Summary
Nous décrivons l'application d'un analyseur extracellulaire de flux pour surveiller des changements en temps réel dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris.
Abstract
Le sperme de mammifères acquiert la capacité de fertilisation dans l'appareil reproducteur femelle dans un processus connu sous le nom de capacitation. Les processus associés à la capacitation nécessitent de l'énergie. Il reste un débat continu au sujet des sources générant l'ATP qui alimente la motilité progressive de sperme, la capacitation, l'hyperactivation, et la réaction acrosome. Ici, nous décrivons l'application d'un analyseur extracellulaire de flux comme outil pour analyser des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris. À l'aide de h-et O2- fluorophores sensibles, cette méthode permet de surveiller la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel chez les spermatozoïdes non capacitated versus capacitating. L'utilisation de cet analyse en présence de différents substrats énergétiques et/ou d'activateurs pharmacologiques et/ou d'inhibiteurs peut fournir des informations importantes sur la contribution de différentes voies métaboliques et l'intersection entre les cascades de signalisation et le métabolisme pendant la capacitation des spermatozoïdes.
Introduction
L'application de la spectrométrie de masse a révolutionné l'étude du métabolisme. Le profilage métabolique ciblé et le traçage métabolomique permettent une surveillance précise des changements dans le métabolisme énergétique. Cependant, l'exécution de la métabolomique nécessite une formation approfondie, un personnel expérimenté et des spectromètres de masse coûteux et très sensibles qui ne sont pas facilement accessibles à tous les laboratoires. Ces dernières années, l'utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire, comme l'hippocampe XFe96 est devenu populaire comme une méthode de substitution pour mesurer les changements dans le métabolisme énergétique dans divers types de cellules1,2,3,4,5.
Les spermatozoïdes sont des cellules motiles hautement spécialisées; dont la tâche est de livrer le génome paternel à l'ovocyte. Les spermatozoïdes quittant l'appareil reproducteur masculin après l'éjaculation sont encore fonctionnellement immatures et ne peuvent pas féconder l'ovocyte parce qu'ils sont incapables de pénétrer les vêtements des ovocytes. Le sperme acquiert la compétence de fertilisation pendant qu'ils transitent par l'appareil reproducteur femelle dans un processus de maturation connu sous le nom de capacitation6,7. Les spermatozoïdes ou spermatozoïdes fraîchement éjaculés disséqués de l'épididyme cauda peuvent être concoctées in vitro par incubation dans des supports de capacitation définis contenant Ca2,bicarbonate (HCO3-) ou un analogue cAMP perméable à la cellule (p. ex., dibutyryl-cAMP), un accepteur de cholestérol (p. ex. albumine de sérum bovin, BSA) et une source d'énergie (p. ex. glucose). Pendant la capacitation, les spermatozoïdes modifient leur modèle de motilité en un battement asymétrique de flagellaire, représentant un mode de natation appelé hyperactivation8,9, et ils deviennent compétents pour subir la réaction acrosome7, où des enzymes protéolytiques sont libérées qui digèrent les vêtements des ovocytes. Ces processus nécessitent de l'énergie, et similaires aux cellules somatiques, les spermatozoïdes génèrent de l'ATP et d'autres composés à haute énergie par glycolyse ainsi que le cycle mitochondrial TCA et la phosphorylation oxydative (oxphos)10. Tandis que les études multiples démontrent que la glycolyse est nécessaire et suffisante pour soutenir la capacitation de sperme11,12,13,14, la contribution de l'oxphos est moins claire. Contrairement à d'autres types de cellules où la glycolyse est physiquement couplée au cycle TCA, les spermatozoïdes sont très compartimentés et sont pensés pour maintenir ces processus dans des compartiments de flagellateur séparés: la pièce médiane concentre la machinerie mitochondriale, tandis que les enzymes clés de la glycolyse semblent être limitées à la pièce principale15,16. Cette compartimentation se traduit par un débat en cours sur la question de savoir si le pyruvate produit dans la pièce principale par glycolyse peut soutenir les oxphos mitochondriaux dans la pièce médiane, et si l'ATP produit par les oxphos dans la pièce médiane serait en mesure de diffuser suffisamment rapidement le long de la longueur du flagellum pour soutenir les besoins énergétiques dans les parties distales de la pièce principale17,18,19. Il y a également le soutien d'un rôle pour des oxphos dans la capacitation de sperme. Non seulement les oxphos sont plus favorables énergétiquement que la glycolyse, générant 16 fois plus d'ATP que la glycolyse, mais le volume médian et la teneur mitochondriale sont directement corrélés avec la forme reproductive chez les espèces de mammifères qui présentent de plus grands degrés de concurrence entre les mâles pour les compagnons20. Pour répondre à ces questions, il faut des méthodes pour examiner les contributions relatives de la glycolyse et de l'oxphos pendant la capacitation des spermatozoïdes.
