Methodenartikel

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

DOI:

10.3791/60861

⸱

19. Mai 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktuelle Methoden zur Analyse der Patientenbindung an komplexe medikamentenresistente Tuberkulose-Therapien (DR-TB) können ungenau und ressourcenintensiv sein. Unsere Methode analysiert Das Haar, eine leicht zu sammelnde und gelagerte Matrix, auf Konzentrationen von 11 DR-TB-Medikamenten. Mit LC-MS/MS können wir Sub-Nanogramm-Medikamentenspiegel bestimmen, die verwendet werden können, um die Arzneimittelhaftung besser zu verstehen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) ist eine wachsende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, und die Bewertung des therapeutischen Arzneimittelspiegels kann wichtige klinische Vorteile haben. Plasma-Medikamente sind die aktuelle Gold-Standard-Bewertung, erfordern aber Phlebotomie und eine Kühlkette, und erfassen nur sehr neue Adhärenz. Unsere Methode verwendet Haare, eine Matrix, die leicht gesammelt werden kann und reflektierend für die langfristige Einhaltung, um für 11 Anti-TB-Medikamente zu testen. Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigen, dass antiretrovirale Arzneimittelinihrer in Haaren mit HIV-Ergebnissen in Verbindung gebracht werden. Unsere Methode für DR-TB-Medikamente verwendet 2 mg Haar (3 cm proximal an der Wurzel), das pulverisiert und in Methanol extrahiert wird. Die Proben werden mit einer einzigen LC-MS/MS-Methode analysiert, die 11 Medikamente in einem 16-min-Lauf quantifiziert. Die niedrigeren Grenzwerte für die Quantifizierung (LLOQs) für die 11 Medikamente reichen von 0,01 ng/mg bis 1 ng/mg. Die Wirkstoffpräsenz wird durch den Vergleich von Verhältnissen zweier Massenspektrometrieübergänge bestätigt. Die Proben werden mit dem Flächenverhältnis des Arzneimittels zum deuterated, 15N- oder 13C-markierten Wirkstoff isotopologue quantifiziert. Wir verwendeten eine Kalibrierkurve von 0,001-100 ng/mg. Anwendung der Methode auf eine Convenience-Probe von Haarproben von DR-TB-Patienten auf direkt beobachtete Therapie (DOT) angegeben Arzneimittelspiegel im Haar innerhalb des linearen Dynamikbereichs von neun der elf Medikamente (Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol, Linezolid, Levofloxacin, Moxifloxacin, Clofazimin, Bedaquiline, Pretomanid). Kein Patient war auf Prothionamid, und die gemessenen Werte für Ethionamid waren in der Nähe seiner LLOQ (mit weiteren Arbeiten stattdessen die Eignung des Metaboliten von Ethionamid für die Überwachung der Exposition). Zusammenfassend beschreiben wir die Entwicklung eines Multi-Analyten-Panels für DR-TB-Medikamente in Haaren als eine Technik zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung während der medikamentösen TB-Behandlung.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im 21. Jahrhundert ist die medikamentenresistente TB (DR-TB) eine sich entwickelnde Katastrophe für bereits schwache nationale TB-Kontrollprogramme, wobei sich die bestätigten Fälle allein in den letzten 5 Jahren verdoppelt haben und fast ein Drittel aller Todesfälle im Zusammenhang mit AntimikrobiellenResistenzen weltweit1,2ausmachen. Die erfolgreiche Behandlung von DR-TB erforderte konventionell längere und toxischere Zweitlinientherapien als die Behandlung von medikamentenempfindlicher TB. Darüber hinaus haben Patienten mit DR-TB oft erhebliche bereits bestehende Herausforderungen bei der Adhärenz, die zur Entstehung von Resistenzen zunächst 3 beigetragenhaben.

