis zum Gebrauch.
  3. Den Waschpuffer (15 ml 20x Konzentrat) mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 ml verdünnen
  4. Richten Sie die leeren Brunnen ohne Lösung ein.
  5. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Standard oder Probe hinzu (n = 2), und fügen Sie dann jedem Brunnen weitere 50 l Meerrettichperoxidase (hrp)-Konjugat hinzu. Fügen Sie sofort weitere 50 L Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte versiegeln, gut mischen und 1 h bei 37 °C bebrüten.
  6. Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (200 l/well) und wiederholen Sie 4x.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Substrat A und 50 l Substrat B hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie die Platte an der Seite sanft anzapfen. Die Platte versiegeln und 15 min bei 37 °C im Dunkeln 15 min inkubieren.
  8. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Stop-Lösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Platte mit dem Spektralphotometer, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
  9. Normalisieren Sie den LH-Gehalt von Rindern und Schweinen auf das Gesamtprotein (siehe Abschnitt 6).

5. Rinder- und Schweine-VEGF-A ELISA-Test

  1. Bewahren Sie alle ELISA-Assay-Komponenten in den handelsüblichen Vascular Endothelial Growth Factor-A ELISA-Kits (siehe Materialtabelle)bei 2-8 °C auf. Dazu gehören Antikörper, HRP-Konjugat, Assayplatte (96 gut), Kalibratoren, Waschpuffer (20x Konzentrat), Substrat A, Substrat B und Stop-Lösung. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  2. Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und Assayplatten auf RT. Verwenden Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen für den Assay, versiegeln und halten Sie die ungenutzten Brunnen bei 4 °C bis zum Gebrauch.
  3. Den Waschpuffer (15 ml 20x Konzentrat) mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 ml verdünnen
  4. Fügen Sie jedem Bohrwert 100 l des Standards oder der Probe hinzu (n = 2). Die Platte versiegeln, gut mischen und 2 h bei 37 °C bebrüten.
  5. Entfernen Sie die Flüssigkeit in jedem Brunnen und fügen Sie 100 l Detektionsreagenz A zu jedem Brunnen hinzu, versiegeln Sie die Platte und brüten sie 1 h bei 37 °C.
  6. Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (400 l/well) und wiederholen Sie 4x.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Detektionsreagenz B hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie die Platte an der Seite sanft anzapfen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie die Platte für 1 h bei 37 °C.
  8. Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (400 l/well) und wiederholen Sie 4x.
  9. Fügen Sie jedem Brunnen 90 L Substratlösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und brüten sie 1 h bei 37 °C.
  10. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Stop-Lösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Platte mit dem Spektralphotometer, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
  11. Renormalisieren Sie den VEGF-A-Gehalt von Rindern und Schweinen auf das Gesamtprotein (Abschnitt 6).

6. Proteinschätzung insgesamt

  1. Schätzen Sie das Gesamtprotein der Rinder- und Schweinenierenextrakte anhand des Standard-Serumalbumins (BSA) anhand eines kommerziellen Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

7. Statistische Analyse

  1. Berechnen Sie den Mittelwert, den Median und die Standardabweichung jedes Analyten.
  2. Testen Sie die Divergenz der Probenverteilung von der normalen Verwendung Kolmogorov-Smirnov Test zu entscheiden, nach der Verwendung, zwischen parametrischen vs. nicht-parametrischen statistischen Tests. Wenn die Daten normal verteilt sind, führen Sie statistische Tests über parametrische Tests durch.
  3. Unter geeigneten Umständen (z. B. normaler Datenverteilung) sollten Regressionsmodelle die lineare Beziehung zwischen LH und VEGF-A untersucht werden.

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Ergebnisse

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Der Mittelwert und der Median von LH und VEGF nach Tiertyp und Geschlecht sind in Tabelle 1dargestellt. Nach der Überprüfung der Normalität der Daten durch Kolmogorov-Smirnov Prüfung der Normalität, lineare Regressionsmodelle wurden verwendet, um die Beziehung zwischen LH und VEGF zu untersuchen. LH erwies sich als starker und signifikanter Prädiktor von VEGF sowohl bei Rinder- als auch bei Schweinenieren (Rindernierenmodell: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; Schwei...

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Diskussion

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Die Beschaffung von Nieren aus dem Schlachthof unmittelbar nach dem Tod der Tiere ist der Schlüssel zum Erfolg in dieser Methodik. Dies ist der Hauptvorteil der Verwendung von Organen von Kühen und Schweinen anstelle von menschlichen Leichen. Es gibt in der Regel mindestens eine Verzögerung von 12-24 h vom Zeitpunkt des Todes bis zur Beschaffung menschlicher Kadaverorgane. Da sich die chemische Zusammensetzung der Körperorgane innerhalb von 2 h postmortal15,16sig...

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Offenlegungen

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Zietchick Research Institute (ZRI) ist ein privates (gewinnorientiertes) Forschungsinstitut, und Dr. Tammy Movsas (Gründer und Direktor von ZRI) hat eine anhängige Patentanmeldung und validierte Patente für die Verwendung von Gonadotropin-Antagonisten bei der Behandlung von Augenerkrankungen diabetes. Abgesehen davon, dass Dr. A. Muthusamy Mitarbeiter (Biochemiker) bei ZRI ist, hat er keine anderen finanziellen Konflikte zu melden. A. Arivalagan (Sommerpraktikant an der ZRI, Student an der University of Michigan) hat keine anderen finanziellen Konflikte zu melden.

Danksagungen

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Die Autoren danken Scholl es Slaughterhouse (Blissfield, MI) für die Bereitstellung der Rinder- und Schweinenieren. Für diese Studie wurden keine Fördermittel in Höhe von zuschüssen mitteln verwendet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LH-ELISA-Kit für RinderMyBiosource, San Diego, Kalifornien.
Rinder VEGF-A ELISA KitMyBiosource, San Diego, Kalifornien.
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.23235
Schweine-LH-ELISA-KitMyBiosource, San Diego, Kalifornien.
Schweine VEGF-A ELISARay Biotech, Norcross, GA.ELP-VEGFA-1
RIPA Lyse- und ExtraktionspufferThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.Nr. 89901
MBS700951MBS2887434MBS009739

Referenzen

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Analyse linearer Zusammenh ngeRind und SchweinemodelleNormalisierung des GesamtproteinsELISA Assay ProtokollGewebedissektionsmethodeSpektrophotometer MesswertStudie zur Nierenphysiologie

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