Tourmente et coll. ont appliqué un analyseur de flux extracellulaire de 24 puits pour comparer le métabolisme énergétique d'espèces de souris étroitement apparentées avec des paramètres de performance des spermatozoïdes significativement différents21. Au lieu de rapporter les valeurs basales d'ECAR et d'OCR des spermatozoïdes non-capacitated, ici, nous adaptons leur méthode utilisant un analyseur extracellulaire de flux de 96-bien pour surveiller des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris en temps réel. Nous avons développé une méthode qui permet de surveiller simultanément la glycolyse et les oxphos en temps réel dans les spermatozoïdes avec battre flagelle dans jusqu'à douze conditions expérimentales différentes en mesurant le flux d'oxygène (O2) et les protons (H)(Figure 1A). En raison de la décomposition du pyruvate à lactate pendant la glycolyse et de la production de CO2 via le cycle TCA, les spermatozoïdes non capacitatisés et concitatisés extrudent Hdans le support d'analyse qui sont détectés par l'analyseur de flux extracellulaire par l'intermédiaire des fluorophoressensiblesH-sensibles immobilisés à l'extrémité de la sonde d'une cartouche de capteur. En parallèle, la consommation d'O2 par phosphorylation oxydative est détectée par l'intermédiaire de fluorophores sensibles à l'O2immobilisés à la même pointe de la sonde (Figure 1B). La détection efficace de l'O2 libéréet consommé nécessite un tampon de sperme modifié avec une faible capacité tampon sans bicarbonate ou rouge phénol. Ainsi, pour induire la capacitation en l'absence de bicarbonate, nous avons adopté l'utilisation d'un analogue cAMP perméable à la cellule injecté avec l'inhibiteur de la PDE à large portée IBMX22. Trois autres ports d'injection indépendants permettent l'injection d'activateurs pharmacologiques et/ou d'inhibiteurs, ce qui facilite la détection en temps réel des changements dans la respiration cellulaire et le taux de glycolyse dus à la manipulation expérimentale.
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Protocol
Le sperme est recueilli à partir de souris mâles CD-1 de 8-16 semaines. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Weill Cornell Medicine.
1. Jour avant l'assay
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Préparation de la cartouche de capteur et de l'analyseur de flux extracellulaire calibrant
- Pour hydrater la cartouche du capteur, retirez la cartouche du capteur du kit d'assiduité extracellulaire XFe96 et placez la cartouche du capteur à l'envers à côté de la plaque d'utilité.
- Remplir un réservoir de solution avec 25 ml de H2O à double distillation à l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 200 OL de H2O à chaque puits de la plaque d'utilité. Placez la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité et incubez toute la nuit dans un incubateur non CO2 de 37 oC.
REMARQUE: Cartridge doit être hydraté pendant au moins 4 h. - Aliquot 25 ml de l'analyseur de flux extracellulaire calibrant dans un tube conique de 50 ml et l'incuber pendant la nuit dans un incubateur de 37 oC non-CO2.