Im Gegensatz zu einer HIV-Infektion, bei der virale Belastungen zur Überwachung der Behandlung verwendet werden können, sind Die Endpunkte der Behandlungsreaktion bei TB verzögert und auf einer individuellen Ebene4unzuverlässig. Die Überwachung der Patiententreue, einem wichtigen Prädiktor für die konzentration von Anti-TB-Medikamenten und Behandlungsversagen, ist ebenfalls eine Herausforderung. Selbst gemeldete Adhärenz leidet unter Rückruf-Bias und dem Wunsch, Anbieter5,6zu gefallen. Pillenzählungen und Medikamentenereignisüberwachungssysteme (MEMS) könnenobjektiver 7 sein, aber nicht den tatsächlichen Drogenkonsum messen8,9,10. Arzneimittelgehalte in Biomatrizen können sowohl Adhärenz als auch pharmakokinetische Daten liefern. Daher werden Plasma-Arzneimittelspiegel häufig in der therapeutischen Arzneimittelüberwachungverwendet 11,12. Im Rahmen der Überwachung der Arzneimitteltreue stellen die Plasmaspiegel jedoch eine kurzfristige Exposition dar und sind durch eine signifikante intra- und interpatienten-Variabilität bei der Bestimmung des geeigneten Referenzbereichs begrenzt. "White Coat"-Effekte, bei denen sich die Adhärenz vor Klinik- oder Studienbesuchen verbessert, erschweren die Fähigkeit des Plasmaspiegels, genaue Wirkstofftreuemuster zu liefern13.

Haar ist eine alternative Biomatrix, die langfristige Drogenexposition14,15messen kann. Viele Medikamente und endogene Metaboliten integrieren sich aus der systemischen Zirkulation in die Haarproteinmatrix, wenn das Haar wächst. Da dieser dynamische Prozess während des Haarwachstums fortbesteht, hängt die Menge des in der Haarmatrix hinterlegten Medikaments von der kontinuierlichen Anwesenheit des Medikaments im Kreislauf ab, was das Haar zu einer ausgezeichneten zeitlichen Auslesung der Medikamentenaufnahme macht. Haar als Biomatrix hat den zusätzlichen Vorteil, dass es im Vergleich zu Blut einfach ohne Kühlkette für Lagerung und Versand gesammelt werden kann. Darüber hinaus ist das Haar nicht biogefährlich, was zusätzliche Machbarkeitsvorteile auf dem Gebiet bietet.

Haardrogenspiegel sind seit langem in forensischen Anwendungen verwendet16. In den letzten zehn Jahren haben die Antiretroviral-Werte (ARV) bei der Beurteilung der Arzneimitteltreue bei der HIV-Behandlung und -Prävention, zu der unsere Gruppe beigetragen hat, einen Nutzen gezeigt. ARV-Spiegel in Haaren haben sich als die stärksten unabhängigen Prädiktoren der Behandlungsergebnisse bei HIV-Infektion17,18,19,20,21. Um festzustellen, ob die Haarstufen von DR-TB-Patienten den gleichen Nutzen bei der Vorhersage des Behandlungsergebnisses haben, haben wir LC-MS/MS verwendet, um eine Methode zur Analyse von 11 DR-TB-Medikamenten in kleinen Haarproben zu entwickeln und zu validieren. Als erste Bewertung der Leistung des Assays haben wir den DR-TB-Medikamentenspiegel in einer Convenience-Probe von Patienten mit DR-TB gemessen, die eine direkt beobachtete Therapie (DOT) im Westkap, Südafrika,erhielten 22.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Patienten erteilten vor der Entnahme von Haarproben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage. Wir erhielten die Genehmigung des Institutional Review Board von der University of Cape Town und der University of California, San Francisco.

1. Haarprobenahme

  1. Erhalten Sie eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage.
  2. Verwenden Sie eine saubere Schere, um etwa 20-30 Kopfhaut Haarsträhnen aus dem okzipitalen Bereich so nah wie möglich an der Kopfhaut zu schneiden.
  3. Legen Sie Klebeband um die distale Seite des Haares, um die Richtung anzuzeigen. Falten Sie die Haarprobe in ein Aluminiumfolienquadrat und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Beschriften Sie das distale Ende des Haares, um eine mögliche Kontamination durch zusätzliche Handhabung des proximalen Endes zu vermeiden.
  4. Zusätzlich zu den Patientenproben, sammeln "leere Haare": eine Kopfhaut-Haarprobe von jemandem, der keine TB-Medikamente genommen hat. Sammeln Sie eine große Menge (>30 mg leeres Haar für jede 20 Patientenproben).

