Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

9.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/60806

⸱

30. März 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Zusammenfassung

Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung auf formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Gewebe ermöglicht den Nachweis mehrerer Marker in einer einzigen Gewebeprobe, die Informationen über Antigenkoexpression und räumliche Verteilung der Marker liefern können. Ein Mangel an geeigneten Antikörpern für formalfixierte Gewebe kann jedoch die Art der Marker einschränken, die nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ist die Färbemethode zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode zur Multispektralfluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben. Die Methode umfasst die verwendeten Fluorophorkombinationen, detaillierte Schritte zur Färbung von Maus- und menschlichen gefrorenen Geweben sowie die Scan-, Erfassungs- und Analyseverfahren. Für die Färbeanalyse wird ein handelsübliches multispektrales Fluoreszenz-Bildgebungssystem eingesetzt. Durch diese Methode wurden bis zu sechs verschiedene Marker in einem einzigen gefrorenen Gewebeabschnitt gebeizt und nachgewiesen. Die Machine Learning-Analysesoftware kann Zellen phänotypieren, die für die quantitative Analyse verwendet werden können. Die hier beschriebene Methode für gefrorene Gewebe ist nützlich für den Nachweis von Markern, die in FFPE-Geweben nicht nachgewiesen werden können oder für die Antikörper für FFPE-Gewebe nicht verfügbar sind.

Einleitung

Jüngste Fortschritte bei mikroskopischen Bildgebungstechniken haben unser Wissen und Verständnis von biologischen Prozessen und Krankheitszuständen deutlich verbessert. Der In-situ-Nachweis von Proteinen in Geweben über die chromogene Immunhistochemie (IHC) wird routinemäßig in der Pathologie durchgeführt. Der Nachweis mehrerer Marker mit chromogener IHC-Färbung ist jedoch eine Herausforderung1 und neuere Methoden zur Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeansätzen (mIF), bei denen mehrere biologische Marker auf einer einzigen Gewebeprobe gekennzeichnet sind, werden entwickelt. Der Nachweis mehrerer biologischer Marker ist nützlich, da Informationen zur Gewebearchitektur, zur räumlichen Verteilung von Zellen und zur Antigen-Co-Expression alle in einer einzigen Gewebeprobe erfasst werden2. Der Einsatz multispektraler Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie hat den Nachweis mehrerer biologischer Marker ermöglicht. In dieser Technologie können die Fluoreszenzspektren jedes einzelnen Fluorophors durch spezifische Optik getrennt oder "ungemischt" werden, was die Detektion mehrerer Marker ohne Spektralüberlaufermöglicht 3. Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wird zu einem kritischen Ansatz in der Zellbiologie, präklinischen Arzneimittelentwicklung, klinischen Pathologie und Tumorimmunprofilierung4,5,6. Wichtig ist, dass die räumliche Verteilung von Immunzellen (speziell CD8-T-Zellen) als prognostischer Faktor für Patienten mit bestehenden Tumoren dienen kann7.

Verschiedene Ansätze zur Multiplexfluoreszenzfärbung wurden entwickelt und können entweder gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Bei der gleichzeitigen Färbemethode werden alle Antikörper als Cocktail in einem einzigen Schritt zusammengefügte, um das Gewebe zu kennzeichnen. Die UltraPlex-Technologie verwendet einen Cocktail von haptenkonjugierten Primärantikörpern, gefolgt von einem Cocktail fluorophor-konjugierter antihapten sekundärer Antikörper. Die InSituPlex-Technologie8 verwendet einen Cocktail aus einzigartigen DNA-konjugierten Primärantikörpern, die dem Gewebe gleichzeitig zugesetzt werden, gefolgt von einem Amplifikationsschritt und schließlich fluorophorkonjugierten Sonden, die jede einzigartige DNA-Sequenz am primären Antikörper ergänzen. Beide Technologien ermöglichen den Nachweis von vier Markern plus 4',6-Diamino-2-Phenylindole (DAPI) für die kerntechnische Färbung. Zwei weitere Ansätze zur simultanen Multiplexfärbung basieren auf der sekundären Ionenmassenspektrometrie9. Das Hyperion Imaging System verwendet bildgebende Massenzytometrie10, um bis zu 37 Marker zu erkennen. Diese Technologie verwendet einen Cocktail aus metallkonjugierten Antikörpern, um das Gewebe zu färben, und bestimmte Bereiche des Gewebes werden durch einen Laser ablated und auf ein Massenzytometer übertragen, wo die Metallionen nachgewiesen werden. Eine weitere ähnliche Technologie ist der IONPath, der Multiplex-Ionen-Strahl-Bildgebungstechnologie11verwendet. Diese Technologie verwendet ein modifiziertes Massenspektrometrieinstrument und eine Sauerstoffionenquelle anstelle von Laser, um die metallkonjugierten Antikörper abzuschleifen. Während all diese simultanen Multiplex-Färbeansätze den Nachweis mehrerer Marker ermöglichen, sind die Kosten für die Konjugation von DNA, Hapten oder Metallen zu Antikörpern, der Gewebeverlust durch Ablation und die umfangreiche Bildverarbeitung zum Entmischen nicht zu unterschätzen. Darüber hinaus sind Kits und Färbeprotokolle derzeit nur für FFPE-Gewebe verfügbar, und die Entwicklung von kundenspezifischen Panels erfordert zusätzlichen Zeit- und Aufwand.

