Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine einfache und kohärente Möglichkeit dar, ein Gen von Interesse mit modRNA nach Myokardinfarkt bei Mäusen vorübergehend zu regulieren.

Zusammenfassung

Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Sterblichkeit in der westlichen Welt. In den letzten zehn Jahren hat sich die Gentherapie aufgrund ihrer Effizienz und außergewöhnlichen therapeutischen Wirkung zu einer vielversprechenden Behandlungsoption für Herzerkrankungen entwickelt. Um das beschädigte Gewebe nach dem MI zu reparieren, haben verschiedene Studien DNA-basierte oder virale Gentherapie eingesetzt, standen aber aufgrund der schlechten und unkontrollierten Expression der gelieferten Gene, Ödeme, Arrhythmie und Herzhypertrophie vor erheblichen Hürden. Synthetische modifizierte mRNA (modRNA) stellt einen neuartigen Gentherapieansatz dar, der eine hohe, vorübergehende, sichere, nichtimmunogene und kontrollierte mRNA-Bereitstellung in das Herzgewebe ohne Risiko einer genomischen Integration bietet. Aufgrund dieser bemerkenswerten Eigenschaften in Kombination mit seiner glockenförmigen Pharmakokinetik im Herzen ist modRNA zu einem attraktiven Ansatz für die Behandlung von Herzerkrankungen geworden. Um jedoch die Wirksamkeit in vivo zu erhöhen, muss eine konsistente und zuverlässige Bereitstellungsmethode befolgt werden. Um die Effizienz der modRNA-Bereitstellung und die Konsistenz der modRNA-Nutzung für In-vivo-Anwendungen zu maximieren, wird daher eine optimierte Methode zur Vorbereitung und Bereitstellung der intrakardialen ModRNA-Injektion in einem Maus-MI-Modell vorgestellt. Dieses Protokoll wird die modRNA-Bereitstellung für die Grundlagen- und Translationsforschung zugänglicher machen.

Einleitung

Gentherapie ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit Lieferung von Nukleinsäuren für die Behandlung, Heilung oder Prävention von menschlichen Krankheiten. Trotz der Fortschritte bei den diagnostischen und therapeutischen Ansätzen für Herzerkrankungen, gab es begrenzte Erfolge bei der Lieferung von Genen in Myokardinfarkt (MI) und Herzinsuffizienz (HF). So einfach der Prozess der Gentherapie auch scheint, es ist ein ausgesprochen komplexer Ansatz, wenn man die vielen Faktoren berücksichtigt, die optimiert werden müssen, bevor ein bestimmtes Lieferfahrzeug eingesetzt wird. Der richtige Liefervektor sollte nicht immunogen, effizient und stabil im menschlichen Körper sein. Die Bemühungen in diesem Bereich haben zwei Arten von Zustellungssystemen hervorgebracht: virale oder nicht-virale. Die weit verbreiteten Virussysteme, einschließlich Gentransfer durch Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus oder Adeno-assoziiertes Virus, haben eine außergewöhnliche Transduktionskapazität gezeigt. Jedoch, ihre Verwendung in Kliniken ist begrenzt aufgrund der starken Immunantwort induziert¹, Risiko der Tumorgenese², oder das Vorhandensein von neutralisierenden^{Antikörpern 3}, die alle ein großes Hindernis für eine breite und effektive Anwendung von viralen Vektoren in der menschlichen Gentherapie bleiben. Auf der anderen Seite zeigt die Lieferung von nackter Plasmid-DNA trotz ihres beeindruckenden Expressionsmusters eine geringe Transfektionseffizienz, während der mRNA-Transfer eine hohe Immunogenität und Erniedrigungsanfälligkeit durch RNase⁴aufweist.

Mit der umfangreichen Forschung auf dem Gebiet der mRNA hat sich modRNA aufgrund seiner zahlreichen Vorteile gegenüber traditionellen Vektoren zu einem attraktiven Werkzeug für die Lieferung von Genen an das Herz und verschiedene andere Organe entwickelt⁵. Der vollständige Ersatz von Uridin durch natürlich vorkommendes Pseudouridin führt zu einer robusteren und vorübergehenderen Proteinexpression, mit minimaler Induktion der angeborenen Immunantwort und dem Risiko einer genomischen Integration⁶. Kürzlich etablierte Protokolle verwenden eine optimierte Menge an Anti-Reverse Cap Analog (ARCA), die die Proteintranslation weiter verbessert, indem die Stabilität und Transaktivität der synthetischen mRNA⁷erhöht wird.