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Préparation de microplaques enduites de ConA
- Dissoudre 2,5 mg de ConA dans 5 ml de H2O à double distillation pour préparer un stock de 0,5 mg/mL (w/v).
- À l'aide d'une pipette multicanal, remplissez chaque puits d'une plaque d'analyseur de flux extracellulaire de 96 puits avec 50 l l de la solution 0,5 mg/mL Con A. Laissez le couvercle ouvert et laissez sécher la plaque toute la nuit à température ambiante.
REMARQUE : Plusieurs plaques peuvent être enduites à la fois et entreposées à 4 oC pendant jusqu'à quatre semaines jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi.
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Préparation de la mémoire tampon de sperme
- Préparer 250 mL d'analyseur de flux extracellulaire TYH tampon avec faible HEPES contenant 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM de glucose, et 1 mM HEPES. Chauffer le tampon à 37 oC et ajuster le pH à 7,4.
2. Jour de l'assay
- Préparation à l'étalonnage des cartouches
- Remplacer le H2O dans la plaque d'utilité par 200 l de calibrant XF par puits et couver pendant au moins 1 h dans un incubateur non-CO2 37 oC.
REMARQUE : Au lieu d'un PBS calibrant et filtré stérile, le pH 7.4 peut être utilisé. - Chauffer 50 ml de tampon TYH à 37 oC.
- Remplacer le H2O dans la plaque d'utilité par 200 l de calibrant XF par puits et couver pendant au moins 1 h dans un incubateur non-CO2 37 oC.
- Génération d'un modèle d'onde pour l'analyseur de flux extracellulaire
- Activez l'analyseur de flux extracellulaire et laissez la température se stabiliser à 37 oC.
- Ouvrez le logiciel d'onde et concevez un nouveau modèle en ouvrant un modèle vierge (voir Fichier supplémentaire 1, modèle d'onde).
- Ouvrez l'onglet Définitions du Groupe. Définir les supports d'analyse comme TYH; pH 7.4 et type de cellules comme sperme de souris, laisser les stratégies d'injection et les prétraitements vierges. Créer différents groupes pour chaque condition d'assougage; dans cet exemple, il y a 6 groupes différents (TYH, TYH - db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG - db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot - db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) et 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) pour induire la capacitation, 2-deoxyglucose (2-DG) comme inhibiteur de glycolyse, antimycine A (antA) et rotenone (rote) comme inhibiteur de la chaîne complexe III et complexe de transport électronique.
REMARQUE : Pour tenir compte de la variabilité entre les puits, au moins 7 à 8 puits par condition doivent être mesurés en parallèle. - Ouvrez l'onglet carte plaque et définissez la carte des plaques en attribuant des groupes à des puits spécifiques.
REMARQUE : Les quatre puits d'angle (A1, A12, H1, H12) seront remplis de tampon TYH (pas de sperme) et seront plus tard utilisés pour la soustraction de fond. - Ouvrez l'onglet Protocole, ajoutez 4 cycles de mesure différents, sélectionnez le port respectif et modifiez les détails de mesure (Figure 2, Tableau 1). Mettre en surbrillance la mesure après l'injection et ne pas mettre en évidence l'équilibre.
- Enregistrez le modèle d'analyse, remplissez le résumé du projet et définissez l'emplacement d'enregistrement du fichier de résultats.
- Préparation de composés à charger dans la cartouche du capteur
- Préparer 2 ml de 50 mM db-cAMP en dissolvant 9,8 mg de composé dans le tampon TYH et ajouter IBMX à une concentration finale de 5 mM.
REMARQUE : IBMX a tendance à se précipiter après avoir été dilué dans le tampon TYH. Les précipitations peuvent être dissoutes par le vortex et l'incubation de la solution TYH/db-cAMP/IBMX dans un bloc de chaleur de 37 oC pendant 5 min. - Préparer 1 ml de 500 mM 2-DG en dissolvant 82,1 mg de composé dans le tampon TYH.
