Summary
밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.
Abstract
유전자, 환경 및 농업 관행의 관리 사이의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리 할 수 있습니다. Metabolomics 데이터는 주어진 순간에 이 상호 작용의 판독을 제공하고 유기체의 생화확적인 상태의 유익합니다. 또한, 개별 대사 산물 또는 대사 산물의 패널은 수율 및 품질 예측 및 관리를위한 정확한 바이오 마커로 사용될 수있다. 식물 메타볼로메는 생리적 특성과 바이오마커 발견에 대한 생화학적 통찰력을 제공하는 다양한 물리화학적 특성을 가진 수천 개의 소분자를 함유할 것으로 예측됩니다. 이를 악용하기 위해, 대사체학 연구원의 주요 목표는 단일 분석 내에서 가능한 한 많은 물리 화학적 다양성을 포착하는 것입니다. 여기에서 우리는 필드 성장한 밀 곡물의 분석을 위한 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기지를 둔 표적으로 한 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 액체 크로마토그래피 사분면 용매 관리자를 사용하여 제 3 의 이상을 소개하고 전통적인 역상 그라데이션과 지질 -amenable 그라데이션을 결합합니다. 곡물 준비, 대사 산물 추출, 도구 분석 및 데이터 처리 워크플로우에 대해 자세히 설명합니다. 양호한 질량 정확도 및 신호 재현성이 관찰되었고, 이 방법은 이온화 모드당 약 500개의 생물학적으로 관련된 특징을 산출하였다. 또한, 밀 품종 간의 현저하게 다른 대사 산물 및 지질 특징 신호를 결정했습니다.
Introduction
농업의 유전자, 환경 및 관리 관행 간의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리할 수 있습니다. 식물 대사 산물은 게놈, 환경 (기후, 강우 등)과 같은 요인에 의해 영향을 받고 농업 환경에서 작물을 관리하는 방식 (즉, 비료, 살균제 등의 적용)에 의해 영향을받습니다. 게놈과는 달리, 대사체는 이 요인 전부에 의해 영향을 받고 그러므로 metabolomics 데이터는 특정 시간에 이 상호 작용의 생화확적인 지문을 제공합니다. 일반적으로 대사체학 기반 연구에 대한 두 가지 목표 중 하나가 있습니다: 첫째, 유기체의 생화학에 대한 깊은 이해를 달성하고 생리학과 관련하여 섭동 (생체 또는 생체 스트레스)에 대한 반응 메커니즘을 설명하는 데 도움이됩니다. 둘째, 바이오마커를 연구 하에 섭동과 연관시다. 두 경우 모두 이러한 지식을 보유한 결과는 수율 크기와 품질 향상이라는 목표를 달성하기 위한 보다 정확한 관리 전략입니다.
식물 메타볼로메는 다양한 물리 화학적 특성을 가진 수천개의 작은 분자를 포함할 것으로 예측됩니다. 현재, 어떤 대사체학 플랫폼 (주로 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법)은 단 하나 분석에서 전체 metabolome를 붙잡을 수 없습니다. 이러한 기술 개발 (샘플 준비, 대사 산물 추출 및 분석), 단일 분석 실행 내에서 가능한 한 대사 체의 큰 범위를 제공, 대사 체학 연구원에 대 한 주요 목표. 밀 곡물의 이전 비표적 대사체학 분석은 더 큰 대사체 범위를 위해 다중 크로마토그래피 분리 및 획득 극성 및/또는 계측에서 얻은 데이터를 결합했습니다. 그러나, 이것은 각 양식에 대해 별도로 준비하고 취득하는 견본을 요구했습니다. 예를 들어, Beleggia등 2는 비극성 분석물의 GC-MS 분석 이외에 극성 분석물의 GC-MS 분석을 위한 유도체 샘플을 제조하였다. Das etal.3은 GC- 및 LC-MS 방법을 모두 사용하여 분석에서 커버리지를 개선했습니다. 그러나, 이 접근법은 일반적으로 위에서 설명한 바와 같이 별도의 샘플 준비뿐만 아니라 두 개의 독립적인 분석 플랫폼이 필요합니다. GC-MS2,3,3,4 및 LC-MS33,5 플랫폼을 이용한 밀곡물의 이전 분석은 GC-MS에 대한 50 내지 412(55identified) 특징을 산출하였고, 409는 GC-MS 및 LC-MS를 결합하고 LC-MS 지질학 분석에 대해 수천 개의 특징을 산출하였다 5.5 단일 분석에 적어도 두 개의 모드를 결합하여 확장된 대사체 커버리지를 유지하여 생물학적 해석의 풍요로움을 높이는 동시에 시간과 비용을 모두 절감할 수 있습니다.
