Methodenartikel

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

DOI:

10.3791/60806

⸱

30. März 2020

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1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Zusammenfassung

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Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung auf formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Gewebe ermöglicht den Nachweis mehrerer Marker in einer einzigen Gewebeprobe, die Informationen über Antigenkoexpression und räumliche Verteilung der Marker liefern können. Ein Mangel an geeigneten Antikörpern für formalfixierte Gewebe kann jedoch die Art der Marker einschränken, die nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ist die Färbemethode zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode zur Multispektralfluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben. Die Methode umfasst die verwendeten Fluorophorkombinationen, detaillierte Schritte zur Färbung von Maus- und menschlichen gefrorenen Geweben sowie die Scan-, Erfassungs- und Analyseverfahren. Für die Färbeanalyse wird ein handelsübliches multispektrales Fluoreszenz-Bildgebungssystem eingesetzt. Durch diese Methode wurden bis zu sechs verschiedene Marker in einem einzigen gefrorenen Gewebeabschnitt gebeizt und nachgewiesen. Die Machine Learning-Analysesoftware kann Zellen phänotypieren, die für die quantitative Analyse verwendet werden können. Die hier beschriebene Methode für gefrorene Gewebe ist nützlich für den Nachweis von Markern, die in FFPE-Geweben nicht nachgewiesen werden können oder für die Antikörper für FFPE-Gewebe nicht verfügbar sind.

Einleitung

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Jüngste Fortschritte bei mikroskopischen Bildgebungstechniken haben unser Wissen und Verständnis von biologischen Prozessen und Krankheitszuständen deutlich verbessert. Der In-situ-Nachweis von Proteinen in Geweben über die chromogene Immunhistochemie (IHC) wird routinemäßig in der Pathologie durchgeführt. Der Nachweis mehrerer Marker mit chromogener IHC-Färbung ist jedoch eine Herausforderung1 und neuere Methoden zur Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeansätzen (mIF), bei denen mehrere biologische Marker auf einer einzigen Gewebeprobe gekennzeichnet sind, werden entwickelt. Der Nachweis mehrerer biologischer Marker ist nützlich, da ....

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Protokoll

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Mausmilz und HLF16 Maustumorgewebe23 wurden aus unserem Labor gewonnen. Menschliches Mandelgewebe wurde von einem kommerziellen Anbieter gekauft. Einzelheiten finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Gewebeeinbettung

  1. Einbetten von frischem Gewebe in OCT (optimale Schnitttemperatur) Lösung und Schnappgefrieren mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.
  2. Gewebe bei -80 °C lagern.

2. Kryosektion

  1. Schneiden Sie die Abschnitte in einem Kryostat mit Temperaturen von -25 °C.
    HINWEIS: Die bevorzugte Schnittdicke kann angepa....

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Ergebnisse

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Nachweis von einscheinigten Markern auf gefrorenen Milzabschnitten
Da das halbautomatische Bildgebungssystem ein Flüssigkristall-Tunable-Filter-System (LCTF) verwendet, das einen größeren Bereich der Wellenlängendetektion25ermöglicht und hier keine Signalverstärkungsschritte durchgeführt wurden, haben wir zunächst die Detektion unserer primär konjugierten Antikörper für jeden Marker auf dem Mikroskop optimiert. Ein Beispiel ist in Abbildung 1darges.......

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Diskussion

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Gefrorene Gewebe wurden ausgiebig für die mIF-Bildgebung verwendet, um traditionell drei bis vier Marker31 auf einem Gewebe mit der direkten und indirekten Methode32zu erkennen. Bei der direkten Methode werden Antikörper mit fluoreszierenden Farbstoffen oder Quantenpunkten33 konjugiert, um das Gewebe zu kennzeichnen, während bei der indirekten Methode ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet wird, um das Gewebe zu kennzeichnen, gefolgt von einem.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die Anleitung zur Bildgebung und Analyse wurde vom Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core an der University of Illinois at Chicago mit Unterstützung des Büros des Vizekanzlers für Forschung bereitgestellt. Die Arbeit wurde von NIH/NCI RO1CA191317 an CLP, von NIH/NIAMS (SBDRC Grant 1P30AR075049-01) an Dr. A. Paller und mit Unterstützung des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center an den Immunotherapy Assessment Core an der Northwestern University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aceton (histologische Qualität)Fisher ScientificA16F-1GALFixiergewebe
Alexa Fluor 488 Anti-MausCD3 BioLegend 100212Klon - 17A2; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humaner CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Klon - L26; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 555 Maus anti-Ki-67BD Biosciences558617Primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 594 Anti-Human-CD3BioLegend300446-Klon- UCHT1; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 594 Anti-Maus-CD8aBioLegend 100758Klon - 53-6.7; Primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 647 Anti-Human-CD8aBioLegend 372906Klon - C8/144B; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD206 (MMR)BioLegend141711Klon - C068C2; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD4 AntikörperBioLegend100426Klon - GK1.5; primärer konjugierter Antikörper
C57BL/6 MausRiver Laboratories27Gefrorenes Mausgewebe für das multispektrale Training
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EARehydrieren und Waschen von Objektträgern
DAPI SolutionBD Biosciences564907Nukleinsäurefleck
Diamond White Glass Charged SlidesDOT ScientificDW7590WAnhaftende Gewebeschnitte
Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung 1x (ohne Ca und Mg)Fisher ScientificMT21031CVWasch- und Verdünnungsmittel
Gold Seal Cover SlipsThermoFisher Scientific3306Schutz von gefärbtem Gewebe
Menschliche normale Mandeln OCT gefrorener GewebeblockAMSBioAMS6023Menschliches gefrorenes Gewebe für die multispektrale Färbung
Menschliches Serum 1xGemini Bio-Products100-512Blockierungs- und Verdünnungsmittel für menschliches Gewebe
inFormAkoya BiosciencesVersion 2.4.1Software für maschinelles Lernen
PerCP/Cyanin5.5 Anti-Human-CD4BioLegend300529Klon - RPA-T4; primärer konjugierter Antikörper
PerCP-Cy 5.5 Ratte Anti-CD11bBD Biosciences550993Klon - M1/70; primärer konjugierter Antikörper
PhänochartAkoya BiosciencesVersion 1.0.8Software für den gesamten Objektträger
ProLong Diamond Antifade EindeckmittelThermoFisher ScientificP36965Eindeckmedium
Forschung KryostatLeica BiosystemsCM3050 SGewebe
schneiden Superblock 1xThermoFisher Scientific37515Blockieren von Mausgewebe
Tissue-Tek O.C.T LösungSakura Finetek4583Einbetten von Geweben
Vectra 3.0 Automatisiertes quantitatives Bildgebungssystem für die Pathologie, 6 ObjektträgerAkoya BiosciencesCLS142568Halbautomatische multispektrale Bildgebung System
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersion 3.0.5Software zum Bedienen des Mikroskops
Charles

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.

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Fluorophor KombinationenErstellung einer SpektralbibliothekAnalyse mittels maschinellem LernenZellsegmentierungAntik rper F rbeprotokollspektrales UnmixingWhole Slide ScanPh notyp Mapping

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