Frühere Berichte haben die Expression verschiedener Reporter- oder Funktionsgene gezeigt, die von modRNA im Nagetier Myokard nach MI geliefert werden. Mit modRNA-Anwendungen wurden signifikante Bereiche des Myokards, einschließlich Kardiomyozyten und Nicht-Kardiomyozyten, erfolgreich nach kardialen Verletzungen transfiziert^8, um Angiogenese^9,10, Herzzellüberleben¹¹und Kardiomyozytenproliferation¹²zu induzieren. Eine einzige Verabreichung von modRNA kodiert für mutierte menschliche Follistatin-ähnliche 1 induziert die Proliferation von Maus erwachsenen CMs und erhöht signifikant die Herzfunktion, verringert die Narbengröße, und erhöht die Kapillardichte 4 Wochen nach MI¹². Eine neuere Studie berichtete verbesserte Herzfunktion nach MI mit Anwendung von VEGFA modRNA in einem Schweinemodell¹⁰.

Daher ist es angesichts der zunehmenden Popularität von modRNA im Herzbereich wichtig, ein Protokoll für die Lieferung von modRNA an das Herz post-MI zu entwickeln und zu optimieren. Hierin ist ein Protokoll, das die Vorbereitung und Abgabe von gereinigter und optimierter modRNA in einer biokompatiblen Citrat-Saline-Formulierung beschreibt, die eine robuste, stabile Proteinexpression ohne Stimulierung einer Immunantwort bietet. Die in diesem Protokoll und Video gezeigte Methode zeigt den Standard-Chirurgischen Eingriff einer Maus MI durch permanente Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), gefolgt von drei intrakardialen Injektionen von modRNA. Das Ziel dieses Papiers ist es, eine hochgenaue und reproduzierbare Methode der ModRNA-Bereitstellung an das murine Myokard klar zu definieren, um die modRNA-Anwendung für die Herzgentherapie allgemein zugänglich zu machen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierprozeduren wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Institutional Care and Use Committee genehmigt.

1. Synthese von modRNA

HINWEIS: Die Details der modRNA-Synthese finden Sie in Kondrat et al.¹³.

1. Bestellen Sie die Plasmidvorlagen (Materialtabelle) und generieren Sie ein sauberes PCR-Produkt, das als mRNA-Vorlage verwendet werden soll.
2. Bereiten Sie die modRNAs durch Transkription in vitro mit einer maßgeschneiderten Ribonukleosid-Mischung der folgenden (Materialtabelle): T7 Transkriptionskit, 6 mM Anti-Reverse Cap analog (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM Guanosintriphosphat, 75 mM Adenosintriphosphat, 75 mM Cytidintriphosphat, 100 mM Pseudouridin-5-Triphosphat und T7 DNase Enzym.
3. Reinigen Sie die modRNA in Schritt 1.2 mit einem Transkriptionsbereinigungsset (Tabelle der Materialien) und behandeln Sie sie mit antarktischer Phosphatase. Als nächstes repurifizieren Sie die modRNA mit dem Transkriptionsbereinigungskit und quantifizieren Sie sie mit einem Spektralphotometer.
4. Die modRNA mit Ethanol und Ammoniumacetat ausfälten und in 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA resuspendieren.
5. Konzentrieren Sie die modRNA für die In-vivo-Lieferung durch Zentrifugalfilter und messen Sie die Qualität mit einer automatisierten Elektrophorese-Plattform (Materialtabelle).