역상 크로마토그래피에 의해 광범위한 지질 종의 효율적인 분리를 허용하기 위해, 현대 지질학 방법론은 일반적으로 용출 용매6에서이소프로판올의 높은 비율을 사용하며, 그렇지 않으면 크로마토그래피에 의해 해결되지 않을 수 있는 지질 클래스에 대한 어플가능성을 제공한다. 효율적인 지질 분리를 위해, 시작 이동상은 또한 분자의 다른 클래스를 고려하는 전형적인 역상 크로마토그래피 방법보다 유기조성물 7에서 훨씬 더 높다. 그라데이션의 시작 부분에 높은 유기 조성물은 분자의 많은 다른 클래스에 이러한 방법을 덜 적합하게. 가장 주목할 만한, 역상 액체 크로마토그래피는 주로 수성 조성으로 시작하여 크로마토그래피의 용출 강도가 증가함에 따라 유기 함량이 증가하는 이진 용매 구배를 채용합니다. 이를 위해, 우리는 단일 분석 내에서 대사 산물의 지질 및 비 지질 클래스의 분리를 달성하기 위해 두 가지 접근법을 결합하고자했습니다.
여기에서는, 우리는 제 3 이상을 사용하고 단 하나 견본 준비 및 1개의 분석 컬럼을 사용하여 전통적인 반전상 및 lipidomics 적합한 크로마토그래피 방법을 결합하는 크로마토그래피 방법을 제시하는 것을 제시합니다. 당사는 주로 임상 대사체학 연구에서 이전에 구현된 많은 품질 관리 조치 및 데이터 필터링 단계를 채택했습니다. 이러한 접근법은 높은 기술적 재현성 및 생물학적 관련성을 가진 견고한 특징을 결정하는 데 유용하며 이러한 기준을 충족하지 않는 특징은 제외합니다. 예를 들어, 풀링된 QC 샘플8,QC 보정9,데이터 필터링9,,10 및 누락된 피처의대칭(11)의반복 분석을 설명합니다.
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Protocol
이 방법은 30개의 샘플(샘플당 약 150개의 시드)에 적합합니다. 10개의 다른 필드 재배 밀 품종의 3개의 생물학 복제본은 여기에서 이용되었습니다.
1. 곡물의 준비
- -80°C 저장고에서 샘플(통곡물)을 회수합니다.
참고: 여러 계절에 샘플을 채취하는 경우 수확 직후에 씨앗의 동결 건조를 권장합니다. 이것은 저장의 다양한 기간 후에 생길 수 있는 대사 산물 농도에 있는 어떤 변경든지 최소화합니다. 이렇게하려면 씨앗을 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브 (약 300 개의 씨앗이 튜브를 채울 것)로 옮기고 알루미늄 호일로 덮습니다. 핀을 사용하여 호일을 2-3회 관통하고 밤새 전체 곡물을 동결건조(약 24시간). 시료는 이 단계에서 -80°C 냉동고로 복귀되거나 다음 단계가 수행될 수 있다. - 20 s에 대 한 높은 모드에서 두 실행에 대 한 실험실 믹서기를 사용 하 여 씨앗을 갈기.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 블렌더는 블렌더를 블레이드 높이로 채우고 비교적 균일하게 분쇄된 곡물 샘플을 제공하기 위해 최소 150개의 씨앗이 필요합니다. - 베이스에서 블렌더를 제거하고 블렌더의 측면을 탭하여 거친 분쇄곡물을 시료 표면에 가져온다. 거친 재료는 폐기하거나 저장할 수 있습니다.
- 블렌더에서 2 mL 플라스틱 미세 원심 분리 튜브로 분말 과 같은 미세 분쇄 재료를 옮김.
참고: 블렌더를 탈이온수로 씻고 샘플 사이에 LC-MS 등급 MeOH로 헹구세요. 다음 시료로 진행하기 전에 블렌더가 완전히 건조한지 확인하십시오. - 잘게 간 곡물 샘플을 냉동실로 되돌리거나 다음 단계(대사 산물 추출)로 진행합니다.
2. 추출 용매의 준비
참고 : 추출을 수행하는 것과 같은 날에 추출 용매를 준비하십시오.
- 각 표준의 1 mg/mL의 적어도 2 mL를 준비하십시오. 아세토니트릴(ACN)을 사용하여 2-아미노아미노트라세네, 미코나졸 및 d 6-트랜스신나믹산을 준비합니다.6 물을 사용하여 13C6-sorbitol을 준비하십시오.
- 각 1 mg/mL 표준의 2 mL를 복용하고 100 mL 체적 플라스크에 추가하십시오.
- 아세토니트릴로 체적 플라스크를 라인에 채웁니다. 아세토니트릴 100 mL은 각 내부 표준의 20 μg/mL을 포함하고 있는지 확인합니다: 2-아미노아난트라세네, 미코나졸, 13C6-소르비톨, d6-transcinnamic 산.
3. 대사 산물 추출
- 200 mg의 미세하게 갈은 곡물을 2 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
- 500 μL의 추출 용매를 200 mg의 미세하게 분쇄된 곡물 샘플에 넣습니다.