- Préparer 1 ml de 5 Md d'AntA/Rot en diluant les deux médicaments dans le tampon TYH.
REMARQUE : Les composés sont dilués 10 fois par injection dans la cartouche extracellulaire d'analyseur de flux ; par conséquent, assurez-vous que les solutions d'injection sont 10 fois plus concentrées.
- Préparer 2 ml de 50 mM db-cAMP en dissolvant 9,8 mg de composé dans le tampon TYH et ajouter IBMX à une concentration finale de 5 mM.
- Isolement du sperme de souris
- Anesthésier 3 souris mâles entre 8 et 16 semaines par isoflurane et sacrifier les souris par dislocation cervicale après qu'aucune réponse au pincement d'orteil n'ait été détectée. Enlever les épididymides cauda et la vasa deferentia.
- Placer chaque cauda dans 500 l de tampon TYH préchauffé dans un puits de 24 puits, immobiliser la cauda au fond de la plaque à l'aide d'une paire de forceps et ouvrir le tissu en faisant 5-7 petites incisions avec des ciseaux à plumes.
- Transférer immédiatement la plaque dans un incubateur non-CO2 37 oC et laisser le sperme se disperser pendant 15 min.
- Chargement de la cartouche du capteur
- Deux guides de chargement portuaire pour les ports A et D et les ports B et C sont fournis dans le kit Flux extracellulaire. Pour charger un port spécifique, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et alignez la lettre du guide de chargement port respectif avec le coin supérieur gauche de la cartouche. Pendant l'injection, utilisez le bout des doigts de la main non-injectante pour maintenir le guide de chargement bâbord en place et insérer les pointes de pipette verticalement dans les trous de guidage de chargement bâbord.
- Port A : À l'aide d'une pipette multicanal, injecter 20 l de la mémoire tampon TYH dans chaque colonne.
- Port B : Injecter 22 l de tampon TYH dans la colonne 1-4, injecter 22 'L de 500 mM 2-DG dans la colonne 5-8, et 25 'L de 5 'M AntA/Rot dans la colonne 9-12.
- Port C : Injectez 25 l de tampon TYH dans chaque colonne avec des nombres impairs, injectez 25 'L de 10 mM db-cAMP/ 500 'M IBMX dans chaque colonne avec des nombres pair.
- Placez la cartouche du capteur avec la plaque d'étalonnage dans l'analyseur de flux extracellulaire et commencez l'analyse. Calibration prend 10 - 15 min.
- Préparation des plaques de sperme
- Dissoudre 45 mg de BSA dans 15 ml de tampon TYH (3 mg/mL w/v) et préparer trois aliquots de 3 mL de solution BSA/TYH chacun dans des tubes centrifugeurs de 5 ml.
- Combinez deux puits de sperme chacun dans un tube centrifugeur de 1,5 mL, comptez le sperme à l'aide d'un hématocytomètre et diluez le sperme à une concentration de 2 x 107 spermatozoïdes/mL.
REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette coupées pour la pipetage du sperme pour éviter d'endommager les cellules. - Centrifuger le sperme pendant 3 min à 700 x g,retirer le supernatant et ajouter 1 ml de tampon TYH. Répétez l'étape de centrifugation, retirez le supernatant et transférez chaque aliquot de suspension de sperme dans un tube de centrifugeuse de 5 ml avec 3 ml de BSA/TYH.
- Placez 180 l de tampon TYH dans chaque puits d'angle (A1, A12, H1, H12) d'une plaque enduite de ConA. Placer 180 l de suspension de sperme dans chaque puits vide de la plaque enduite de ConA (1,2 x 106 spermatozoïdes/puits).
- Centrifuger la plaque de sperme à 250 x g pendant 1 min, faire pivoter la plaque de 180 degrés, et centrifuger à nouveau à 250 x g pendant 1 min (taux de freinage le plus bas 1).
- Retirez la plaque d'étalonnage de l'analyseur de flux extracellulaire et ajoutez la plaque de sperme. Continuez l'assidu.