2. Vorbereitung der modRNA-Injektion zur In-vivo-Lieferung

1. Berechnen Sie das Volumen, das für 100 g Luziferase (Luc)/Cre modRNA-Injektion benötigt wird, basierend auf der modRNA-Konzentration.
2. Mischen Sie das berechnete Volumen von modRNA mit gleichen Teilen der Saccharoselösung, die in nukleasefreiem Wasser (0,3 g/ml) und 0,1 M Citratlösung (pH = 7) (jeweils 20 l empfohlen) hergestellt werden.
3. Bringen Sie das Endvolumen der Injektion auf 60 l, indem Sie eine Salinelösung hinzufügen.

3. Myokardinfarktchirurgie

1. Anästhesie und Zubereitung des Tieres
   HINWEIS: Diese Studie verwendet männliche und weibliche CFW-Mäuse, die 8 bis 12 Wochen alt sind.
   1. Anästhesisieren Sie die Maus mit 2% Isoflurane mit einer Induktionskammer und legen Sie das Tier auf dem Rücken in eine rückende Position mit einer Gesichtsmaske über Nase und Mund, um die Anästhesie aufrecht zu erhalten. Bewahren Sie die Anästhesie durch mechanische Belüftung mit einem Atemschutzgerät, das mit einem 7-8 mm Atemwegsrohr und einem Filter ausgestattet ist.
   2. Um die Maus auf der Operationsplattform zu immobilisieren, sichern Sie ihre Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband. den Nackenbereich und die linke Seite des Brustkorbs rasieren und mit 70% Ethanol und Povidonjod desinfizieren. Wiederholen Sie den Desinfektionsschritt zweimal. Überprüfen Sie seine Reflexe, kneifen Sie den Schwanz und die Hinterfüße, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen.
   3. Kontinuierliche Überwachung und Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur bei Normothermie (37,5 bis 38 °C).
   4. Erhalten Sie eine offene Luft, indem Sie intratrachealen Intubationen durchführen. Um dies zu tun, legen Sie die Maus in eine ventrale Position mit dem Mund in Richtung des Experimentators und ziehen Sie sanft die Zunge heraus. Stellen Sie den Winkel des Halses ein und richten Sie den Intubationspfad aus und schieben Sie die Intubationskanüle ein.
   5. Falls das Tier nicht durchatmen kann, kann eine Tracheostomie durchgeführt werden. Führen Sie einen Zervixschnitt entlang der Mittellinie durch, der die Haut, den Muskel und das Gewebe isoliert und die Luftröhre mit einem Mikroskop umreißt. Wenn die Luftröhre deutlich sichtbar ist, legen Sie das Endotrachealrohr zwischen zwei Patronenringen unter den Glottis in das Gewebe ein, indem Sie ein kleines Loch bilden und den Schädelteil der Luftröhre mit mikrochirurgischen Zangen halten.
   6. Beobachten Sie die Brustbewegung der Maus, um zu überprüfen, ob beide Lungen Sauerstoff erhalten. Die Atemfrequenz (RR) sollte etwa 120 Atemzüge pro Minute betragen, mit einem Inspiratordruck von 17 bis 18 cm H₂O.
2. Linke vordere Absteigende (LAD) Arterieligation
   1. Um die LAD-Ligation durchzuführen, drehen Sie die Maus vorsichtig, so dass sie auf der rechten Seite liegt. Heben Sie die Haut und führen Sie eine linke Seite Thorakotomie zwischen der 3. und 4. Rippe und sezieren Sie das Gewebe und Denmuskel sorgfältig. Verwenden Sie eine Kauterie, um Blutungen zu verhindern.
   2. Öffnen Sie den Thorax vorsichtig und sobald er offen ist, finden Sie das Herz, ohne die Lunge mit einem scharfen Gegenstand zu berühren. Legen Sie die Retraktoren in den Schnitt, um die Brusthöhle offen zu halten und haben einen klaren Blick auf das Herz. Bewegen Sie nun die Lunge an den Rand des Einschnitts und entfernen Sie den Teil des Perikardsacks, der das Herz bedeckt, um auf die vordere Oberfläche des Herzens zuzugreifen.
   3. Identifizieren Sie sorgfältig den LAD, der als ein tiefhelles rotes Gefäß zwischen der Lungenarterie und der linken Aurikel gesehen werden kann. Ligate die LAD proximal mit einer einzigen Naht einer 7-0 Seidennaht. Legen Sie ein Brustrohr (28 G, Venalkatheter), zwischen der 4. und 5. Rippe.
   4. Schließen Sie den Thoraxschnitt in Schichten. Verwenden Sie die 6-0 Seiden-Laufnähte, um die Rippen anzupassen und verwenden Sie 5-0 Seidenlaufnähte, um die Haut zu schließen. Achten Sie darauf, ein richtiges Fenster für zukünftige echokardiographische Messungen zu hinterlassen.
   5. Den Thorax mit einer 2 ml Spritze vorsichtig mit warmer isotonischer Lösung (9 g Natriumchlorid in 1 L Wasser) abtropfen lassen. Legen Sie die Maus auf den Rücken. Wenn Sie eine Tracheostomie durchführen, nehmen Sie das Endotrachealrohr heraus und passen Sie die Trachealpatronenringe mit einem einzigen Stich an die Trachealpatronenringe an. Legen Sie die Gesichtsmaske auf die Maus und schließen Sie die Haut mit 5-0 Seiden-Laufnähten.
   6. Trennen Sie für die Erholungsphase die Intubationskanüle vom Beatmungsgerät und lassen Sie eine spontane Atmung zu. Legen Sie das Tier unter eine Wärmelampe, bis es das Bewusstsein erlangt. Lassen Sie das Tier nach der Operation nicht unbeaufsichtigt, bis es vollständig wach ist.
   7. Verwalten Sie die Schmerztherapie mit Buprenophin bei 0,1 mg/kg Körpergewicht, subkutan für die nächsten 3 Tage in 12 h Intervallen injiziert.