2. Drogenextraktion

  1. Etikett Perlenrohre. Jede Patientenprobe benötigt eine Röhre. Beschriften Sie 12 Rohre von "C0" bis "C11", eine für jeden der 12 Kalibrierpunkte. Beschriften Sie ein Rohr für niedrige Qualitätskontrolle, ein Rohr für die mittlere Qualitätskontrolle und ein Rohr für die hohe Qualitätskontrolle. Beschriften Sie schließlich eine Röhre für Matrix Blank.
  2. Öffnen Sie das Aluminiumfolienquadrat mit Haarprobe. Wenn die Haarprobe länger als 3 cm ist, schneiden Sie das Haar 3 cm vom proximalen Ende entfernt und verwenden Sie diesen proximalen Teil für die Analyse.
  3. Wiegen Sie 2 mg der Haarprobe in ein Perlenrohr.
  4. Wiegen Sie 2 mg leeres Haar in 16 zusätzliche Perlenröhrchen. Diese werden als Kalibrierpunkte, Qualitätskontrollen und Matrixrohling verwendet. Die Schläuche werden dem gleichen Extraktionsverfahren wie die Patientenproben folgen, abgesehen davon, dass sie mit Medikamentenreferenzstandards auf den in den Schritten 2.8 und 2.9 angegebenen Werten gespickt sind.
  5. Legen Sie alle Perlenrohre in den Homogenisator. Führen Sie Homogenisator mit Geschwindigkeit 6,95 m/s. Laufen Sie für zwei Zyklen von je 30 s, mit einer 15 s Ruhezeit zwischen den beiden Zyklen.
  6. Erstellen Sie einen internen Standardmix, und fügen Sie ihn den Samples hinzu.
    1. Fügen Sie 40 ml Methanol in einen 50 ml Volumetkolben ein.
    2. In Bernsteinglasfläschchen, machen Sie die Mischungen der internen Standards in Tabelle 1gezeigt, mit Methanol als Lösungsmittel.
      HINWEIS: Methanol ist sehr flüchtig. Lassen Sie alle Durchstechflaschen während dieses Prozesses gekappt, um Verlust durch Verdunstung zu verhindern.
    3. Fügen Sie aus diesen Mischungen das in Tabelle 1 dargestellte Volumen dem 50 ml-Volumenkolben hinzu. Dann den Kolben auf 50 ml mit Methanol füllen.
    4. Kappen und mischen Sie den Volumetric-Kolben. Fügen Sie jedem der pulverisierten Haarröhrchen 500 l der Mischung hinzu, mit Ausnahme des Matrix-Rohrohrs. Fügen Sie dem Matrix-Rohrohr 500 L Methanol hinzu.
  7. Stellen Sie Referenzstandardmischungen vor.
    1. Stellen Sie saubere Referenzstandards der folgenden Medikamente mit Methanol dar, um die in der Tabelle in Schritt 2.7.2 aufgeführte Konzentration zu erhalten. Nur 1 ml der folgenden Konzentrationen sind erforderlich.
    2. Fügen Sie 1768 l Methanol in eine Durchstechflasche und fügen Sie dann die in Tabelle 2 aufgeführten Referenzstandards in dieselbe Durchstechflasche ein, um 2 ml Endvolumen zu erhalten. Beschriften Sie diese Durchstechflasche "Ref Std Mix 1x". Vortex.
    3. Spike 100 l von "Ref Std Mix 1x" in 900 l Methanol in einer neuen Durchstechflasche. Beschriften Sie diese Durchstechflasche "Ref Std Mix 10x". Vortex.
    4. Spike 100 l von "Ref Std Mix 10x" in 900 l Methanol in einer neuen Durchstechflasche. Beschriften Sie diese Durchstechflasche "Ref Std Mix 100x". Vortex.
    5. Spike 100 l von "Ref Std Mix 100x" in 900 l Methanol in einer neuen Durchstechflasche. Beschriften Sie diese Durchstechflasche "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
  8. Spike die Kalibrierkurvenrohre durch Hinzufügen der Menge an Ref Std Mix in Tabelle 3beschrieben .
  9. Erstellen Sie QC-Mischungen und Spike-Qualitätskontrollrohre.
    1. Label 5 Durchstechflaschen "QC-A" bis "QC-E".
    2. Fügen Sie den fünf gekennzeichneten Durchstechflaschen folgende Mengen Methanol hinzu:
      QC-A: 990 l
      QC-B: 940 l
      QC-C: 950 l
      QC-D: 980 l
      QC-E: 950 l
       