- 6,500 rpm에서 20 s의 2 실행에 대한 균질 화제를 사용하여 혼합합니다.
- 4 °C에서 16,100 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급체를 2 mL 플라스틱 튜브로 옮김.
- 이 절차를 3.1단계에서 3.5번 더 반복하여 총 1.5mL의 상한 부피를 제공합니다.
- 상급을 혼합하는 소용돌이.
- 각 추출물의 동일한 부피(55 μL)를 별도의 2 mL 튜브로 옮겨 풀된 곡물 추출물 샘플을 만든다.
- 추출물의 50 μL aliquot를 유리 병으로 옮김.
참고: 추출물은 이 시점에서 동결(-80°C)하거나 다음 단계로 진행하여 LC-MS 분석을 진행할 수 있습니다.
4. LC-MS 분석을 위한 솔루션 준비
주의: 농축산의 경우, 항상 물/용매에 산을 첨가하십시오.
- 1 M 암모늄 포메이트 스톡 솔루션 50 mL을 준비하십시오. 3.153 g의 암모늄 포메이트의 무게와 50 mL 체적 플라스크로 옮긴다. LC-MS 등급 H2O로 선에 체적 플라스크를 채웁니다.
- 10 mM 암모늄 포메이트, 0.1% 포름산으로 구성된 이순상 A의 1 L을 준비한다. 이렇게 하려면 약 500 mL의 LC-MS 등급물을 1L 체적 플라스크에 추가합니다. 10 mM 암모늄 포메이트 스톡 1 m와 포름산 1 mL을 추가하십시오. LC-MS 등급 H2O. 1 L 병으로 전사하고 15 분 동안 초음파 처리하여 체적 플라스크를 채웁니다.
- 79:20:1 아소프로필 알코올:물, 0.1% 포름산 비율로 10 mM 암모늄 포메이트로 구성된 이순상 B의 1L를 준비한다. 1L 체적 플라스크에 이소프로판올 200mL를 추가합니다. 10 mM 암모늄 포메이트 스톡 1 m와 포름산 1 mL을 추가하십시오. 아세토니트릴로 선에 체적 플라스크를 채웁니다. 1L 병으로 옮기고 15 분 동안 초음파 처리하여 탈기하십시오.
참고: ACN을 추가하기 전에 1 M 암모늄 포메이트를 이소프로필 알코올(IPA)에 희석합니다. 암모늄 포메이트는 CAN에서 용해성입니다. - 89:10:1 이소프로필 알코올:아세토니트릴:물의 비율로 10 mM 암모늄 포메이트로 구성된 이순상 C의 1L를 준비한다. 이렇게 하려면 약 500 mL의 이소프로판올, 10 m m 암모늄 포메이트 스톡 10 m, 아세토니트릴 100 mL를 1 L 볼륨 플라스크에 추가하십시오. 이소프로판올로 라인을 채웁니다. 1L 병으로 옮기고 15 분 동안 초음파 처리하여 탈기하십시오.
- LC-MS 시스템 세척 용매의 제조
- 펌프 헤드 세척 솔루션을 신선한 용액으로 교체하십시오. 제조업체에서 권장하는 50% 메탄올, 10% 이소프로필 알코올 또는 기타 를 사용하십시오.
- 시료 주입 전과 다음 의 주입 유체를 세척하기 위한 강력하고 약한 바늘 세척 솔루션을 준비합니다. 강한 세척을 위해 ACN과 IPA의 동일한 볼륨을 추가하십시오. 약한 세척을 위해, 별도의 병에 10% ACN (이 프로토콜과 샘플 의 개수에 대해 각각 약 500 mL 및 1 L의 강력하고 약한 세척을 필요로 함)의 용액을 준비하십시오.
- 바늘 세척 량을 각각 600 μL 및 1800 μL로 설정하여 강력하고 약한 세척을 합니다.
5. LC-MS 분석을 위한 시료 준비
- 제조업체의 표준 작동 절차에 따라 400 ng/μL leucine enkephalin, 파이펫 7.5 mL의 물을 12 mL 류신 엔케팔린 바이알에 3 mg의 류신 엔케팔린을 함유하고 있다. 50 μL aliquots에서 -80 °C에서 동결합니다.
- 200 ng/mL 류신-엔케팔린(400 ng/μL 류신 엔케팔린의 50 μL)을 함유한 5% ACN의 100 mL을 준비합니다. LC-MS 분석과 같은 날에 준비합니다.
- 3단계에서 제조된 50 μL 샘플 알리쿼트에 주사 표준 류신-엔케팔린을 함유하는 5% 아세토니트릴의 950 μL을 첨가한다.
- 준비된 샘플을 혼합하는 소용돌이.
