Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

7.8K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/60815

⸱

22. Januar 2020

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Weill Cornell Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators zur Überwachung von Echtzeitveränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus.

Zusammenfassung

Säugetier-Spermien erwerben Befruchtungsfähigkeit im weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Prozess, der als Kapitulation bekannt ist. Capacitation-assoziierte Prozesse benötigen Energie. Es bleibt eine laufende Debatte über die Quellen, die die ATP erzeugen, die Spermien progressive Motilität, Kapitulation, Hyperaktivierung, und Akrosomenreaktion antreibt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators als Werkzeug, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Maus-Sperma-Kapazität zu analysieren. Mit H+- undO2- empfindlichen Fluorophoren ermöglicht diese Methode die Überwachung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit in nicht-kapazitierten oder kapazitiven Spermien. Die Verwendung dieses Assays in Gegenwart verschiedener Energiesubstrate und/oder pharmakologischer Aktivatoren und/oder Inhibitoren kann wichtige Einblicke in den Beitrag verschiedener Stoffwechselwege und den Schnittpunkt zwischen Signalkaskaden und Stoffwechsel während der Spermienkapitulation liefern.

Einleitung

Die Anwendung der Massenspektrometrie hat die Untersuchung des Stoffwechsels revolutioniert. Gezielte metabolische Profilierung und metatobiomische Tracing ermöglichen eine präzise Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel. Die erfolgreiche Durchführung der Metabolomik erfordert jedoch umfangreiche Schulungen, erfahrenes Personal und teure, hochempfindliche Massenspektrometer, die nicht für jedes Labor verfügbar sind. In den letzten Jahren ist die Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators, wie z. B. des Seahorse XFe96, als Ersatzmethode zur Messung von Veränderungen im Energiestoffwechsel in verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5populär geworden.

Spermien sind hochspezialisierte motile Zellen; deren Aufgabe es ist, das väterliche Genom an die Oozyte zu liefern. Sperma verlassen den männlichen Fortpflanzungstrakt nach der Ejakulation sind noch funktionell unreif und können die Eizelle nicht befruchten, weil sie nicht in der Lage sind, die Gewänder der Eizellen zu durchdringen. Spermien erwerben Befruchtungskompetenz, wenn sie durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Reifungsprozess, bekannt als Capacitation6,7,transportiert werden. Frisch ejakulierte Spermien oder Spermien, die aus der Cauda epididymis seziert werden, können in vitro durch Inkubation in definierten Kapazitationsmedien, die Ca2+, Bicarbonat (HCO3-) oder einen zelldurchlässigen cAMP analog (z. B. Dibutyryl-cAMP), ein Cholesterin-Akzeptor (z. B. Rinderserumalbumin, BSA) und eine Energiequelle (z. B. Glukose). Während der Kapitulation modifizieren Spermien ihr Motilitätsmuster in einen asymmetrischen Flagellar-Beat, der einen Schwimmmodus namens Hyperaktivierung8,9darstellt, und sie werden kompetent, um die Akrosomenreaktion7zu durchlaufen, wo proteolytische Enzyme freigesetzt werden, die die Gewänder der Eizellen verdauen. Diese Prozesse erfordern Energie, und ähnlich wie somatische Zellen, Spermien erzeugen ATP und andere hochenergetische Verbindungen über Glykolyse sowie mitochondrialen TCA-Zyklus und oxidative Phosphorylierung (Oxphos)10. Während mehrere Studien zeigen, dass Glykolyse notwendig und ausreichend ist, um die Spermien-Kapazität11,12,13,14zu unterstützen, ist der Beitrag von Oxphos weniger klar. Im Gegensatz zu anderen Zelltypen, bei denen die Glykolyse physikalisch an den TCA-Zyklus gekoppelt ist, sind Spermien stark kompartimisiert und sollen diese Prozesse in separaten Flagellarkomden aufrechterhalten: Das Mittelstück konzentriert die mitochondriale Maschinerie, während die Schlüsselenzyme der Glykolyse auf das Hauptstück15,16beschränkt zu sein scheinen. Diese Abschottung führt zu einer anhaltenden Debatte darüber, ob Pyruvat, das im Hauptstück durch Glykolyse produziert wird, mitochondriale Oxphos im Mittelstück unterstützen kann und ob ATP, die von Oxophs im Mittelstück produziert wird, in der Lage wäre, ausreichend schnell entlang der Länge des Flagellums zu diffundieren, um den Energiebedarf in distalen Teilen des Hauptteils17,18,19zu unterstützen. Es gibt auch Unterstützung einer Rolle für Oxphos in Spermien-Capacitation. Oxphos ist nicht nur energetisch günstiger als Glykolyse, erzeugt 16-mal mehr ATP als Glykolyse, sondern Mittelstückvolumen und mitochondrialer Gehalt sind direkt mit der Reproduktivfitness bei Säugetierarten korreliert, die einen größeren Grad des Wettbewerbs zwischen Männchen fürKumpels zeigen 20. Um diese Fragen zu beantworten, sind Methoden zur Untersuchung der relativen Beiträge von Glykolyse und Oxphos während der Spermien-Kapazität erforderlich.