    3. Mit den 1 mg/ml-Arzneimittelbeständen, die in Schritt 2.7.1 erstellt wurden, fügen Sie 10 L zu den unten aufgeführten spezifischen Durchstechflaschen hinzu. Für die BDQ- und CLF-Bestände, die bei 0,5 mg/ml liegen, fügen Sie den unten aufgeführten Durchstechflaschen 20 l hinzu.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      HINWEIS: Einige Medikamente sind in mehreren Mischungen vorhanden.
    4. Beschriften Sie eine Durchstechflasche als "QC-A df100". Verdünnen Sie 10 l QC-A in 990 l Methanol.
    5. Beschriften Sie eine Durchstechflasche als "Low QC stock". Fügen Sie dieser Durchstechflasche 1832 L Methanol hinzu. Fügen Sie die unten aufgeführten Mengen an QC-Mischungen hinzu:
      QC-A df100: 80 l
      QC-B: 8 l
      QC-C: 80 l
       
    6. Beschriften Sie eine Durchstechflasche als "Mid QC stock". Fügen Sie dieser Durchstechflasche 760 L Methanol hinzu. Fügen Sie die unten aufgeführten Mengen an QC-Mischungen hinzu:
      QC-A df100: 800 l
      QC-B: 40 l
      QC-C: 400 l
       
    7. Beschriften Sie eine Durchstechflasche als "High QC stock". Fügen Sie dieser Durchstechflasche 1376 L Methanol hinzu. Fügen Sie die unten aufgeführten Mengen an QC-Mischungen hinzu:
      QC-D: 160 l
      QC-E: 320 l
      MFX, 1mg/ml Lagerbestand: 16 l
      INH, 1mg/ml Lagerbestand: 32 l
      LFX, 1mg/ml Lagerbestand: 32 l
      LZD, 1mg/ml Lagerbestand: 32 l
      PZA, 1mg/ml Lagerbestand: 32 l
       
    8. Spike 10 L Low QC Aktie in die Low QC Perlenröhre.
    9. Spike 10 L Mid QC Aktie in die Mid QC Perlenröhre.
    10. Spike 10 L High QC Aktie in die High QC Perlenröhre.
  10. Alle Rohre in heißer Shaker für 2 h bei 37 °C legen. Das Schütteln sollte so langsam sein, dass das Wasser nicht auf die Rohre spritzt.
  11. Entfernen Sie die Rohre vom Shaker. Flüssigkeit aus Perlenrohren in neue Mikrozentrifugenrohre übertragen. Diese Mikrozentrifugenrohre auf die gleiche Weise beschriften.
  12. Fügen Sie den alten Röhren 500 L Methanol hinzu. Kappe und Wirbel.
  13. Zum zweiten Mal Flüssigkeit aus den Perlenrohren in das entsprechende Mikrozentrifugenrohr übertragen. Es ist in Ordnung, pulverisiertes Haar zu übertragen. Dies wird schließlich herausgezentrt werden.
  14. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenrohre für 10 min bei 2.800 x g.
  15. Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig und übertragen Sie sie in neue Zentrifugenrohre mit entsprechenden Etiketten. Achten Sie darauf, das Haarpellet nicht zu stören oder zu übertragen.
  16. Verdampfen Sie die Flüssigkeit in den Zentrifugenrohren bei 32 °C zur Trockenheit.
  17. Rekonstituieren Sie die Proben, indem Sie den Trockenrohren 200 L mobilePhase A (HPLC-wasser mit 1% Ameisensäure) hinzufügen. Vortex.
  18. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf Bernsteinfläschchen mit 250 L Einsätzen.