6. LC-MS 설정
참고: 계측기 및 획득 방법 설정에 대한 자세한 설명은 제조업체의 사용 설명서에 설명되어 있습니다. 일반 가이드와 이 프로토콜과 관련된 세부 정보는 아래에 설명되어 있습니다. 다음 단계는 데이터를 수집하기 전에 언제든지 완료할 수 있습니다.
- LC-MS 하드웨어 프로파일을 엽니다.
- 표 1에설명된 대로 크로마토그래피 방법을 설정합니다. LC 시스템에 이 그라데이션을 설정하기 위해 쿼터내 솔벤트 관리자가 장착되어 있는지 확인합니다.
참고: IPA는 점성 용매입니다. 낮은 유량으로 도입되어야 하며 조성물을 98.0%로 증가시키기 전에 충분한 평형 시간을 사용해야 한다. 이러한 단계를 수행하면 LC 시스템이 과도하게 가압 및 중지되는 것을 방지할 수 있습니다. - m/z 범위 50-1,300에 걸쳐 각각의 양수 및 음수 ToF-MS 모드에 대한 질량 분석기 수집 방법을 설정합니다.
참고: 여기에 제시된 작업에 사용되는 계측기는 개별적으로 보정및 실행하기 위해 양극및 음의 방법을 필요로 합니다(즉, 방법 내의 극성 전환은 불가능함). - LC 열이 새 열인 경우 제조업체의 권장 사항에 따라 열을 조건 지정합니다.
참고: 다음 단계는 데이터 수집 전에 직접 완료해야 합니다. - 'MS 전용' 하드웨어 프로파일에서 제조업체의 권장 사항에 따라 질량 분석기를 교정합니다. 각 수집 모드 이전에 이 단계를 완료하여 교정 전에 지정된 각 양식에서 시스템이 안정화되었는지 확인합니다.
- 이월 상 및 세척 용매를 포함한 LC-MS 등급 용매를 사용하여 LC 유체학 시스템을 제거하고 플러시합니다.
- LC 방법 시작 조건을 사용하여 LC 시스템의 균형을 조정하여 기둥 압력이 안정화되도록 합니다.
- 계측기 교정을 확인하기 위해 시료 시퀀스 의 시작 부분에 나트륨 포메이트(90% IPA에서 0.5 mM)를 주입합니다.
- 용매 및 준비 (추출) 공백이 먼저 분석되도록 계측기 시퀀스 테이블을 설정; 시스템 컨디셔닝을 위해 풀풀된 QC 샘플(6-10)이 뒤따릅니다. 그런 다음 QC 샘플이 있는 무작위 표본 목록은 기술 복제로 정기적으로(예: 다섯 번째 주입마다) 실행됩니다. 시퀀스의 끝에 두 개의 QC 샘플을 실행합니다.
참고: 샘플 파일 이름과 샘플 ID에 날짜 및 주입/수집 순서를 포함하는 것이 좋습니다. 예: YYYy는 복제할 number_Variety_Biological MMDD_Injection. 시작을 누르기 전에 LC 기둥 압력이 안정되고 LC가 MS에 연결되어 있는지 확인합니다.
7. 데이터 처리
참고: 일반적인 데이터 처리 워크플로는 그림 1에표시됩니다.
- 시퀀스가 실행되는 동안 데이터 품질(내부 표준 질량 정확도(아래 계산) 및 신호 재현성을 확인합니다. 신호 재현성을 확인하려면 중첩 스펙트럼의 육안 검사로 충분해야 합니다.
참고: 질량 오차(ppm) = ((이론질량 – 측정질량) / 이론질량) x 106 - 샘플 x 내부 표준(보존 시간 및 m/z 값에 의해 정렬)을 포함하는 정렬된 피크 강도 행렬을 생성합니다.
- 데이터 처리 소프트웨어를 엽니다(재료 표참조). 홈 > 열기에서 데이터를클릭합니다. 적절한 파일 위치로 이동하여 모든 데이터 파일을 엽니다.
- 홈 > 시퀀스 > 처리 유형에서드롭다운 메뉴에서 정량을 선택합니다.
- 홈 > 방법 > Quan에서 보정 구성 요소를클릭합니다. 표 2에제공된 세부 정보를 사용하여 각 필드를 채웁니다. 확인을 클릭합니다.
- 데이터 파일 옆의 열의 왼쪽 패널에서 셀을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 알 수 없음을선택하여 샘플 유형을 채웁니다. 레벨을 해당 레벨을 해당 레벨을 해당 수준으로 채우기.
- 홈 > 처리에서 시퀀스를선택합니다. 시퀀스를 저장할 위치를 선택한 다음 프로세스를 클릭합니다.
- 홈 > 결과에서 Quan을선택합니다. Quan 뷰어에서 행렬 분석기로 내보내기 실행을선택합니다.
- 행렬 분석기 결과 뷰어에서 csv로 내보내기를 클릭합니다. 파일을 스프레드시트 파일로 저장합니다.