Die sequenzielle Multiplex-Färbungsmethode hingegen umfasst die Kennzeichnung des Gewebes mit einem Antikörper auf einen Marker,, um den Antikörper zu entfernen, gefolgt von sequenziellen Wiederholungen dieses Prozesses, um mehrere Marker12zu beschriften. Die Tyramidsignalverstärkung (TSA) ist die am häufigsten verwendete sequenzielle Multiplexing-Methode. Zwei weitere Multiplexing-Technologien verwenden eine Kombination aus simultanen und sequentiellen Färbemethoden. Die CODEX-Plattform13 verwendet einen Cocktail von Antikörpern, die zu einzigartigen DNA-Oligonukleotidsequenzen konjugiert sind, die schließlich mit einem Fluorophor mit einem indizierten Polymerisationsschritt gekennzeichnet werden, gefolgt von Bildgebung, Abisolieren und Wiederholen des Prozesses, um bis zu 50 Marker zu erkennen. Der MultiOmyx Multiplex-Färbungsansatz14 ist eine Iteration der Färbung mit einem Cocktail von drei bis vier fluorophorkonjugierten Antikörpern, bildgebend, das Abschrecken der Fluorophore und die Wiederholung dieses Zyklus, um bis zu 60 Marker auf einem einzigen Abschnitt zu erkennen. Ähnlich wie bei der gleichzeitigen Multiplex-Färbungsmethode, während eine breite Palette von Markern erkannt werden kann, ist die Zeit, die mit Färbung, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse verbunden ist, umfangreich. Der Stripping/Quenching-Schritt beinhaltet das Erhitzen und/oder Bleichen der Gewebeprobe und somit wird der sequenzielle Multiplex-Färbungsansatz häufig an FFPE-Geweben durchgeführt, die die Gewebeintegrität beim Erhitzen oder Bleichen erhalten.

Formalin Fixierung und nachfolgende Paraffin-Einbettung wird leicht in einer klinischen Umgebung durchgeführt, Gewebeblöcke sind einfach zu lagern, und mehrere Multiplex-Färbung Protokolle sind verfügbar. Die Verarbeitung, Einbettung und Deparaffinisierung von FFPE-Geweben sowie Antigenabruf15, ein Prozess, bei dem Antikörper besser auf Epitope zugreifen können, ist jedoch zeitaufwändig. Darüber hinaus trägt die Verarbeitung in FFPE-Geweben zur Autofluoreszenz16 bei und maskiert Zielepitope, was zu der Variabilität und dem Mangel an Antikörperklon führt, die zum Nachweis von Antigenen in FFPE-Geweben17,18,19zur Verfügung stehen. Ein Beispiel ist die menschliche Leukozytenantigen (HLA) Klasse I Allele20. Im Gegensatz dazu beinhaltet das Einfrieren von Geweben keine umfangreichen Verarbeitungsschritte vor oder nach der Fixierung, wodurch die Notwendigkeit eines Antigenabrufs21,22umgangen wird und es für die Erkennung einer breiteren Palette von Zielen von Vorteil ist. Daher kann die Verwendung von gefrorenem Gewebe für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wertvoll sein, um Ziele für präklinische und klinische Studien zu detektieren.