- Extraction et analyse de données
- Après avoir terminé l'essai, retirez la cartouche, ouvrez le fichier des résultats, cliquez sur l'onglet Export et exportez l'exécution terminée sous forme de fichier GraphPad Prism (Fichier supplémentaire 2: Données d'exemple primaire utilisées pour la figure 3).
- Duplicate le fichier ECAR et OCR en cliquant sur le nouvel onglet, puis la famille Duplicate... onglet (Figure 3A).
- Supprimer les 7 premières lignes de données (Figure 3B).
- Normalisez au point de données avant l'injection cAMP/IBMX en soustrayant la ligne 1 de base. Cliquez sur l'onglet Analyse, puis sur l'onglet Supprimer la ligne de base et la colonne mathématiques. Mettre en évidence les lignes sélectionnées (s): Première rangée, Calcul: Ratio:Value/Baseline, et Sous-colonnes: Ignorer la sous-colonne. Cliquez sur OK ( Figure3C).
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Representative Results
Cette méthode utilise un analyseur de flux extracellulaire pour surveiller les changements en temps réel dans le taux de glycolyse et d'oxphos pendant la capacitation de sperme de souris. La figure 4 montre une expérience exemplaire où les spermatozoïdes ont été concités en présence de glucose comme seul substrat énergétique et 2-DG et antimycine et rotenone comme modulateurs pharmacologiques. Le substrat d'énergie dans le tampon d'analyseur de flux extracellulaire TYH et les modulateurs pharmacologiques peuvent être librement sélectionnés en fonction de l'objectif de l'expérience. Le sperme de souris non-capacitated dans BSA/TYH ont été attachés au fond d'une microchambre transitoire ConA-enduite par leur tête. Dans cet exemple, les valeurs basiques de l'ECAR et de l'OCR en moyenne entre tous les puits détectés étaient respectivement de 12,76 à 2,75 mpH/min et de 23,64 à 2,78 pmol/min.
Après une injection simulée avec le tampon de TYH, suivie de l'injection de 2-DG et de fourmi/roter pour empêcher la glycolyse et la phosphorylation oxydative, respectivement, la capacitation de sperme a été induite par l'injection de db-cAMP/IBMX.
Les résultats représentatifs montrent qu'en présence de glucose, la capacitation s'accompagne d'une multiplication par 7 du taux d'acidification extracellulaire (ECAR), qui est inhibée en bloquant la glycolyse avec 2-DG (Figure 4A). Les spermatozoïdes concitatisés montrent une augmentation de 20 fois du taux de consommation d'oxygène (OCR) par rapport aux spermatozoïdes non-capacitated (figure 4B), démontrant que le sperme de souris améliore la glycolyse et la phosphorylation oxydative pour soutenir la demande croissante d'énergie pendant la capacitation. L'augmentation de l'ECAR pendant la capacitation des spermatozoïdes est inhibée par l'inhibiteur de la glycolyse 2-DG, mais non affectée par les inhibiteurs oxydatifs de la phosphorylation antimycine A et rotenone (figure 4C), ce qui indique que le changement dans l'ECAR est principalement entraîné par H- libération de la glycolyse. L'augmentation de l'OCR est, comme prévu, bloquée par l'antimycine A et la roténe(figure 4D),mais elle est également inhibée par 2-DG (Figure 4B) révélant que l'augmentation des oxphos pendant la capacitation des spermatozoïdes dépend de l'activité glycolytique.
