Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators zur Überwachung von Echtzeitveränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus.

Zusammenfassung

Säugetier-Spermien erwerben Befruchtungsfähigkeit im weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Prozess, der als Kapitulation bekannt ist. Capacitation-assoziierte Prozesse benötigen Energie. Es bleibt eine laufende Debatte über die Quellen, die die ATP erzeugen, die Spermien progressive Motilität, Kapitulation, Hyperaktivierung, und Akrosomenreaktion antreibt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators als Werkzeug, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Maus-Sperma-Kapazität zu analysieren. Mit H⁺- und_O2- empfindlichen Fluorophoren ermöglicht diese Methode die Überwachung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit in nicht-kapazitierten oder kapazitiven Spermien. Die Verwendung dieses Assays in Gegenwart verschiedener Energiesubstrate und/oder pharmakologischer Aktivatoren und/oder Inhibitoren kann wichtige Einblicke in den Beitrag verschiedener Stoffwechselwege und den Schnittpunkt zwischen Signalkaskaden und Stoffwechsel während der Spermienkapitulation liefern.

Einleitung

Die Anwendung der Massenspektrometrie hat die Untersuchung des Stoffwechsels revolutioniert. Gezielte metabolische Profilierung und metatobiomische Tracing ermöglichen eine präzise Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel. Die erfolgreiche Durchführung der Metabolomik erfordert jedoch umfangreiche Schulungen, erfahrenes Personal und teure, hochempfindliche Massenspektrometer, die nicht für jedes Labor verfügbar sind. In den letzten Jahren ist die Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators, wie z. B. des Seahorse XFe96, als Ersatzmethode zur Messung von Veränderungen im Energiestoffwechsel in verschiedenen Zelltypen^1,

Protokoll

Spermien werden von 8-16 Wochen alten CD-1 männlichen Mäusen gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Weill Cornell Medicine genehmigt.

1. Tag vor dem Assay

1. Vorbereitung von Sensorpatrone und extrazellulärem Flussanalysator-Kalibrant
   1. Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem XFe96 Extracellular Flux Assay Kit und stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte.
   2. Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 ml doppeldestilliertem_H2O mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie jedem Brunnen d....

Ergebnisse

Diese Methode verwendet einen extrazellulären Flussanalysator, um Echtzeit-Änderungen in der Rate der Glykolyse und Oxphos während der Maus Sperma-Capacitation zu überwachen. Abbildung 4 zeigt ein beispielhaftes Experiment, bei dem Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-DG und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert wurden. Das Energiesubstrat im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer und die pharmako.......

Diskussion

Der Verlust der Spermienkapazität in Ermangelung bestimmter metabolischer Substrate oder kritischer Stoffwechselenzyme ergab den Energiestoffwechsel als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung. Ein metabolischer Schalter während der Zellaktivierung ist ein etabliertes Konzept in anderen Zelltypen, aber wir beginnen gerade zu verstehen, wie Spermien ihren Stoffwechsel an den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation anpassen. Mit einem extrazellulären Flussanalysator haben wir ein leicht anwendbares Werk.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthin	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; Herstellung einer 500 mM Stammlösung in DMSO (111,1 mg/ml) und Lagerung in kleinen Aliquots
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	Anta; Eine 5 mM Stammlösung in DMSO (2,7 mg/ml) herstellen und in kleinen Aliquoten
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalin A, Lektin aus Arachis hypogaea (Erdnuss)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glukose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesie	Henry Schein Tiergesundheit	1169567761	Isofluran-Magnesiumsulfat
	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosin 3',5'-cyclisches Monophosphat-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Kaliumdihydrogenphosphat	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenon	Cayman Chemical Company	13995	Rot; Herstellung einer 5 mM Stammlösung in DMSO (2mg/ml) und Lagerung in kleinen Aliquoten
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-Natriumchlorid
	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Ausrüstung und Materialien
12-Kanal-Pipette 10-100 μ L	eppendorf	ES-12-100
12-Kanal-Pipette 50-300 μ L	vwr	613-5257
37 ° C, non-CO2 Inkubator	vwr	1545
5 mL Cetrifuge Röhrchen	eppendorf	30119380
50 mL konische Zentrifugenröhrchen	vwr	76211-286
Zentrifuge mit Plattenadapter	Thermo Scientific	IEC FL40R
Dissektionskit	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Inverses Phasenkontrastmikroskop mit 40X Objektiv	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, geteilt	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, geteilt	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Auch als XFe96 FluxPak mini (102601-100) mit 6 statt 18 Patronen erhältlich.