- 스프레드시트 소프트웨어에서 각 내부 표준의 강도(피크 면적)의 평균, 표준 편차 및 상대 표준 편차를 계산합니다.
- 샘플 x 비표적 피쳐(보존 시간 및 m/z 값에 의해 정렬)를 포함하는 정렬된 피크 강도 행렬을 생성합니다.
- 소분자 발견 분석 소프트웨어를 열고(재료 표참조) 파일 > 새 파일을 선택하여 새 실험을 만듭니다. 실험의 이름을 지정하고 실험 파일을 저장하고 저장할 위치를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
- 사용되는 기기 유형(고분해능 질량 분석기), 데이터 형식(프로파일) 및 극성(양수 또는 음수)을 선택합니다. 다음을 클릭합니다. 라이브러리에서 사용할 수 있는 모든 도우미를 선택하고 필요에 따라 도우미 라이브러리를 편집합니다. 실험 만들기를 클릭합니다. 나머지 데이터 처리가 계속/발생하는 새 페이지가 로드됩니다.
- 데이터 파일을 가져옵니다. 파일 형식을 선택한 다음 가져오기를 선택합니다. 데이터 위치로 이동하여 가져올 데이터 파일을 선택합니다. 페이지 왼쪽 패널의 각 파일에 대한 진행률을 표시합니다.
- 데이터 파일을 가져오면 자동 처리 시작을선택합니다. 선형 참조를 선택하는 방법을 선택합니다. 소프트웨어가 적합성에 대한 모든 실행을 평가하거나, 적합한 샘플(즉, QC 샘플) 목록을 제공하거나, 중간 시퀀스 QC 샘플과 같은 가장 적합한 기준을 선택하도록 합니다. 예, 내 실행 및 다음을 자동으로 정렬합니다.
- 실험 디자인 페이지에서 다음을 선택합니다(나중에 설정할 수 있음).
- 피크 선택 수행을 선택한 다음 매개변수 설정. 피크 피킹 한계 탭에서 절대 이온 강도를 선택하고 100을입력합니다. 최소 피크 너비를 적용하고 0.01분 OK > Finish입력을 선택합니다. 처리가 완료되면 닫기를 선택합니다.
참고: 필요에 따라 다른 데이터 파일 형식에 대해 피크 피킹 제한을 최적화할 수 있습니다. - 화면 오른쪽 하단에서 완료 섹션을 선택합니다. 정렬된 실행을 검토하고 각 샘플이 참조에 정렬되어 있는지 확인합니다. 정렬 점수는 여기에 제시된 데이터에 대해 >90%였습니다. 단면 완료를 선택합니다.
- 다음 페이지에서 제목 디자인 중에서 선택합니다. 디자인의 이름을 지정합니다. 실행을 수동으로 그룹화하고 디자인 만들기를 선택합니다. Create design 조건을 추가하고 조건 1을 클릭하고 그룹 이름을 적절하게 지정합니다. 섹션을 완료를 클릭합니다.
참고: 소프트웨어 내에서 통계를 사용하기 위해 적절한 조건을 계속 추가합니다. 우리는 대상되지 않은 매트릭스를 생성하기 위해 소프트웨어를 사용했기 때문에 'all'이라고 표시된 단일 조건을 사용했습니다. - 다음 페이지에서 섹션 완료를 선택합니다. 피크 피킹을 다시 하지 마십시오.
- 디콘볼루션을 검토한 다음 섹션 완료를 클릭합니다.
- 파일 > 내보내기 복합 측정값으로 이동합니다. 출력에서 원하지 않는 속성을 선택 취소합니다. 확인을 클릭합니다. .csv 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 저장을 클릭 > 파일 열기 > 폴더 열기 또는 닫기.
- 추출 공백을 사용하여 데이터를 필터링하여 아티팩트(스프레드시트 소프트웨어)를 제거합니다.
- 각 RT x m/z 피쳐에 대해 새 열에서 추출 블랭크의 평균 응답을 계산합니다.
- 각 RT x m/z 피쳐에 대해 다른 모든 샘플(QC 샘플 포함)의 평균 응답을 계산합니다.
- 샘플에서 공백의 %의 피크 강도를 계산합니다(샘플의 공백/평균 응답의 평균 응답 x 100).
- 백분율 기여 열을 가장 낮은 값에서 가장 높은 값으로 정렬합니다.
- 블랭크에서 강도 기여도가 >5인 피처를 제거합니다.
- 누락된 값을 필터링하고 풀린 QC 샘플의 신호에 대한 기능 신호를 수정합니다.
- 데이터 처리소프트웨어(재료 표)를엽니다. 매트릭스 분석기 보기 단추를 클릭합니다. 데이터 파일 열기 버튼을 클릭합니다.
- 각 샘플에 대한 RT x m/z 피쳐의 피크 강도를 포함하는 .csv 파일 위치로 이동합니다(대상이 지정되지 않은 행렬). 열기를선택합니다.