3. LC-MS/MS-Vorbereitung

  1. Machen Sie einen Liter mobilePhase A (HPLC-wasser mit 1% Ameisensäure), indem Sie einem Ein-Liter-Volumenkolben etwas HPLC-Wasser hinzufügen. Dann 10 ml >95% Ameisensäure in diesen Kolben geben und dann mit HPLC-Wasser auf die Linie füllen.
    1. Machen Sie einen Liter mobile Phase B (Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure) durch Zugabe von etwas Acetonitril zu einem Ein-Liter-Volumenkolben. Dann 1 ml >95% Ameisensäure in diesen Kolben geben und dann mit Acetonitril auf die Linie füllen.
  2. Installieren Sie eine 2 x 100 mm-Säule mit einer Partikelgröße von 2,5 m und einer Porengröße von 100 mm mit polaren Enddeckel-Phenylperlen, die vollständig aus porösem Kieselsäure hergestellt sind. Stellen Sie sicher, dass in der Spalte auch die vom Hersteller empfohlene Schutzpatrone installiert ist.
  3. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware, und doppelklicken Sie auf Hardwarekonfiguration. Markieren Sie LCMS und klicken Sie auf Profil aktivieren.
    1. Klicken Sie auf Neues Unterprojekt, oder, falls bereits andere Unterprojekte vorhanden sind, auf Unterprojektkopieren . Benennen Sie das Unterprojekt.
    2. Klicken Sie auf Neues Dokument. Doppelklicken Sie auf Erfassungsmethode. Klicken Sie im Fenster "Erfassungsmethode" auf Massenspezifikation.
    3. Ändern Sie die Dropdown-Liste Scantype in MRM (MRM). Stellen Sie sicher, dass Polarität auf Positiveingestellt ist.
    4. Klicken Sie auf Importliste, und wählen Sie die .csv-Datei MDR-TB LCMS-Methode transitions.csv aus, die in ergänzenden Materialien enthalten ist.
    5. Scrollen Sie nach unten und stellen Sie die Dauer auf 16.751 min. Die entsprechende Zykluszeit und die Anzahl der Zyklen werden automatisch aufgefüllt.
    6. Klicken Sie in der linken Seitenleiste auf Integriertes Valco Ventil. Stellen Sie sicher, dass der Positionsname für Schritt 0 A ist. Geben Sie in der Spalte Gesamtzeit (min) 0,4 in der ersten Zeile und 13 in der zweiten Zeile ein.
    7. Legen Sie in der Spalte Position Zeile 1 auf B und Zeile 2 auf A fest.
    8. Klicken Sie in der linken Seitenleiste auf Binary Pump. Legen Sie die Verlaufs- und Durchflusstabelle gemäß Tabelle 4fest.
    9. Klicken Sie in der linken Seitenleiste auf Autosampler. Ändern Sie das Injektionsvolumen auf 10 l. Klicken Sie auf Temperaturregelung aktiviert und auf 4 °C eingestellt.
    10. Klicken Sie in der linken Seitenleiste auf Spaltenfach. Stellen Sie sowohl die rechten als auch die linken Temperaturen auf 50 °C ein.
    11. Schließen und speichern.
  4. Erstellen Sie den Stapel, indem Sie auf Neues Dokument klicken und Die Option "Stapel erwerben"auswählen. Geben Sie einen Satznamen ein, und wählen Sie die neu erstellte Methode aus der Dropdown-Leiste aus.
    1. Erstellen Sie in einer Kalkulationstabelle eine Charge, die dieser Reihenfolge folgt: Kalibrierungskurve, Qualitätskontrollen, Patientenproben, Kalibrierkurve, Qualitätskontrollen, Patientenproben, Kalibrierungskurve, Qualitätskontrollen. Fügen Sie Lösemittel-Rohlingsinjektionen am Anfang und AmEnde des Laufs sowie vor und nach der Kalibrierkurve, Qualitätskontrollen und Patientenproben hinzu. Legen Sie mindestens acht Lösungsmittel-Leerinjektionen nach Injektionen der Kalibrierkurve und hochwertige Kontrolldurchstechsons, um die Analytübertragung zu reduzieren.
      HINWEIS: Je nach Spaltenalter müssen möglicherweise mehr Lösungsmittel-Rohlingsinjektionen hinzugefügt werden.
    2. Geben Sie in der Spalte neben den Beispielnamen die entsprechende Autosampler-Position für die entsprechende Durchstechflasche ein.
    3. Klicken Sie auf Set hinzufügen. Geben Sie im Popupfenster die Anzahl der Samples im Batch ein.
    4. Kopieren und einfügen Sie Beispielnamen und Durchstechflasche-Positionen aus der Kalkulationstabelle in den neu erstellten Stapel.
    5. Gehen Sie auf die Registerkarte Senden. Klicken Sie auf Senden.
  5. Ausgleichssystem durch Einsetzen der Lösemittellinie A in die mobile Phase A und die Lösungsmittellinie B in die mobile Phase B. Öffnen Sie das Spülventil an der Binärpumpe.
    1. Setzen Sie die Lösungsmittelzusammensetzung auf 50% B bei 4 ml/min Durchfluss. Schalten Sie die binäre Pumpe ein.
    2. Nach 5 min verringern Sie den Durchfluss auf 0,3 ml/min. Schließen Sie das Spülventil. Überprüfen Sie, ob Lecks vorhanden sind.
    3. Drücken Sie in der Software Equilibrate auf der oberen Symbolleiste. Stellen Sie die Zeit auf >5 min, drücken Sie OK.
    4. Nachdem das Instrument ausgeglichen wurde, werden die Module unten rechts im Fenster grün angezeigt. Überprüfen Sie, ob sich der Druck stabilisiert hat, und starten Sie dann den Stapel, indem Sie auf Beispiel starten klicken.