Tourmente et al. wandten einen 24-Well extrazellulären Flussanalysator an, um den Energiestoffwechsel eng verwandter Mausarten mit signifikant unterschiedlichen Spermienleistungsparametern zu vergleichen21. Anstatt die basalen ECAR- und OCR-Werte von nicht kapazitierten Spermien zu melden, passen wir hier ihre Methode mit einem 96-Well extrazellulären Flussanalysator an, um Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Flüchtigkeit der Maus in Echtzeit zu überwachen. Wir haben eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Glykolyse und Oxphos in Echtzeit in Spermien mit schlagenden Flagella in bis zu zwölf verschiedenen Versuchsbedingungen zu überwachen, indem der Fluss von Sauerstoff(O2) und Protonen (H+) gemessen wird (Abbildung 1A). Durch den Abbau von Pyruvat zu Laktat während der Glykolyse und die Produktion vonCO2 über den TCA-Zyklus extrudieren nicht-kapazitierte und kapazitierte Spermien H+ in die Assaymedien, die vom extrazellulären Flussanalysator über H+-empfindliche Fluorophore zur Sondenspitze einer Sensorpatrone immobilisiert werden. Parallel dazu wird derO2-Verbrauch durch oxidative Phosphorylierung überO2-empfindlicheFluorophore immobilisiert, die zur gleichen Sondenspitze immobilisiert sind (Abbildung 1B). Der effektive Nachweis des freigesetzten H+ und verbrauchten O2 erfordert einen modifizierten Spermienpuffer mit geringer Pufferkapazität ohne Bicarbonat oder Phenolrot. Um also in Abwesenheit von Bicarbonat eine Kapacitation zu induzieren, haben wir die Verwendung eines zelldurchlässigen cAMP-Analogos übernommen, das zusammen mit dem Breitbereichs-PDE-Hemmer IBMX22injiziert wurde. Drei zusätzliche unabhängige Injektionsöffnungen ermöglichen die Injektion von pharmakologischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren, was die Echtzeitdetektion von Veränderungen der zellulären Atmung und Glykolyserate aufgrund experimenteller Manipulation enciert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Spermien werden von 8-16 Wochen alten CD-1 männlichen Mäusen gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Weill Cornell Medicine genehmigt.