- QC 샘플 탭에서 필요에 따라 각 매개 변수를 작성합니다. 여기에 설명된 데이터 집합의 경우 QC 범주=QC를 사용하고 범주=빈, impute type=없음, 커버리지 임계값=80, 크기 조정 없음, 로그 변환 취소, 올바른 using using =스무딩 스플라인, 스무딩=0.25를 무시합니다.
- 매트릭스 패널의 오른쪽 상단에 있는 재생 버튼 QC 보정을클릭합니다.
- 행렬 패널의 오른쪽 상단에서 보정을 수행한 후 결과 저장을클릭합니다. 적절한 위치로 이동하여 .csv 결과 파일을 저장합니다.
- 데이터를 필터링하여 QC 샘플에서 >20% RSD가 있는 기능을 제거합니다.
- 샘플이 행에 있고 피처가 열에 있도록 데이터를 정렬합니다.
- 새 컬럼에서 QC 샘플의 평균 피크 강도를 계산합니다.
- 새 컬럼에서 QC 샘플의 피크 강도의 표준 편차를 계산합니다.
- QC 샘플의 피크 강도의 상대 표준 편차를 계산합니다: (QC 표준 편차/QC 평균) x 100.
- 피처를 최저에서 가장 높은 %RSD로 정렬하고 QC RSD >20%가 있는 기능을 제거합니다.
- 데이터를 필터링하여 RSD샘플/RSD QC 비율이 낮은 피처를 제거합니다(예: <1).sample
- 새 열에서 샘플의 평균 피크 강도를 계산합니다.
- 새 컬럼에서 샘플의 피크 강도의 표준 편차를 계산합니다.
- 샘플의 피크 강도의 상대 표준 편차를 계산합니다: (샘플 표준 편차/샘플 평균) x 100.
- 새 열에서 샘플 RSD를 QC RSD로 나눕니다.
- 값(RSD샘플/RSDQC 비율)을 가장 높은 값에서 가장 낮은 값으로 정렬하고 비율 <1로 피처를 제거합니다.
- 누락된 값(온라인에서 사용할 수 있는 여러 방법)을 impute합니다.
- 샘플이 행에 있고 피쳐가 열에 있도록 스프레드시트의 서식을 지정합니다. 첫 번째 열은 샘플 파일 이름이어야 합니다. 파일 이름 옆에 추가 열을 만들고 샘플 그룹화를 입력합니다. 이 경우, 샘플을 다양성에 의해 그룹화하였다.
- 스프레드시트를 .csv 파일로 저장합니다.
- 고처리량 대사체학에 대한 웹 기반 분석 파이프라인의홈페이지로 이동하여(재료 표 참조) 여기를 클릭하여 시작하려면 여기를 클릭하십시오.
- 통계 분석을 클릭합니다. 데이터 업로드에서 데이터 유형: 피크 강도 테이블, 형식: 행샘플(페어링되지 않은) 다음 파일 선택을 선택합니다.
- .csv 파일로 이동한 다음 열기를 선택한 다음 제출을선택합니다.
- 다음 페이지에서 누락된 값 추정을선택합니다. 1단계 선택 취소(AnalyzerPro XD에서 수행되었습니다). 2단계에서 누락된 값을 추정하는 방법을 선택합니다.
참고: 여기에 제시된 데이터의 경우 'KNN'이 있는 '누락된 값 추정'이 선택되었습니다. - 이 단계에서 데이터 매트릭스를 다운로드하거나(웹 페이지의 왼쪽 패널에서 다운로드 선택) 추가 통계 분석을 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
식물 대사체는 게놈과 환경의 조합에 의해 영향을, 그리고 또한 농업 설정에서, 작물 관리 정권. 우리는 밀 품종 간의 유전적 차이가 대사 산물 수준에서 관찰 될 수 있음을 보여줍니다, 여기, 이상과 500 곡물 혼자 품종 사이의 상당히 다른 농도를 보여주는 측정 화합물. 양호한 질량 정확도(<10 ppm 오차) 및 내부 표준의 신호 재현성(<20% RSD)(그림2)은음극 및 양성 이온화 모드 모두에 대해 관찰되었다(표3). 기재된 시료 전처리 및 액체 크로마토그래피 질량 분광법 기반 분석은 음의 이온화 모드에서 >900 데톤볼루트 피처와 >1300 데톤볼루트 피처를 양성 이온화 모드에서 산출했습니다. 준비 블랭크(그림3)는시료 제제 및 분석 방법이 유물 특징을 도입했는지 여부를 결정하기 위해 포함되었고, 따라서 모든 비생물학적 영향이 데이터 매트릭스로부터 제거되었다. 네거티브 모드에서 421개의 신호와 835개의 신호가 곡물 샘플의 평균 신호 강도의 5% 이상과 같거나 더 큰 신호 강도를 가졌다는 것이 밝혀졌습니다. 이러한 특징은 제거되었고 추가 데이터 필터링 단계(7단계 및 도 1)후, 네거티브 모드는 483개의 특징을 반환하고 포지티브 모드는 523개의 특징을 반환하여 대사 스냅샷을 형성한다. 이 방법은 밀 품종 간의 강도가 현저히 다른 특징을 검출하는 데 성공했습니다(그림 4)두 이온화 모드에서 >500의 중요한 특징을 가지고 있습니다. 음이온화 모드에서, 중요한 특징의 대부분은 역위상 구배 및 양성 이온화 모드에서, 중요한 특징의 대부분은 지질 구배(도4)에있었다.