4. Herz-Lieferung von modRNA

1. Liefern Sie insgesamt 60 l der modRNA, die in Schritt 2.3 intramuskulär (IM) mit einer Insulinspritze (31 G) nach einem MI hergestellt wird.
   1. Injizieren Sie 20 l der modRNA an drei verschiedenen Stellen des Herzmuskels, die den Infarktbereich umgeben (zwei auf beiden Seiten der Ligation und eine in der Spitze). Führen Sie die Injektionen unmittelbar nach dem LAD durch, bevor Sie die Brust schließen.
      HINWEIS: Repräsentative Bilder von modRNA-Injektionsstellen sind in Abbildung 1zu sehen.

5. Proteinexpressionsvalidierung im Herz nach MI

1. Luciferase-ModRNA-Expression mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem
   ANMERKUNG: Nach dem MI werden insgesamt 100 g Luc mRNA, die in 60 l des Saccharose-Citratpuffers hergestellt werden, direkt in das Herz von CFW-Mäusen injiziert.
   1. Bei 24 h Post MI und modRNA Injektion, beanten die Mäuse mit 2% Isofluran mit einer Induktionskammer und intraperitoneally injizieren Luciferin (150 mg/g Körpergewicht), um das Luc-Signal in vivo zu validieren.
   2. Bildn ison die Mäuse mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem alle 2 min, bis das Luc-Signal die Sättigung erreicht.
   3. Quantifizieren Sie die gesammelten Bilddaten mit einer Imaging-Analysesoftware. Verwenden Sie die Mäuse, die mit Saline injiziert wurden, nur als Ausgangswert für den Luc-Ausdruck und subtrahieren Sie das Hintergrundsignal, das von den mit Einer Linie injizierten Mäusen gesammelt wurde.
      HINWEIS: Luc Signal wird in p/s/cm²/sr x 10⁶ausgedrückt.
2. Immunostainierung für die Cre-Transfektionsvalidierung
   1. Um die Transfektion mit Cre zu validieren, opfern Sie die Tiere 24 h Nachinjektion mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin gefolgt von zervikaler Dislokation. Vor einem Schnitt, desinfizieren Sie brust und abdomen mit einem 70% Alkoholabstrich.
   2. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie einen Querschnitt von 1 cm niedriger als das Brustbein machen und die Schere zum Kopf bewegen, indem Sie den Rippenkäfig durchschneiden.
   3. Öffnen Sie die Brust und injizieren Sie 1 ml steriles PBS in die rechte ventrikuläre Kammer, um überschüssiges Blut zu entfernen. Das Herz sofort verbrauchen und in das sterile PBS legen, um das restliche Blut wegzuwaschen.
   4. Fixieren Sie das Herz in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 24 h, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in 30% Saccharoselösung bei 4 °C. Am nächsten Tag die Herzen in optimale Schnitttemperatur Mittel einbetten und schneiden Sie sie mit einer Dicke von 10 m mit einem Kryostat.
   5. Stainieren Sie die Abschnitte mit primärem Antikörper gegen Herztroponin I (cTNI) und kennzeichnen Sie sie mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper. Um den Kern zu identifizieren, Färben Sie mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 5 min. Stellen Sie die Dias mit einem Fluoreszenzmikroskop.

