Methodenartikel

Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

DOI:

10.3791/60793

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14. Februar 2020

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1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Molecular Biotechnology, Turkish-German University, 3Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 4Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, 5Helmholtz Centre for Infection Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Präsentiert hier ist eine sichere und effektive Methode, um Zebrafischlarven mit fluoreszierend markierten anaeroben C. difficile durch Mikroinjektion und nichtinvasive Mikrogavage zu infizieren.

Zusammenfassung

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Clostridioides difficile Infektion (CDI) gilt als eine der häufigsten Gesundheits-assoziierten Magen-Darm-Infektionen in den Vereinigten Staaten. Die angeborene Immunantwort gegen C. difficile wurde beschrieben, aber die genauen Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in CDI sind weniger verstanden. In der aktuellen Studie werden Danio rerio (Zebrafisch) Larven verwendet, um ein C. difficile Infektionsmodell für die Abbildung des Verhaltens und der Zusammenarbeit dieser angeborenen Immunzellen in vivo zu etablieren. Zur Überwachung von C. difficilewurde ein Etikettierungsprotokoll mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingerichtet. Eine lokalisierte Infektion wird durch Mikroinjektion mit der Bezeichnung C. difficile erreicht, die aktiv im Darmtrakt des Zebrafisches wächst und die Darmepithelschäden bei CDI imitiert. Dieses direkte Infektionsprotokoll ist jedoch invasiv und verursacht mikroskopische Wunden, die experimentelle Ergebnisse beeinflussen können. Daher wird hier ein nichtinvasiveres Mikrogavage-Protokoll beschrieben. Die Methode beinhaltet die Abgabe von C. difficile Zellen direkt in den Darm von Zebrafischlarven durch Intubation durch den offenen Mund. Diese Infektionsmethode imitiert eng den natürlichen Infektionsweg von C. difficile.

Einleitung

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C. difficile ist ein grampositiver, sporenbildender, anaerobeundischer und toxinproduzierender Bacillus, der die Hauptursache für schwere Infektionen im Magen-Darm-Traktist 1. Typische Symptome von CDI sind Durchfall, Bauchschmerzen und tödliche pseudomembranöse Kolitis, und es kann manchmal zum Tod führen1,2. Es gibt Beweise dafür, dass Immunantworten des Wirts eine entscheidende Rolle sowohl für das Fortschreiten als auch für das Ergebnis dieser Krankheit spielen3. Neben der Immunantwort ist die einheimische Darmmikrobiota entscheidend für den Beginn u....

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt (EU-Richtlinie 2010/63, Lizenz AZ 325.1.53/56.1-TUBS und Lizenz AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Herstellung von niedrigschmelzenden Agarose-, Gelplatten- und Mikroinjektions-/Mikrogavagenadeln

  1. 0,08 g niedrigschmelzende Agarose (Materialtabelle, Agarose A2576) in 10 ml von 30% Danieau-Medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) und 17,4 mM NaCl, bei Raumtemperatur (RT) gelagert, um eine 0,8%-Lösung zu erhalten.
    HINWEIS: Es können höhere o....

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Ergebnisse

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C. difficile ist streng anaerobe, aber das Chromophor von fluoreszierenden Proteinen erfordert in der Regel Sauerstoff zu reifen. Um dieses Problem zu überwinden, wurde ein fluoreszierender Farbstoff verwendet, um lebende C. difficile Zellen zu färben, die aktiv wuchsen (R20291, ein Ribotyp 027 Stamm; Abbildung 1A). Mit dem Gal4/UAS-System wurden stabile transgene Zebrafischlinien für die Live-Bildgebung erzeugt, bei denen die mpeg1.1- oder lyZ.......

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Diskussion

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Die vorgestellten Methoden modifizieren und erweitern einen bestehenden Ansatz zur Infektion von Zebrafischlarven durch Injektion und Mikrogavage10,14. Es zeigt auch einen Ansatz zur Untersuchung anaerobe Krankheitserreger mit Zebrafischlarven22. Darüber hinaus erleichtert das Protokoll die Analyse angeborener Immunzellreaktionen in vivo nach CDI und nach Deronisation von C. difficile bei Zebrafischen. Die Methode ist reproduzierb.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Wir danken Timo Fritsch für die hervorragende Tierpflege. Wir danken den Mitgliedern der Labore Köster und Steinert für die Unterstützung und die hilfreichen Gespräche. Wir danken Dr. Dandan Han für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Finanzierung durch das Land Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseSigma-AldrichA2576Ultra-niedrig gelierende Agarose
Agarose niedrigschmelzend (LM)Pronadisa8050Es wird in Agaroseplatten verwendet
BacLight Rot BakterienfleckThermo Fisher ScientificB35001Fluoreszierender Farbstoff
Gehirn-Herz-Infusion BouillonCarl Roth GmbHX916.1
Messing (Wildtyp)mangelhaft bei der Melaninsynthese, zur Erzeugung stabiler transgener Linien
Calciumnitrat (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
KapillarglasHarvard Apparatus30-0019Injektionsnadeln
Clostridioides difficileR20291,, ein Ribotyp 027 Stamm, TcdA+/TcdB+/CDT+ Produktion
DMSOCarl Roth GmbHA994
FIJIOpen-Source-PlattformBildverarbeitung
HEPESCarl Roth GmbH6763
Horizontaler NadelabzieherSutter instrument IncP-87
L-CysteinSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaBildverarbeitung
Magnesiumsulfat (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Mikroinjektoreppendorf5253000017
MikrospritzgussformenAdaptive Science ToolsTU1
Leica SP8 konfokales MikroskopLeica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Kaliumchlorid (KCl)Carl Roth GmbH5346
Natriumchlorid (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholatCarl Roth GmbH8149<
em>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stabile transgene Linie, in der die lyZ-Promotoren die Expression des fluoreszierenden EGFP-Proteins
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stabile transgene Linie, in der das mpeg1.1 die Expression des fluoreszierenden EGFP-Proteins
TricainSigma-AldrichE10521
HefeextraktBD Bacto212750
in Neutrophilen steuern in Makrophagen steuert

Referenzen

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  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al.

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Schlagwörter

ZebrafischlarvenC difficile InfektionMicrogavage ProtokollFluoreszenzmarkierungkonfokale Bildgebungangeborene Immunantwortanaerobe Bakterienkulturintestinale KolonisierungMakrophagen PhagozytoseNeutrophilen Rekrutierung

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