그림 1: 데이터 검사, 처리 및 필터링에 이 분석에 사용된 워크플로입니다. 1단계는 기기의 데이터 수집/보기 소프트웨어를 사용하여 수행되므로 '즉석' 평가를 수행할 수 있습니다. 여기에는 내부 표준의 질량 오차(ppm)를 계산하고 데이터 재현성을 시각적으로 평가하기 위해 내부 표준 피크를 오버레이하는 것이 포함됩니다. 2-7단계는 프로토콜, 7단계에 설명된 데이터 처리 절차를 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 추출된 이온 크로마토그램. 추출 된 이온 크로마토그램 13C6-소르비톨 (진한 파란색), 류신 엔케팔린 (핑크), d6-트랜스 계피산 (오렌지), 2-아미노 아미노 트라세센 (녹색) 및 미코나졸 (밝은 파란색) 내부 표준에 긍정적 인 (상단) 및 음질 (아래쪽) 전기 스프레이 이온화 (ESI) 모드. 내부 표준 보존 시간 및 강도가 표시됩니다. ESI + 및 ESI - 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 음수 모드(분홍색) 및 양수 모드(파란색) 획득을 나타내는 예비 블랭크의 총 이온 크로마토그램(TIC) 오버레이. 하나의 내부 표준, 미코나졸이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 총 이온 크로마토그램(TIC) 오버레이, 음수 모드(분홍색) 및 양수 모드(파란색) 획득 및 크로마토그래피 그라데이션 전반에 걸쳐 밀 품종 간에 유의하게 다른 피처 의 수. 네거티브 모드에서는 모바일 상 B 조성이 높을 때 가장 많은 중요한 특징이 발견되었습니다. 양수 모드에서는 이월 상 C 조성이 높았을 때 가장 많은 중요한 특징이 발견되었습니다. 하나의 내부 표준, 미코나졸이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세그먼트 | 시간 | 유량 | %A | %B | %C | 곡선 |
| (최소) | (mL/min) | |||||
| 1 | 초기 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
표 1: 이월 상 조성물의 액체 크로마토그래피 시간 제한 프로그램.
| 매개 변수 | 내부 표준 | ||||
| 13세 C6-소르비톨 | 류신 엔케팔린 | d6-트랜스시나믹산 | 2-아미노-안트라세네 | 미코나졸 | |
| 콴 m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| 질량 공차(amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| 보존 시간 | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| 보존 시간 | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| 감지 유형 | 최고 | 최고 | 최고 | 최고 | 최고 |
| 응답 유형 | 영역 | 영역 | 영역 | 영역 | 영역 |
| 영역 임계값 | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| 너비 임계값 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 높이 임계값 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 신호 대 잡음 비율 | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| 스무 딩 | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
표 2: 양수(및 음수) 수집 모드에서 내부 표준에 대한 피크 감지 매개변수입니다.
| 질량 정확도(ppm) | QC 보정 전 %RSD | QC 보정 후 %RSD | ||
| 네거티브 모드 | 13세 C6-소르비톨 | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-트랜스시나믹산 | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| 류신 엔케팔린 | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| 포지티브 모드 | 13세 C6-소르비톨 | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| 류신 엔케팔린 | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-트랜스시나믹산 | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-아미노안트라세네 | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| 미코나졸 | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
표 3:n샘플(n=30) 내부 표준 질량 정확도(ppm) 및 QC 보정 전후의 신호 재현성(%)은 상대적인 표준 편차(%)로 나타났다.
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Discussion
여기에서, 우리는 밀 곡물의 분석을 위한 LC-MS 기지를 둔 표적되지 않은 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 4개의 획득 모드(역단계 및 지질-반응성 역위상과 양성 및 음수 이온화)를 두 가지 모드로 결합하여 제3 의 이동상을 역위상 구배로 도입한다. 결합된 접근은 밀 품종 사이 강렬에 있는 이의 대략 반을 가진 이온 극성 당 대략 500의 생물학적으로 관련있는 특징을 산출했습니다. 다른 밀 품종의 곡물에서 대사 산물 농도의 중요한 변화는 질병 저항, 스트레스 허용 오차 및 곡물 품질및 수율에 중요한 다른 자형질 특성에 연결 될 수있는 변경 된 생화학을 나타냅니다. 예를 들어, 대사체학 접근법은 새로운 방어 메커니즘12를 설명하고 가뭄 내성13에서대사 산물의 역할을 제안하는 데 사용되어 왔다. 이 프로토콜의 향후 응용 프로그램은 특정 품종의 생화학 적 프로파일을 특정 환경 및 관리 관행에 바람직한 유전 적 특성에 추가로 연결할 수 있습니다. 차례로, 이것은 선택된 유전형을 위한 최적 입자 질 그리고 수율의 생산을 허용할 것입니다.