6. Statistische Analyse

1. Zeichnen Sie ein Balkendiagramm basierend auf dem Luc-Ausdruck in saline- und Luc-injizierten Mäusen und melden Sie die Werte als Mittelwert . SEM. Vergleichen Sie die beiden Gruppen mit einem ungepaarten t-Test (****p < 0.0001).

Ergebnisse

Acht bis zehn Wochen alte Mäuse wurden mit Isofluran beanstandet und intubiert. Nachdem das Tier unter Anästhesie war, wurde die linke Brustregion rasiert und mit Ethanol sterilisiert, und das Herz wurde für LAD Ligation ausgesetzt. Die linke Koronararterie wurde durch festes Verknoten der Naht unter der Arterie verknotet (Diagrammdarstellung Abbildung 1A). Nach einem erfolgreichen Infarkt (angezeigt durch das Abschlagen der linksventrikulären freien Wand) wurde eine direkte Injektion von 10...

Diskussion

Die Gentherapie hat ein enormes Potenzial gezeigt, die Behandlung von Herzerkrankungen signifikant voranzutreiben. Jedoch, traditionelle Werkzeuge in den ersten klinischen Studien für die Behandlung von HF verwendet haben nur begrenzten Erfolg gezeigt und sind mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Modified RNA präsentiert eine nichtvirale Genabgabe, die als Gentransfer-Tool im Herzen kontinuierlich an Popularität gewinnt. ModRNA benötigt keine kernnukleare Lokalisierung von Genen für die Translation und bietet somit ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenosintriphosphat	Invitrogen	AMB13345	im Megascript-Kit enthalten
Antarktische Phosphatase	New England Biolabs	M0289L
Anti-Reverse-Cap-Analogon, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G	TriLink Biotechnologies	N-7003
Bioluminescense-Bildgebungssystem	Perkin Elmer	124262	IVIS100 Bildgebungssystem für ladungsgekoppelte Geräte
Stumpfe Retraktoren	FST	18200-09
Herztropnin I	Abcam	47003
Cytidintriphosphat	Invitrogen	AMB13345	Im Megascript-Kit enthalten
Duales Anästhesiesystem	Harvard Apparat	75-2001
Pinzette - Adson	FST	91106-12
Pinzette - Dumont #7	FST	91197-00
Guanosintriphosphat	Invitrogen	AMB13345	Im Megascript-Kit
In-vitro-Transkriptionskit	Invitrogen	AMB13345	5X MEGAscript T7 Kit
Intubationskanüle	Harvard-Gerät
Megaclear-Kit	Life Technologies
Maus-Beatmungsgerät	Harvard-Gerät	73-4279
N1-Methylpseudouridin-5-triphosphat	TriLink Biotechnologies	N-1081
NanoDrop Spektrometer	Thermo Scientific
Olsen Hegar Nadelhalter mit Nahtschere	FST	12002-12
Plasmidschablonen	GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Präparierschere mit scharfer Spitze	FST	14200-12
Stereomikroskop	Zeiss
Nähte	Ethicon	Y433H	5.00
Nähte	Ethicon	Y432H	6.00
Nähte	Ethicon	7733G	7.00
T7 DNase Enzym	Invitrogen	AMB13345	Im Megascript Kit
Klebebandstation	Aligent	4200
Transkriptions-Reinigungskit	Invitrogen	AM1908	Megaclear
Ultra-4 Zentrifugalfilter 10k	Amicon	UFC801096

enthalten enthalten