Angesichts der oben genannten Einschränkungen bei der Verwendung von FFPE-Geweben haben wir gefragt, ob multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben durchgeführt werden kann. Um diese Frage zu beantworten, testeten wir eine simultane Multiplex-Färbungsmethode mit einem Panel von fluorophorkonjugierten Antikörpern, um mehrere Antigene zu erkennen, und analysierten die Färbung mit einem semiautomatisierten multispektralen Bildgebungssystem. Wir konnten innerhalb von 90 min bis zu sechs Marker in einem einzigen Gewebeabschnitt färben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Mausmilz und HLF16 Maustumorgewebe23 wurden aus unserem Labor gewonnen. Menschliches Mandelgewebe wurde von einem kommerziellen Anbieter gekauft. Einzelheiten finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Gewebeeinbettung

  1. Einbetten von frischem Gewebe in OCT (optimale Schnitttemperatur) Lösung und Schnappgefrieren mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.
  2. Gewebe bei -80 °C lagern.

2. Kryosektion

  1. Schneiden Sie die Abschnitte in einem Kryostat mit Temperaturen von -25 °C.
    HINWEIS: Die bevorzugte Schnittdicke kann angepasst werden, um gestochen scharfe Bilder zu erzeugen.
  2. Platzieren Sie Abschnitte auf geladenen Glasgletten.
  3. Die Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur (RT) vor der Fixierung in der Histologie für eiskaltes Aceton für 10 min.
    HINWEIS: Aceton verursacht die Gerinnung von wasserlöslichen Proteinen und extrahiert Lipide, wirkt sich aber nicht auf kohlenhydrathaltige Bestandteile aus. Im Gegensatz dazu, formalin konserviert die meisten Lipide und hat wenig Einfluss auf Kohlenhydrate24. Die Wahl des Fixativs ist wichtig, abhängig von der Wahl des Markers, der erkannt wird.
  4. Bewahren Sie die Dias bei -20 °C auf.

3. Auswahl von Antikörpern und Fluorophoren

HINWEIS: Vor der Gewebefärbung müssen Antikörperklone validiert werden, die ihre Antigene, die sie interessieren, innerhalb sequenzieller Abschnitte aus acetonfestem Gewebe robust und gezielt färben. Einige Antikörper können eine andere Fixierung erfordern, und ihre Kompatibilität mit anderen Antikörpern im Panel muss ebenfalls empirisch bestimmt werden. Das Ziel ist auch, Fluorophore mit minimalen Überlappungen zu identifizieren, die mit den Epifluoreszenzfiltern für DAPI, FITC, Cy3, Texas Red und Cy5 nachgewiesen werden können.

  1. Bestätigen Sie die Färbung durch konventionellen IHC- oder Immunfluoreszenz-Nachweis (IF) in Gewebeabschnitten mit bekanntem Expressionszielantigen.
  2. Bereiten Sie mit den am halbautomatischen Bildgebungssystem verfügbaren Anregungs- und Emissionsfiltersätzen und nach dem Testen verschiedener Kombinationen fluorophorkonjugierter Primärantikörper Fluorophore vor, die minimale spektrale Überlappung haben (siehe Tabelle 1).

4. Färbung

HINWEIS: Die Geweberehydratation und Diawaschachen wurden in einem Coplin-Glas durchgeführt. Die Blockier- und Antikörperinkubationsschritte wurden in einer befeuchteten Diabox durchgeführt.