4. Datenanalyse

  1. Nachdem der Batch abgeschlossen ist, öffnen Sie die Quantifizierungssoftware. Klicken Sie auf das Zauberstabsymbol, um eine neue Ergebnistabelle zu erstellen.
    1. Klicken Sie auf Durchsuchen, um zum entsprechenden Ordner zu navigieren, und markieren Sie dann die Datendatei, und klicken Sie auf den nach rechts zeigenden Pfeil, um die Daten in den ausgewählten Bereich zu verschieben. Klicken Sie auf Weiter.
    2. Wählen Sie Neue Methode erstellen aus, und klicken Sie auf Neu. Geben Sie einen neuen Namen der Quantifizierungsmethode ein, und drücken Sie Speichern und dann Weiter.
    3. Wählen Sie die erste Injektion des mittleren Kalibrierpunkts aus. Drücken Sie Weiter.
    4. Markieren Sie alle Übergänge der internen IS Standards in der IS-Spalte.
    5. Wählen Sie für die Quantifierübergänge für die Referenzstandards den entsprechenden IS in der Spalte IS-Name aus. Klicken Sie auf Weiter.
    6. Führen Sie einen Bildlauf durch die Übergänge durch, um sicherzustellen, dass die automatisch ausgewählte Aufbewahrungszeit korrekt ist. Stellen Sie sicher, dass Gaußsche Glättung auf 1.5 gesetzt ist. Alle anderen Standardeinstellungen können unverändert bleiben (d. h. Noise Percentage 100%, Baseline Sub. Fenster 2.00 min, Peak Splitting 2 Punkte).
      HINWEIS: Ändern Sie bei Bedarf die automatischen Integrationsparameter an dieser Stelle. Da sich diese Parameter auf der Grundlage des Instrumentenaufbaus ändern, haben wir unsere hier nicht berücksichtigt.
    7. Klicken Sie auf Fertig stellen, um die Quantifizierungsmethode auf den Stapel anzuwenden.
  2. Klicken Sie oben links Zeigt die Schaltfläche "Spitzenüberprüfung" an, um Chromatogramme anzuzeigen. Navigieren Sie mit der linken Seitenleiste durch die Übergänge. Scrollen Sie durch jede Injektion jedes Quantifierübergangs und integrieren Sie bei Bedarf manuell die richtige Spitze.
    1. Um eine Spitze manuell zu integrieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Manueller Integrationsmodus aktivieren, zoomen Sie in das Chromatogramm, indem Sie auf die x- oder y-Achse klicken und ziehen, und zeichnen Sie dann eine Linie von einer Basislinie zur anderen Basislinie, um die Spitze zu definieren. Abbildung 3 zeigt zwei Chromatogramme: eines mit INH und wurde daher manuell integriert, und ein anderes, das nicht über INH verfügt.
      HINWEIS: Alle Injektionen müssen mit den gleichen Parametern integriert werden. Die Spitzenbreite kann eine Richtlinie für die Einhaltung dieser Parameter bieten, aber manchmal unterscheidet sich die Spitzenbreite. Um einen Peak zu quantifizieren, muss die Retentionszeit innerhalb von 0,15 min der erwarteten Retentionszeit für diesen Analyten liegen (wie in den Referenzstandardspitzen definiert), qualitativ bestätigt, dass sie das erwartete Quantifizierer-Qualifizierer-Qualifizierer-Verhältnis aufweisen (siehe Abbildung 2), und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 10 aufweisen.