Figure 1 : Principe de l'analyseur de flux extracellulaire. (A) En raison de la dégradation du glucose à lactate pendant la glycolyse et de la génération de CO2 par le cycle de TCA, les changements dans la glycolyse et les oxphos sont accompagnés de H- excrétion dans les médias extracellulaires. L'analyseur XFe96 détecte ces changements dans la concentration extracellulaire de Het d'ECAR en tant qu'ECAR. En parallèle, les changements de concentration extracellulaire d'O2 dues à la consommation d'O2 par phosphorylation oxydative sont mesurés comme OCR. Le blocage de la glycolyse avec 2-désoxyglucose (2-DG) ou la respiration avec le complexe I et complexe inhibiteurs III rotenone et antimycine A révèle quelles voies métaboliques soutiennent la demande croissante d'énergie pendant la capacitation de sperme. (B) Les spermatozoïdes de souris sont attachés par la tête au fond d'une microchambre enduite de ConA; leurs flagelles se déplacent librement. Alors que les changements dans la concentration extracellulaire Het O2 sont détectés parlesfluorophores sensibles H et O2immobilisés à une sonde de capteur, jusqu'à quatre composés différents peuvent être injectés de façon séquentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Représentation schématique de l'expérience exemplaire. Des changements dans l'ECAR (mpH/min)et l'OCR (pmol O 2/min) sont détectés dans les spermatozoïdes non capacitated et capacitating utilisant un analyseur extracellulaire de flux. Cycle 1 : Valeurs Basal ECAR et OCR. Cycles 2-5 : Stabilisation du système après injection simulée de TYH. Cycles 6-8 : Incubation de médicaments. Cycles 9-27: Capacitation de sperme. Les flèches indiquent des injections. 2-DG: concentration finale 50 mM, AntA/Rot: concentration finale 0,5 M, db-cAMP: concentration finale 1 mM, IBMX: concentration finale 500 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse des données. (A) Données brutes des changements dans ECAR pendant la capacitation de sperme de souris. (B) Données après la suppression des 7 premiers points de données. (C) Données normalisées au point de données avant l'injection cAMP/IBMX. Les données sont indiquées comme moyenne de 7-8 puits - Les injections de S.E.M. sont indiquées avec une flèche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris. (A) ECAR normalisé dans le sperme de souris non-capacitated et conacitating de souris en présence et absence de 50 mM 2-DG. (B) OCR normalisé dans le sperme de souris non-capacitated et conacitating en présence et absence de 50 mM 2-DG. (C) ECAR normalisé dans le sperme de souris non-capacitated et condensant en présence et en absence de 0.5 'M antimycine A et rotenone. (D) OCR normalisé dans le sperme de souris non-capacitated et condensant en présence et en absence de 0.5 'M antimycine A et rotenone. Les données sont présentées comme moyennes - S.E.M normalisée au point de données avant l'injection db-cAMP/IBMX; n 6. Les injections sont indiquées avec une flèche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Port | Nombre de cycles | Mélanger (min) | Attendre (min) | Mesure (min) | |
| A: Basal ECAR/OCR | pas de port | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: Injection de maquettes | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: Injection de drogue | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: Capacitation | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
Tableau 1 : Détails de la mesure.
Figure supplémentaire 1 : Capacitation du sperme de souris dans le tampon extracellulaire d'analyseur de flux TYH. Phosphorylation des résidus de tyrosine de sperme de souris détectés à différents moments pendant la capacitation (0 - 90 min) après l'incubation dans (A) TYH avec 25 mM HCO3-, 3 mg/mL BSA et 20 mM HEPES ou dans (B) analyseur de flux extracellulaire TYH avec 5 mM db-cAMP, 500 M IBMX, et 1 mM HEPES, détectés avec un anticorps de phosphotyrosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire 1 : Modèle d'analyse de vague pour détecter des changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris. Le logiciel de bureau d'onde peut être téléchargé gratuitement après avoir rempli un formulaire d'enregistrement (www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6) et installé sur les fenêtres 7, 8 ou 10, (Mac OSx 10.11 (ou plus) avec Parallels 12 (ou plus). Par conséquent, les modèles d'ondes peuvent être générés indépendamment de l'analyseur de flux extracellulaire, exportés et ensuite importés dans le logiciel d'onde de tout analyseur de flux extracellulaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