  1. Lassen Sie die Dias für 5-10 min auf RT erwärmen.
  2. Rehydrat in Phosphat gepufferter Saline (PBS) für 5 min.
  3. Führen Sie einen Blockierungsschritt vor der Färbung von Geweben mit Antikörpern durch. Verwenden Sie für Mausabschnitte eine spezielle Blockierlösung (siehe Materialtabelle) für 10 min bei RT. Für menschliche Abschnitte verwenden Sie 10% normales gepooltes menschliches Serum (NHS), das in PBS für 15 min bei RT verdünnt wird.
    HINWEIS: Je nach den zu verwendenden Folgeverfahren können bei Bedarf verschiedene Blockierpuffer getestet werden, um die spezifischen Eigenschaften der Abschnitte beizubehalten.
  4. Waschen Sie die Dias für 5 min in PBS nach der Blockierung.
  5. Für Multiplex-Färbung, bereiten Sie einen Cocktail von Antikörpern mit kompatiblen Fluorophoren bei vorgegebenen optimalen Verdünnungen.
  6. Fügen Sie den Cocktail von fluorophor-konjugierten Antikörpern zu den Dias hinzu. Für die Einmarkerfärbung nur den primär konjugierten Antikörper zum Dia hinzufügen.
  7. Schließen Sie eine Kontrollrutsche ein, die dem gleichen Färbeverfahren unterzogen wird, ohne dass ein primär konjugierter Antikörper zufügnet.
  8. Inkubieren Sie die Dias für 1 h bei RT im Dunkeln und waschen Sie dann die Dias 2x mit PBS für jeweils 5 min. Von hier aus wird die resultierende Folie als Multiplex-befleckt bezeichnet.
  9. Um der Folie entgegenzuwirken, fügen Sie DAPI dem Multiplex-befleckten Dia hinzu, brüten Sie 7 min im Dunkeln bei RT und waschen Sie die Dias 2x mit PBS für jeweils 5 min. Nicht eingefärbte und ungefärbte Dias gegenstainen.
  10. Um den Deckel abzudecken, fügen Sie einen Tropfen des Montagemediums hinzu und legen Sie den Glasdeckel vorsichtig über das Gewebe.

5. Vorbereiten einer Spektralbibliothek

  1. Bildaufnahme
    1. Stellen Sie die Lampenleistung auf 100 % ein. Normalerweise ist die Leistung auf 10% eingestellt, da die Fluoreszenzdetektion auf FFPE-Geweben einen Signalverstärkungsschritt enthält.
    2. Beginnen Sie mit dem Öffnen der Mikroskop-Betriebssoftware (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Wählen Sie Protokoll bearbeiten und dann Neues Protokollaus.
    4. Geben Sie einen "Protokollnamen" an, und wählen Sie Fluoreszenz unter Imaging-Modusaus, und geben Sie einen "Studiennamen" an.
    5. Legen Sie die eingefärbten Dias auf die Bühne und untersuchen Sie jeden Marker in seinem entsprechenden Fluoreszenzkanal, um die Färbung zu gewährleisten. Wählen Sie einen Bereich auf dem Gewebe aus, der das stärkste Signal für den Marker ausdrückt.
    6. Passen Sie die Belichtungszeiten mit den Optionen Autofokus und Autoexpose an.
    7. Erfassen Sie Snapshots für die eingefärbten und ungefärbten Folien, und speichern Sie das Protokoll.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in Machine Learning-Software (siehe Tabelle der Materialien) durchgeführt, indem die einzelnen gebeizten und ungefärbten Dias verwendet werden, um bestimmte Färbungen zu überprüfen und Antikörper-Cross-Talk zu bestimmen.
    8. Laden Sie unter der Registerkarte Bibliotheken erstellen in der Software jedes einzelne Diabild, wählen Sie den entsprechenden Fluor aus, und klicken Sie auf Extrahieren. Die Software extrahiert automatisch das fluoreszenzsignal, das im Fluor ausgewählt wurde.
    9. Um die extrahierte Farbe zu speichern, klicken Sie auf Speichern im Speicher. Eine "Neue Gruppe" kann erstellt oder die extrahierte Farbe in einer vorhandenen Gruppe gespeichert werden.
  2. Überprüfen der Spektralbibliothek
    1. Überprüfen Sie für jeden Filtersatz das Fenster der Emissionsspektralkurve, das sich rechts neben dem extrahierten Bild befindet.
      HINWEIS: Das extrahierte Signal ist korrekt, wenn die Spektralkurve nur in den Filtersätzen beobachtet wird, in denen das Fluorophor nachgewiesen wird. Wenn eine Spektralkurve im falschen Filtersatz beobachtet wird, kann dies bedeuten, dass entweder das im Filtersatz erwartete primärsignal nicht stark genug ist, oder die Software ein anderes Signal erkennt, das zu hoch ist, möglicherweise aufgrund spektraler Überlappung. Versuchen Sie in diesem Fall zunächst, mit dem Werkzeug Verarbeitungsbereiche zeichnen Bereiche um Bereiche zu zeichnen, die den Fluoreszenzmarker und die Autofluoreszenz im Bild ausdrücken. Dies trainiert die Software, um das wahre Signal zu erkennen und alle störenden Signale zu entfernen. Wenn dies nicht funktioniert, wiederholen Sie den Färbevorgang für den eingefärbten Schlitten, um verschiedene Antikörpertitrationen zu testen.