1. Tag vor dem Assay

  1. Vorbereitung von Sensorpatrone und extrazellulärem Flussanalysator-Kalibrant
    1. Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem XFe96 Extracellular Flux Assay Kit und stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte.
    2. Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 ml doppeldestilliertemH2O mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie jedem Brunnen der Versorgungsplatte 200 lH2O hinzu. Legen Sie die Sensorpatrone wieder in die Nutzplatte und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.
      HINWEIS: Die Kartusche muss mindestens 4 h hydratisiert werden.
    3. Aliquot 25 ml des extrazellulären Flussanalysators kalibrieren in ein 50 ml konisches Rohr und inkubieren es über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.
  2. Herstellung von ConA-beschichteten Mikroplatten
    1. 2,5 mg ConA in 5 ml doppeldestilliertemH2O auflösen, um einen 0,5 mg/ml (w/v) Vorrat zu erstellen.
    2. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jeden Brunnen einer extrazellulären Flussanalysator 96-Well-Platte mit 50 l der 0,5 mg/ml Con A-Lösung. Lassen Sie den Deckel offen und lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
      HINWEIS: Mehrere Platten können auf einmal beschichtet und bis zu vier Wochen bei 4 °C gelagert werden, bis sie einsatzbereit sind.
  3. Vorbereitung des Spermienpuffers
    1. Bereiten Sie 250 ml extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer mit niedrigen HEPES mit 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM Glukose und 1 mM HEPES. Den Puffer auf 37 °C erhitzen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen.