Fichier supplémentaire 2: Fichier prisme de pad graphique exporté à partir d'un logiciel d'onde avec une analyse de données exemplaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
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Discussion
La perte de la capacitation de sperme en l'absence de certains substrats métaboliques ou enzymes métaboliques critiques a indiqué le métabolisme d'énergie comme facteur clé soutenant la fertilisation réussie. Un commutateur métabolique pendant l'activation cellulaire est un concept bien établi dans d'autres types de cellules, cependant, nous commençons juste à comprendre comment les spermatozoïdes adaptent leur métabolisme à la demande croissante d'énergie pendant la capacitation. À l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire, nous avons développé un outil facilement applicable pour surveiller les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel pendant la capacitation de sperme. La détection des changements dans les het Oextracellulaires avec des fluorophores immobilisés à une sonde de capteur est peu invasive et les quatre ports d'injection actionnés individuellement permettent la manipulation avec des inhibiteurs pharmacologiques ou des activateurs à des moments distincts avant ou pendant le processus de capacitation. Ce protocole ne donne qu'un exemple d'expérience de capacitation de sperme de souris. Pour simplifier l'interprétation des résultats, nous avons choisi le spectacle une expérience exemplaire où le glucose a été utilisé comme la seule source d'énergie. Les conditions sont variables selon l'objectif de l'expérience, et jusqu'à 12 conditions différentes (c.-à-d. différentes sources d'énergie comme le glucose contre le glucose et le pyruvate) peuvent être mesurées en parallèle. En outre, quatre ports d'injection indépendants permettent l'injection d'activateurs pharmacologiques et/ou d'inhibiteurs à tout moment désiré avant ou pendant la capacitation. Cela ouvre la possibilité d'utiliser l'analyseur de flux extracellulaire comme un dispositif de dépistage semi-haut débit. Semblable au sperme de souris, chez d'autres espèces comme l'homme ou le bovin, il est encore énigmatique de voir comment les spermatozoïdes changent leur métabolisme pendant la capacitation. Le protocole peut être facilement adapté; ainsi, nous recommandons d'optimiser la concentration de sperme à chaque fois avant de commencer une véritable expérience.
La plus grande limitation du protocole est que des résultats de haute qualité ne peuvent être obtenus qu'en l'absence de bicarbonate. Le bicarbonate dans le liquide séminal est le signal physiologique qui initie la cascade de signalisation de la capacitation du sperme après l'éjaculation. Le bicarbonate active la cyclase soluble d'adenylyl (sAC ; ADCY10), qui catalyse la conversion de l'ATP en cAMP23. L'augmentation de l'AMPC entraîne ensuite une cascade de signalisation médiée par Protein Kinase A, qui conduit finalement à la phosphorylation tyrosine en aval des protéines cibles (par exemple, les canaux ioniques, les enzymes métaboliques, et les protéines structurelles24,25). Cette restriction contre le bicarbonate est surmontée en injectant le produit du sAC activé par le bicarbonate, cAMP. Nous utilisons 5 mM de la cellule perméable cAMP analogique db-cAMP en parallèle avec l'inhibiteur de la phosphodiesterase à large spécificité IBMX, qui empêche la dégradation rapide de db-cAMP par phosphodiesterases. Cette combinaison initie efficacement l'activation de la voie de signalisation de signalisation de capacitation réglementée par l'AMPC avec une cinétique similaire à celle du bicarbonate(figure supplémentaire 1). En parallèle au bicarbonate, un accepteur de cholestérol (par exemple, BSA) est utilisé pour capaciter in vitro le sperme ou le sperme fraîchement éjaculé disséqué de l'épididyme cauda. L'albumine ne peut pas être injectée parce qu'elle obstrue le port d'injection et, par conséquent, doit être ajoutée au tampon de sperme avant de placage les cellules. L'exécution de l'expérience en présence ou absence de BSA a indiqué que l'augmentation de l'ECAR et de l'OCR pendant la capacitation de sperme est indépendante de l'accepteur de cholestérol. Cependant, la présence de BSA dans le tampon de sperme a diminué des fluctuations dans les valeurs détectées d'ECAR et d'OCR entre différents puits et expériences ; ainsi, nous recommandons fortement d'inclure BSA dans le tampon de sperme pour augmenter la reproductibilité.