  3. Legen Sie in der Spalte Sample Type die Kalibrierkurveninjektionen (mit Ausnahme der leeren Kalibrierkurveninjektionen) auf Standardfest. Stellen Sie die Qualitätskontrollinjektionen auf Qualitätskontrolle ein. Lassen Sie die restlichen Injektionen als Unbekannt.
    HINWEIS: Dies wird für alle Übergänge festgelegt.
  4. Geben Sie in der Spalte Tatsächliche Konzentration die in Tabelle 5 für alle Kalibrierkurven- und Qualitätskontrollinjektionen zu findenden Konzentrationen ein.
  5. Klicken Sie auf die Sekunde oben links Zeigt die Schaltfläche Kalibrierungskurve an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Regression.
  6. Legen Sie Weighting Type auf 1/x fest und drücken Sie OK.
  7. Überprüfen Sie die Kalibrierkurve und die Qualitätskontrollproben, um sicherzustellen, dass die Charge erfolgreich ausgeführt wurde.
    1. Sehen Sie sich für jeden Quantifier-Referenzübergang (keine internen Standardübergänge) die Injektionsgenauigkeit der Kalibrierkurve (in der Spalte Genauigkeit) an. Mindestens zwei Drittel der Kalibrierpunkte müssen eine Genauigkeit zwischen 80-120% aufweisen.
    2. Bei Kalibrierpunkten, die weit außerhalb der erwarteten Genauigkeit liegen, kann die Injektion ein Ausreißer sein. Ausreißer ausschließen, wenn ihre berechnete Konzentration mehr als zwei Standardabweichungen von den beiden anderen Injektionen dieser Durchstechflasche entfernt ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche "et peak to 'not found button above each chromatogram.
    3. Überprüfen Sie, ob der r-Wert, der über der Kalibrierkurve angezeigt wird, >0,975 ist.
    4. Prüfen Sie, ob alle Qualitätskontrollinjektionen eine Genauigkeit von 80-120% aufweisen.
  8. Wenn alle oben genannten Bedingungen erfüllt sind, ist die Charge übergeben, und Proben können quantifiziert werden. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bearbeiten und dann auf Gesamte Tabelle kopieren. Fügen Sie die Tabelle in eine Kalkulationstabelle ein.
  9. Nehmen Sie den Durchschnitt der berechneten Konzentration der beiden Probeninjektionen, um die gemeldete Konzentration jeder Probe zu bestimmen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1zeigt ein Chromatogramm mit bestätigten Konzentrationen aller 11 DR-TB-Medikamente. Die Aufbewahrungszeit für jeden Analyten kann sich ändern, wenn verschiedene Instrumente und Spalten verwendet werden, sodass die genaue Aufbewahrungszeit individuell festgelegt werden sollte.