2. Tag des Assays

  1. Vorbereitung für die Kartuschenkalibrierung
    1. Ersetzen Sie die H2O in der Nutzplatte durch 200 l XF-Kalibrant pro Bohrkörper und inkubieren Sie mindestens 1 h in einem Nicht-CO2 37 °C-Inkubator.
      HINWEIS: Anstelle von kalibrierenden, sterilgefilterten PBS kann pH 7.4 verwendet werden.
    2. 50 ml TYH-Puffer bei 37 °C erhitzen.
  2. Generieren einer Wellenvorlage für den extrazellulären Flussanalysator
    1. Schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie die Temperatur auf 37 °C stabilisieren.
    2. Öffnen Sie die Wellensoftware und entwerfen Sie eine neue Vorlage, indem Sie eine leere Vorlage öffnen (siehe Ergänzungsdatei 1, Wellenvorlage).
    3. Öffnen Sie die Registerkarte Gruppendefinitionen. Definieren Sie Assay-Medien als TYH; pH 7.4 und Zelltyp als Maussperma, lassen Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer. Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung; In diesem Beispiel gibt es 6 verschiedene Gruppen (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) und 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) zur Induzieren von Kapatizien, 2-Deoxyglucose (2-DG) als Glykolysehemmer, Antimycin A (AntA) und Roton (Rot) als Inhibitor des komplexen III und des komplexen I der Elektronentransportkette.
      HINWEIS: Um die Variabilität zwischen den Brunnen zu berücksichtigen, sollten mindestens 7-8 Brunnen pro Zustand parallel gemessen werden.
    4. Öffnen Sie die Registerkarte "Platte" und definieren Sie die Plattenkarte, indem Sie Gruppen bestimmten Brunnen zuweisen.
      HINWEIS: Die vier Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) werden mit TYH-Puffer (kein Sperma) gefüllt und später für die Hintergrundsubtraktion verwendet.
    5. Öffnen Sie die Registerkarte Protokoll, fügen Sie 4 verschiedene Messzyklen hinzu, wählen Sie den jeweiligen Port aus und bearbeiten Sie die Messdetails (Abbildung 2, Tabelle 1). Markieren Sie die Maßnahme nach der Injektion und markieren Sie nicht das Gleichgewicht.
    6. Speichern Sie die Testvorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus, und definieren Sie den Speicherort für die Ergebnisdatei.
  3. Herstellung von Verbindungen zum Laden in die Sensorpatrone
    1. Bereiten Sie 2 ml 50 mM db-cAMP vor, indem Sie 9,8 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen und IBMX zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen.
      HINWEIS: IBMX neigt dazu, nach verdünnter TYH-Puffer zu ausfallen. Ausscheidungen können durch Wirbeln und Inkubieren der TYH/db-cAMP/IBMX-Lösung in einem 37 °C-Wärmeblock für 5 min gelöst werden.
    2. Bereiten Sie 1 ml 500 mM 2-DG vor, indem Sie 82,1 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen.
    3. Bereiten Sie 1 ml von 5 m AntA/Rot vor, indem Sie beide Medikamente im TYH-Puffer verdünnen.
      HINWEIS: Verbindungen werden 10-fach durch Injektion in die extrazelluläre Flussanalysatorpatrone verdünnt; Achten Sie daher darauf, dass Injektionslösungen 10x konzentrierter sind.
  4. Isolierung von Maussperma
    1. Anästhetisieren Sie 3 männliche Mäuse zwischen 8 und 16 Wochen durch Isofluran und opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, nachdem keine Reaktion auf Zehenkneifen nachgewiesen wurde. Entfernen Sie die Cauda epididymide und vasa deferentia.
    2. Legen Sie jede Cauda in 500 l vorgewärmten TYH-Puffer in 24-Well-Platte gut, immobilisieren Sie die Cauda an der Unterseite der Platte mit einem Paar Zange und öffnen Sie das Gewebe durch 5-7 kleine Schnitte mit Federschere.
    3. Die Platte sofort in einen Nicht-CO2 37 °C-Inkubator geben und das Sperma 15 min verteilen lassen.
  5. Beladung der Sensorpatrone
    1. Zwei Port-Ladeführungen für Port A und D sowie Port B und C sind im Extrazellulären Flux-Kit enthalten. Entfernen Sie zum Laden eines bestimmten Ports den Deckel von der Sensorkassette, und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Verwenden Sie beim Einspritzen die Fingerspitzen der nicht injizierenden Hand, um die Anschlussladeführung an Ort und Stelle zu halten und die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher einzulegen.
    2. Anschluss A: Mit einer Mehrkanalpipette in jede Spalte 20 L des TYH-Puffers einspritzen.
    3. Port B: Injizieren Sie 22 L TYH-Puffer in Spalte 1-4, injizieren Sie 22 l 500 mM 2-DG in die Spalte 5-8 und 25 l von 5 'M AntA/Rot in Spalte 9-12.
    4. Port C: Injizieren Sie 25 L TYH-Puffer in jede Spalte mit ungeraden Zahlen, injizieren Sie 25 l von 10 mM db-cAMP/ 500 'M IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen.
    5. Legen Sie die Sensorpatrone mit der Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 - 15 min.
  6. Vorbereitung von Spermienplatten
    1. 45 mg BSA in 15 ml TYH-Puffer (3 mg/ml w/v) auflösen und drei Aliquots von 3 ml BSA/TYH-Lösung in jeweils 5 ml Zentrifugenrohren vorbereiten.
    2. Kombinieren Sie zwei Spermienbrunnen in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr, zählen Sie das Sperma mit einem Hämatozytometer und verdünnen Sie das Sperma auf eine Konzentration von 2 x 107 Spermien/ml.
      HINWEIS: Verwenden Sie geschnittene Pipettenspitzen zum Pipetieren von Spermien, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