6. Multispektrale Bildgebung

HINWEIS: Nachdem die Spektralbibliothek erstellt und überprüft wurde, führen Sie die folgenden Schritte für die Multiplex-befleckte Folie aus.

  1. Ganzer Dia-Scan
    1. Passen Sie fokussieren und Belichtungszeiten auf dem Multiplex-befleckten Schlitten anpassen, wie unter Abschnitt 5.1erwähnt.
    2. Erstellen Sie unter Folien scanneneine neue Aufgabe, und wählen Sie das oben gespeicherte Protokoll aus.
    3. Führen Sie einen ganzen Diascan auf der Multiplex-befleckten Folie durch.
    4. Öffnen Sie mit der gesamten Folienscansoftware das gesamte Diascanbild. Dieses Bild wurde nicht spektral ungemischt.
    5. Wählen Sie mit dem Stamp- oder ROI-Tool Bereiche von Interesse (ROI) für das gesamte Folienscanbild aus. Diese ROIs werden mit den belichtungszeiten in 6.1.1 gescannt, die für die spektrale Unmischung und Analyse verwendet werden.
    6. Klicken Sie auf Prozessfolie, um ROIs mit 20-facher Vergrößerung zu erwerben
  2. Spektrales Unmixing
    1. Sobald die ROIs erworben wurden, laden Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte Manuelle Analyse die multiplexen gebeizten Bilder, indem Sie unter Dateiöffnen klicken.
    2. Klicken Sie im Dropdown-Menü Spektralbibliotheksquelle auf Fluors auswählen.
    3. Ein neues Fenster wird geöffnet. Wählen Sie hier die obige Spektralbibliothek oder -gruppe aus.
    4. Laden Sie das unbefleckte Folienbild. Klicken AF Sie auf das AF-Farbmarkierungssymbol oberhalb der ausgewählten Spektralbibliothek, und zeichnen Sie eine Linie oder region auf der unbefleckten Folie, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu identifizieren.
    5. Weisen Sie auf der Registerkarte Marker und Farben bearbeiten Namen für jede Markierung zu. In diesem Schritt können Pseudofarben zugewiesen werden.
      HINWEIS: Die Farbe für das Autofluoreszenzbild ist standardmäßig DarkSlateGray. Ändern Sie dies in Schwarz.
    6. Klicken Sie auf Alle vorbereiten.
  3. Überprüfen spektral ungemischter Bilder
    HINWEIS:     Wenn der Spektral-Unmixing-Schritt abgeschlossen ist, wird ein zusammengesetztes Bild erstellt, das aus allen Farben besteht.
    1. Klicken Sie auf das Symbol "Auge bearbeiten". Hier kann jede Farbe im "Komponentendisplay" ausgeschaltet oder eingeschaltet werden, um die Färbung jedes einzelnen Markers anzuzeigen.
    2. Überprüfen Sie visuell die Färbung und die Morphologie der Zellen, um sicherzustellen, dass es keine Überlappung des Markers gibt, es sei denn, er ist biologisch relevant. Ein Pathologe kann auch helfen, die Färbung zu überprüfen.
      HINWEIS: Die Färbung auf dem Multiplex-Dia sollte validiert werden, indem jeweils ein Fluorophor weggelassen und das Färbemuster überprüft wird. Darüber hinaus wird die Validierung auch dazu beitragen, starke Fluorophore zu identifizieren, die in benachbarten Spektren aufgrund von Antikörper-Cross-Talk oder Durchblutung auftreten.
    3. Klicken Sie für Pathologieansichten, die Hellfeldbilder für jeden Fluoreszenzmarker simulieren, auf die Schaltfläche Komponentenbild auswählen. Wählen Sie hier einen Marker aus, um ein simuliertes Hellfeldbild anzuzeigen.