Die extrahierten Ionenchromatogramme (EiK) für ein bestimmtes Medikament (Isoniazid, INH) in einem der Kalibratoren (leere Haarprobe mit DR-TB-Referenzstandards) sind in

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir berichten hier über das Protokoll für die Methode, die wir zur Quantifizierung von 11 Anti-TB-Medikamenten entwickelt und validiert haben, die bei der Behandlung von DR-TB in kleinen Haarproben mit LC-MS/MS verwendet werden. Keine andere Methode zur Quantifizierung dieser 11 Medikamente in Haaren wurde zuvor entwickelt, validiert und veröffentlicht. Unsere Methode kann Sub-Nanogramm-Spiegel von Medikamenten in nur 20-30 Haarsträhnen von etwa 3 Zentimetern (cm) Länge quantifizieren und wurde bereits2...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe und Monica Gandhi) unterstützt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail und Marietjie Pretorius vom Lung Institute der Universität Kapstadt, die die Entnahme von Haarproben für die Studie erleichtert haben. Die Autoren würdigen ferner die Beiträge der Teilnehmer dieser Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-mL-InjektionsphiolenAgilent Technologien5182-0716
250-uL-Injektionsphiol-EinsätzeAgilent Technologien5181-8872
Perlenruptor 24OMNI International19001
Perlen-Ruptorröhren (2 mL Perlenkit, 2,8 mm Keramik, 2 ml Mikroröhren)OMNI International19628
BedaquilineToronto ForschungschemikalienB119550
Bedaquiline-d6Toronto ForschungschemikalienB119552
ClofaziminToronto ForschungschemikalienC324300
Clofazimin-d7Toronto ForschungschemikalienC324302
Einweg-Kalkglas-KulturröhrenVWR60825-425
EthambutolToronto ForschungschemikalienE889800
Ethambutol-d4Toronto ForschungschemikalienE889802
EthionamidToronto ForschungschemikalienE890420
Ethionamid-d5ClearSynthCS-O-06597
AmeisensäureSigma-AldrichF0507-100mL
GlasflaschenCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologienInfinity 1260
HPLC-QualitätsacetonitrilHoneywell015-4
HPLC-Qualitäts-MethanolHoneywell230-1L
HPLC-QualitätswasserAqua Solutions Inc.W1089-4L
IsoniazidToronto ForschungschemikalienI821450
Isoniazid-d4Toronto ForschungschemikalienI821452
LC-Säule, Synergi 2,5 μm Polar RP 100 A 100 x 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
LC-SchutzpatronePhenomenexAJ0-8788
LC-SchutzpatronenhalterPhenomenexAJ0-9000
LC-MS/MS-QuantitationssoftwareSciexMultiquant 2.1
LevofloxacinSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacin-d8Toronto ForschungschemikalienL360002
LinezolidToronto ForschungschemikalienL466500
Linezolid-d3Toronto ForschungschemikalienL466502
MikrozentrifugenröhrenE& K Scientific695554
MoxifloxacinToronto ForschungschemikalienM745000
Moxifloxacin-13C, d3Toronto ForschungschemikalienM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto ForschungschemikalienO667600
Pretomanid (PA-824)Toronto ForschungschemikalienP122500
ProthionamidToronto ForschungschemikalienP839100
Prothionamid-d5Toronto ForschungschemikalienP839102
PyrazinamidToronto ForschungschemikalienP840600
Pyrazinamid-15N, d3Toronto ForschungschemikalienP840602
Septumkappen für InjektionsphiolenAgilent Technologien5185-5862
Turbovap LV-VerdampferBiotage103198/11

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  4. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
  5. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
  6. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
  7. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511(2013).
  8. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
  9. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
  10. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  11. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
  12. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
  13. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
  14. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
  15. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
  16. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
  17. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
  18. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
  19. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
  20. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100(2015).
  21. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  22. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729(2019).
  23. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
  24. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877(2015).

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