내부 표준을 포함하면 사용자가 신호, 보존 시간 이동 및 질량 정확도의 지표로 변경 사항을 결정할 수 있도록 이 프로토콜에 매우 중요합니다. 신호의 변화는 예를 들어, 서브 최적 추출, 주입(유체 시스템 차단 포함) 또는 검출기 성능을 나타낼 수 있습니다. 고정 시간 변화는 펌프 성능 저하, 부적절한 이월 상 그라데이션 평형 또는 LC 컬럼 고정 위상이 악화되었음을 나타낼 수 있습니다. 질량 정확도가 떨어지면 드리프트 교정을 나타낼 수 있으며 시스템에 다시 보정이 필요하다는 것을 나타낼 수 있습니다. 위의 모든 경우, 시스템을 중지해야하며, 부품의 적절한 유지 보수 / 교체가 수행된다. 우리는 곡물을 준비하는 데 사용되는 추출 솔루션에 네 가지 표준과 주입 전에 추가 된 최종 샘플의 표준을 포함시켰습니다. 각 이온화 모드에 대한 표준이 준수되고 다양한 보존 시간을 보장하기 위해 주의를 기울여야 했습니다. 그러나, 우리는 표준의 이 배열이 표지된 지질 표준의 포함으로 향상될 수 있었다는 것을 인정합니다. 밀 곡물은 수백 개의 트리아실 글리세롤 (TAGs)5를포함하고 있으며, 그 중 어느 것이이 프로토콜에 적합한 추가 될 것입니다. 준비 공백 및 풀링된 QC 샘플8의 포함도 이 프로토콜의 중요한 단계입니다. 수천 개의 이온 특징이 비표적 질량 분석 방법으로 감지되며 빈 샘플에만 존재하는 이광기능 및 분석 전반에 걸쳐 재현성으로 검출되지 않는 기능(즉, 높은 %RSD)을 제외하는 것이 중요합니다.
현재 방법은 상당한 시간과 자원을 절약하지만, 사분면 용매 관리자를 사용할 수없는 경우, 표준 역단계 및 지질 방법은 동일한 결과를 달성하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에 사용된 추출 볼륨은 추가 수집 모드 분석에 충분합니다. 이 프로토콜은 아세토니트릴 추출에 대해 설명합니다. 성공하는 동안, 대체 추출 용매, 또는 용매의 조합은, 차례로 더 많은 기능을 제공하고 / 또는 일부 화합물의 더 나은 (또는 더 적은) 추출 효율을 제공 할 수있는 다른 대사 산물 범위를 제공 할 것입니다. 우리는 이 프로토콜에서 해결된 통계적으로 유의한 측정의 대사 산물 신원을 확립하려고 시도하지 않았습니다. 그러나, 식물 대사 산물 및 지질에 대 한 질량 스펙트럼 데이터베이스를5사용할 수 있으며 개발5,14,,15. 대사 산물을 식별하기 위해 전체 스캔 데이터 외에도 질량 스펙트럼(MS/MS)을 수집해야 합니다. 이들은 풀화된 견본 및 적당한 MS/MS 방법을 사용하여 초기 실행 도중 또는 관심의 대사 산물이 결정되면 예약된 추출 (-80°C에서 저장)에 집합될 수 있습니다. 우리는 품종 사이의 화합물의 큰 배 변화를 관찰그래서 우리는 모두와 두 번째 인스턴스에서, 최고 품질의 MS / MS 스펙트럼을 얻기 위해 관심 화합물의 높은 농도를 포함하는 것으로 알려진 다양한을 사용하여 권장할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 서호주 프리미어의 농업 및 식품 펠로우십 프로그램 (일자리, 관광, 과학 및 혁신학과, 웨스턴 오스트레일리아 정부)과 프리미어 펠로우 인 사이먼 쿡 (센터 디지털 농업, 커튼 대학과 머독 대학). 현장 시험 및 곡물 샘플 수집은 서호주 의 지역 로열티 프로그램에 대한 정부의 지원을 받았습니다. 우리는 현장 시험에 기여한 그랜틀리 스테인러와 로버트 프랑스어를 인정합니다. NCRIS가 자금을 지원하는 바이오 플랫폼 오스트레일리아는 장비 자금 조달을 인정받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