7. Analysieren von multispektralen Bildern über Zellsegmentierung und Phenotypisierung

HINWEIS: Nach der Überprüfung des spektral ungemischten Bildes kann die Zellsegmentierung mit der Machine Learning-Software durchgeführt werden, die Schritt-für-Schritt-Anleitungen liefert. Die Gewebesegmentierung wurde hier nicht durchgeführt. Wenn das Panel einen oder mehrere gewebespezifische Marker enthält und insbesondere, wenn das Gewebe chaotisch ist, sollte eine Gewebesegmentierung durchgeführt werden.

  1. Wählen Sie "Zytoplasma" und "Membran" unter der Option 'Segment'.
    HINWEIS: "Nuclei" ist standardmäßig ausgewählt.
  2. Wählen Sie einen Marker aus dem Bedienfeld aus. Konfigurieren Sie den Marker, um entweder Kerne, Zytoplasma oder Membran zu erkennen. Beispielsweise kann DAPI ausgewählt werden, um Kerne und CD3 für die Membran zu erkennen.
  3. Klicken Sie auf die Auslassungsschaltfläche ('...'), um eine Option unter "Verwenden Sie dieses Signal zu finden" auszuwählen. Beispiel: 'nuclei' für DAPI. Für die Segmentierung können mehrere Marker aus dem Bedienfeld ausgewählt werden.
    HINWEIS: Wählen Sie für Zytoplasma- oder Membranmarker die Option "Verwenden Sie dieses Signal, um die nukleare Segmentierung zu unterstützen".
  4. Die Software erkennt und erstellt automatisch eine Maske für den Kern, das Zytoplasma und die Membran im Bild.
  5. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen für die Segmentierung "maskiert" sind. Um das anzupassen, wechseln Sie zur Pathologieansicht für den in 7.3ausgewählten Marker. und verwenden Sie die Konfigurationsoptionen in der Software.
  6. Klicken Sie auf "Segment Alle", um Zellen zu segmentieren.
  7. Fahren Sie nach der Zellsegmentierung mit Phänotypisierungszellen fort. Wählen Sie in diesem Schritt die Marker aus, die für die Phänotypisierung benötigt werden, und wählen Sie manuell mindestens fünf Zellen aus, die mit dem ausgewählten Marker hell befleckt sind. Dadurch wird die Software so trainiert, dass alle Zellen, die mit dem gewählten Marker im Bild befleckt sind, automatisch erkannt werden.
  8. Es wird eine Phänotypzuordnung erstellt. Analysieren Sie, um sicherzustellen, dass die mit dem Marker befleckte Zelle korrekt phänotypisiert ist.
    HINWEIS: Zellphänotypisierung kann ein iterativer Prozess sein. Wenn die Software nicht in der Lage ist, die Zellen richtig zu phänotypisieren, bedeutet dies, dass das Training unzureichend oder falsch ist. In diesem Fall muss der Benutzer manuell mehr Zellen auswählen und die Software neu trainieren und diesen Schritt wiederholen, bis der Benutzer mit dem Training zufrieden ist.
  9. Erstellen Sie eine Gruppe mit dem Namen "Andere" und schließen Sie Zellen ein, die für keinen der Marker befleckt sind.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um die Software zu trainieren, um alle ungefärbten Zellen von der Phänotypisierung auszuschließen.