L'isolat du sperme de l'épididyme de cauda a comme conséquence la contamination du sperme avec le fluide épididymal. Pour éviter les résultats artificiels dus aux composants de fluide séminal, nous recommandons de laver le sperme deux fois avant de les utiliser pour une expérience. La concentration et le placage de sperme sont un autre facteur critique déterminant le succès de l'expérience. Pour des résultats fiables, le fabricant recommande que les valeurs initiales ECAR soient supérieures à 10 et que les valeurs OCR soient supérieures à 20. La concentration de spermatozoïdes utilisée dans ce protocole a été optimisée de sorte que les valeurs moyennes basales ECAR et OCR des 7-8 puits mesurés par condition sont au-dessus de 10 et 20, respectivement. Le déplacement libre des spermatozoïdes perturbe la détection des changements dans les h extracellulaireset O2. Ainsi, il est crucial d'adhérer à tous les spermatozoïdes avec leur tête au fond de la plaque. Nous avons trouvé le succès adhérant au sperme en enrobant la plaque avec ConA, une léctine végétale qui interagit spécifiquement avec la membrane acrosomique externe et est couramment utilisé pour les essais acrosome26, et en tournant doucement la plaque (voir l'étape 2.7.3). Avec cette méthode, les spermatozoïdes sont localisés au fond du puits uniquement par l'intermédiaire de leur tête afin qu'ils puissent encore librement déplacer leur flagelle et changer leur modèle de battement flagellar pendant la capacitation.
Le sperme extrude constamment Het O2 dans les deux, l'état non-capacitated et l'état de capacité. Pour déterminer l'ECAR et l'OCR initiaux aussi précisément que possible, il est crucial de commencer l'expérience aussi rapidement que possible après la dernière étape de lavage. Ceci peut être accompli en chargeant la cartouche de capteur tandis que le sperme nage dehors et en commençant la méthode dans l'analyseur extracellulaire de flux avant la première étape de lavage. Le calibrage de l'instrument prend à peu près le même temps que le lavage et le placage des cellules et la rotation de la plaque. Le fabricant recommande une phase d'équilibre pour permettre au système de se stabiliser avant que le premier point de données réel ne soit mesuré. Étant donné que le protocole comprend 8 cycles de mesure avant le début de la capacitation, pour gagner du temps, l'étape d'équilibre est exclue de ce protocole.
La capacité d'injecter des solutions pendant l'analyse et d'observer leurs effets sur la respiration et le taux glycolytique en temps réel est une caractéristique clé de l'analyseur de flux extracellulaire. Le chargement de la cartouche du capteur est l'une des étapes critiques du protocole et doit être effectué avec soin. Pour assurer une injection adéquate dans tous les puits, chaque série de ports doit contenir le même volume, y compris les puits de fond. Le chargement des ports avec une pipette multicanal nécessite une certaine pratique, mais diminue considérablement la variabilité et le temps de chargement. Nous vous recommandons fortement d'utiliser le guide de chargement du port, mais d'injecter seulement quatre ports simultanément. Il est également important de comprendre que pendant le chargement, les volumes d'injection sont progressivement augmentés pour compenser le volume croissant dans le puits. Lors du chargement de la cartouche du capteur, il est important de ne pas insérer complètement les pointes dans le port. Cela pourrait pousser prématurément la solution d'injection à travers l'orifice bâbord. Tout en établissant la méthode, nous avons constaté que l'injection de liquide dans un puits de sperme provoque des artefacts d'injection indésirables, probablement en raison de la dilution du sperme dans le puits et / ou le déplacement du sperme du fond du puits. La première injection provoque le plus grand artefact d'injection, donc nous avons inclus une injection simulée avec tampon de sperme dans tous les puits au début du protocole.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner le soutien du Dr Lavoisier Ramos-Espiritu au Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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