    3. Zentrifugieren Sie das Sperma für 3 min bei 700 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml TYH Puffer hinzu. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie jede Spermiensuspension aliquot in ein 5 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml BSA/TYH.
    4. Legen Sie 180 L TYH-Puffer in jeden Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) einer ConA-beschichteten Platte. Legen Sie 180 l Spermiensuspension in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte (1,2 x 106 Spermien/Gut).
    5. Zentrifugieren Sie die Spermienplatte bei 250 x g für 1 min, drehen Sie die Platte um 180°, und Zentrifuge wieder bei 250 x g für 1 min (niedrigste Bremsrate 1).
    6. Entfernen Sie die Kalibrierplatte aus dem extrazellulären Flussanalysator und fügen Sie die Spermienplatte hinzu. Setzen Sie den Test fort.
  7. Datenextraktion und -analyse
    1. Nach Abschluss des Testes entfernen Sie die Kassette, öffnen Sie die Ergebnisdatei, klicken Sie auf die Registerkarte Exportieren und exportieren Sie die abgeschlossene Ausführung als GraphPad Prism-Datei (Ergänzende Datei 2: Primäre Beispieldaten für Abbildung 3).
    2. Duplizieren Sie die ECAR- und OCR-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Neu und dann auf die Registerkarte "Doppelte Familie" klicken (Abbildung 3A).
    3. Löschen Sie die ersten 7 Datenzeilen (Abbildung 3B).
    4. Normalisieren Sie sich auf den Datenpunkt vor der cAMP/IBMX-Injektion durch Basissubtrahierung von Zeile 1. Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren, dann auf die Registerkarte Basislinie entfernen und Spaltenmathematik. Hervorheben ausgewählter Zeilen: Erste Zeile, Berechnung: Verhältnis:Wert/Baselineund Unterspalten: Unterspalte ignorieren. Klicken Sie auf OK (Abbildung 3C).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Diese Methode verwendet einen extrazellulären Flussanalysator, um Echtzeit-Änderungen in der Rate der Glykolyse und Oxphos während der Maus Sperma-Capacitation zu überwachen. Abbildung 4 zeigt ein beispielhaftes Experiment, bei dem Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-DG und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert wurden. Das Energiesubstrat im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer und die pharmako...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Der Verlust der Spermienkapazität in Ermangelung bestimmter metabolischer Substrate oder kritischer Stoffwechselenzyme ergab den Energiestoffwechsel als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung. Ein metabolischer Schalter während der Zellaktivierung ist ein etabliertes Konzept in anderen Zelltypen, aber wir beginnen gerade zu verstehen, wie Spermien ihren Stoffwechsel an den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation anpassen. Mit einem extrazellulären Flussanalysator haben wir ein leicht anwendbares Werk...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren möchten die Unterstützung von Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu am Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center würdigen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
2-Deoxy-D-glucoseSigma-AldrichD83752-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthinSigma-AldrichI7018IBMX; Herstellung einer 500 mM Stammlösung in DMSO (111,1 mg/ml) und Lagerung in kleinen Aliquots
Antimycin ASigma-AldrichA8674Anta; Eine 5 mM Stammlösung in DMSO (2,7 mg/ml) herstellen und in kleinen Aliquoten
RinderserumalbuminSigma-AldrichA1470BSA
CalciumchloridSigma-AldrichC1016CaCl2
Concanacalin A, Lektin aus Arachis hypogaea (Erdnuss)Sigma-AldrichL7381ConA
GlukoseSigma-AldrichG7528
HepesSigma-AldrichH0887
IsothesieHenry Schein Tiergesundheit1169567761Isofluran-Magnesiumsulfat
Sigma-AldrichM2643MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosin 3',5'-cyclisches Monophosphat-NatriumsalzSigma-AldrichD0627db-cAMP
KaliumchloridSigma-AldrichP9333KCl
KaliumdihydrogenphosphatSigma-AldrichP5655KH2PO4
RotenonCayman Chemical Company13995Rot; Herstellung einer 5 mM Stammlösung in DMSO (2mg/ml) und Lagerung in kleinen Aliquoten
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS5761NaHCO3-Natriumchlorid
Sigma-AldrichS9888NaCl
Ausrüstung und Materialien
12-Kanal-Pipette 10-100 μ LeppendorfES-12-100
12-Kanal-Pipette 50-300 μ Lvwr613-5257
37 ° C, non-CO2 Inkubatorvwr1545
5 mL Cetrifuge Röhrcheneppendorf30119380
50 mL konische Zentrifugenröhrchenvwr76211-286
Zentrifuge mit PlattenadapterThermo ScientificIEC FL40R
DissektionskitWorld Precision InstrumentsMOUSEKIT
Inverses Phasenkontrastmikroskop mit 40X ObjektivNikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, geteiltThomas Scientific1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, geteiltThomas Scientific1159X95
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Auch als XFe96 FluxPak mini (102601-100) mit 6 statt 18 Patronen erhältlich.

Referenzen

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54(2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Messung der Glykolyseextrazelluläre AcidifikationsrateSauerstoffverbrauchrate2-DesoxyglucoseAntimycin A RotenoneConA-beschichtete PlatteTYH-Puffer
Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.