8. Exportieren von Bildern und Analysetabellen

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um das Bedienfeld "Exporteinstellungen" anzuzeigen.
  2. Klicken Sie im "Export-Verzeichnis" auf Durchsuchen, um einen Speicherort zum Exportieren der Bilder auszuwählen.
  3. Wählen Sie in den "Bildexportoptionen" das Bildausgabeformataus.
  4. Wählen Sie in der Liste "Bilder zum Exportieren" die zu exportierenden Bilder aus. "Composite image" ist das letzte pseudofarbene ungemischte Bild. "Pathology Views" sind die einzelnen simulierten Hellfeldbilder und die "Component Images (Multi-Image TIFF)" ist eine Multi-Image-TIFF-Datei mit Komponentendaten, die von Drittanbieter-Analysesoftware verwendet werden kann.
  5. Klicken Sie auf "Export for All", um die Bilder zu exportieren.
    HINWEIS: Tabellen aus der Analyse können in diesem Schritt auch ausgewählt und exportiert werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Nachweis von einscheinigten Markern auf gefrorenen Milzabschnitten
Da das halbautomatische Bildgebungssystem ein Flüssigkristall-Tunable-Filter-System (LCTF) verwendet, das einen größeren Bereich der Wellenlängendetektion25ermöglicht und hier keine Signalverstärkungsschritte durchgeführt wurden, haben wir zunächst die Detektion unserer primär konjugierten Antikörper für jeden Marker auf dem Mikroskop optimiert. Ein Beispiel ist in Abbildung 1darges...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Gefrorene Gewebe wurden ausgiebig für die mIF-Bildgebung verwendet, um traditionell drei bis vier Marker31 auf einem Gewebe mit der direkten und indirekten Methode32zu erkennen. Bei der direkten Methode werden Antikörper mit fluoreszierenden Farbstoffen oder Quantenpunkten33 konjugiert, um das Gewebe zu kennzeichnen, während bei der indirekten Methode ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet wird, um das Gewebe zu kennzeichnen, gefolgt von einem...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Anleitung zur Bildgebung und Analyse wurde vom Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core an der University of Illinois at Chicago mit Unterstützung des Büros des Vizekanzlers für Forschung bereitgestellt. Die Arbeit wurde von NIH/NCI RO1CA191317 an CLP, von NIH/NIAMS (SBDRC Grant 1P30AR075049-01) an Dr. A. Paller und mit Unterstützung des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center an den Immunotherapy Assessment Core an der Northwestern University unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aceton (histologische Qualität)Fisher ScientificA16F-1GALFixiergewebe
Alexa Fluor 488 Anti-MausCD3 BioLegend 100212Klon - 17A2; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humaner CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Klon - L26; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 555 Maus anti-Ki-67BD Biosciences558617Primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 594 Anti-Human-CD3BioLegend300446-Klon- UCHT1; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 594 Anti-Maus-CD8aBioLegend 100758Klon - 53-6.7; Primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 647 Anti-Human-CD8aBioLegend 372906Klon - C8/144B; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD206 (MMR)BioLegend141711Klon - C068C2; primärer konjugierter Antikörper
Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD4 AntikörperBioLegend100426Klon - GK1.5; primärer konjugierter Antikörper
C57BL/6 MausRiver Laboratories27Gefrorenes Mausgewebe für das multispektrale Training
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EARehydrieren und Waschen von Objektträgern
DAPI SolutionBD Biosciences564907Nukleinsäurefleck
Diamond White Glass Charged SlidesDOT ScientificDW7590WAnhaftende Gewebeschnitte
Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung 1x (ohne Ca und Mg)Fisher ScientificMT21031CVWasch- und Verdünnungsmittel
Gold Seal Cover SlipsThermoFisher Scientific3306Schutz von gefärbtem Gewebe
Menschliche normale Mandeln OCT gefrorener GewebeblockAMSBioAMS6023Menschliches gefrorenes Gewebe für die multispektrale Färbung
Menschliches Serum 1xGemini Bio-Products100-512Blockierungs- und Verdünnungsmittel für menschliches Gewebe
inFormAkoya BiosciencesVersion 2.4.1Software für maschinelles Lernen
PerCP/Cyanin5.5 Anti-Human-CD4BioLegend300529Klon - RPA-T4; primärer konjugierter Antikörper
PerCP-Cy 5.5 Ratte Anti-CD11bBD Biosciences550993Klon - M1/70; primärer konjugierter Antikörper
PhänochartAkoya BiosciencesVersion 1.0.8Software für den gesamten Objektträger
ProLong Diamond Antifade EindeckmittelThermoFisher ScientificP36965Eindeckmedium
Forschung KryostatLeica BiosystemsCM3050 SGewebe
schneiden Superblock 1xThermoFisher Scientific37515Blockieren von Mausgewebe
Tissue-Tek O.C.T LösungSakura Finetek4583Einbetten von Geweben
Vectra 3.0 Automatisiertes quantitatives Bildgebungssystem für die Pathologie, 6 ObjektträgerAkoya BiosciencesCLS142568Halbautomatische multispektrale Bildgebung System
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersion 3.0.5Software zum Bedienen des Mikroskops
Charles

Referenzen

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752(2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47(2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479(1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017(2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03(2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652(2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338(2019).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Fluorophor-KombinationenErstellung einer SpektralbibliothekAnalyse mittels maschinellem LernenZellsegmentierungAntikörper-Färbeprotokollspektrales UnmixingWhole-Slide-ScanPhänotyp-Mapping
Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.