Methodenartikel

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

DOI:

10.3791/60861

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19. Mai 2020

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1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Aktuelle Methoden zur Analyse der Patientenbindung an komplexe medikamentenresistente Tuberkulose-Therapien (DR-TB) können ungenau und ressourcenintensiv sein. Unsere Methode analysiert Das Haar, eine leicht zu sammelnde und gelagerte Matrix, auf Konzentrationen von 11 DR-TB-Medikamenten. Mit LC-MS/MS können wir Sub-Nanogramm-Medikamentenspiegel bestimmen, die verwendet werden können, um die Arzneimittelhaftung besser zu verstehen.

Zusammenfassung

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Arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) ist eine wachsende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, und die Bewertung des therapeutischen Arzneimittelspiegels kann wichtige klinische Vorteile haben. Plasma-Medikamente sind die aktuelle Gold-Standard-Bewertung, erfordern aber Phlebotomie und eine Kühlkette, und erfassen nur sehr neue Adhärenz. Unsere Methode verwendet Haare, eine Matrix, die leicht gesammelt werden kann und reflektierend für die langfristige Einhaltung, um für 11 Anti-TB-Medikamente zu testen. Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigen, dass antiretrovirale Arzneimittelinihrer in Haaren mit HIV-Ergebnissen in Verbindung gebracht werden. Unsere Methode für DR-TB-Medikamente verwendet 2 mg Haar (3 cm proximal an der Wurzel), das pulverisiert und in Methanol extrahiert wird. Die Proben werden mit einer einzigen LC-MS/MS-Methode analysiert, die 11 Medikamente in einem 16-min-Lauf quantifiziert. Die niedrigeren Grenzwerte für die Quantifizierung (LLOQs) für die 11 Medikamente reichen von 0,01 ng/mg bis 1 ng/mg. Die Wirkstoffpräsenz wird durch den Vergleich von Verhältnissen zweier Massenspektrometrieübergänge bestätigt. Die Proben werden mit dem Flächenverhältnis des Arzneimittels zum deuterated, 15N- oder 13C-markierten Wirkstoff isotopologue quantifiziert. Wir verwendeten eine Kalibrierkurve von 0,001-100 ng/mg. Anwendung der Methode auf eine Convenience-Probe von Haarproben von DR-TB-Patienten auf direkt beobachtete Therapie (DOT) angegeben Arzneimittelspiegel im Haar innerhalb des linearen Dynamikbereichs von neun der elf Medikamente (Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol, Linezolid, Levofloxacin, Moxifloxacin, Clofazimin, Bedaquiline, Pretomanid). Kein Patient war auf Prothionamid, und die gemessenen Werte für Ethionamid waren in der Nähe seiner LLOQ (mit weiteren Arbeiten stattdessen die Eignung des Metaboliten von Ethionamid für die Überwachung der Exposition). Zusammenfassend beschreiben wir die Entwicklung eines Multi-Analyten-Panels für DR-TB-Medikamente in Haaren als eine Technik zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung während der medikamentösen TB-Behandlung.

Einleitung

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Im 21. Jahrhundert ist die medikamentenresistente TB (DR-TB) eine sich entwickelnde Katastrophe für bereits schwache nationale TB-Kontrollprogramme, wobei sich die bestätigten Fälle allein in den letzten 5 Jahren verdoppelt haben und fast ein Drittel aller Todesfälle im Zusammenhang mit AntimikrobiellenResistenzen weltweit1,2ausmachen. Die erfolgreiche Behandlung von DR-TB erforderte konventionell längere und toxischere Zweitlinientherapien als die Behandlung von medikamentenempfindlicher TB. Darüber hinaus haben Patienten mit DR-TB oft erhebliche bereits bestehende Herausforderungen bei der Adhärenz, die zur ....

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Protokoll

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Alle Patienten erteilten vor der Entnahme von Haarproben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage. Wir erhielten die Genehmigung des Institutional Review Board von der University of Cape Town und der University of California, San Francisco.

1. Haarprobenahme

  1. Erhalten Sie eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage.
  2. Verwenden Sie eine saubere Schere, um etwa 20-30 Kopfhaut Haarsträhnen aus dem okzipitalen Bereich so nah wie möglich an der Kopfhaut zu schneiden.
  3. Legen Sie Klebeband um die distale Seite des Haares, um die Richtung anzuzeigen. Falten Sie die Haarprobe in ein Aluminiumfoli....

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Ergebnisse

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Abbildung 1zeigt ein Chromatogramm mit bestätigten Konzentrationen aller 11 DR-TB-Medikamente. Die Aufbewahrungszeit für jeden Analyten kann sich ändern, wenn verschiedene Instrumente und Spalten verwendet werden, sodass die genaue Aufbewahrungszeit individuell festgelegt werden sollte.

Die extrahierten Ionenchromatogramme (EiK) für ein bestimmtes Medikament (Isoniazid, INH) in einem der Kalibratoren (leere Haarprobe mit DR-TB-Referenzstandards) sind in

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Diskussion

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Wir berichten hier über das Protokoll für die Methode, die wir zur Quantifizierung von 11 Anti-TB-Medikamenten entwickelt und validiert haben, die bei der Behandlung von DR-TB in kleinen Haarproben mit LC-MS/MS verwendet werden. Keine andere Methode zur Quantifizierung dieser 11 Medikamente in Haaren wurde zuvor entwickelt, validiert und veröffentlicht. Unsere Methode kann Sub-Nanogramm-Spiegel von Medikamenten in nur 20-30 Haarsträhnen von etwa 3 Zentimetern (cm) Länge quantifizieren und wurde bereits2.......

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Offenlegungen

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe und Monica Gandhi) unterstützt.

Danksagungen

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Die Autoren danken Professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail und Marietjie Pretorius vom Lung Institute der Universität Kapstadt, die die Entnahme von Haarproben für die Studie erleichtert haben. Die Autoren würdigen ferner die Beiträge der Teilnehmer dieser Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-mL-InjektionsphiolenAgilent Technologien5182-0716
250-uL-Injektionsphiol-EinsätzeAgilent Technologien5181-8872
Perlenruptor 24OMNI International19001
Perlen-Ruptorröhren (2 mL Perlenkit, 2,8 mm Keramik, 2 ml Mikroröhren)OMNI International19628
BedaquilineToronto ForschungschemikalienB119550
Bedaquiline-d6Toronto ForschungschemikalienB119552
ClofaziminToronto ForschungschemikalienC324300
Clofazimin-d7Toronto ForschungschemikalienC324302
Einweg-Kalkglas-KulturröhrenVWR60825-425
EthambutolToronto ForschungschemikalienE889800
Ethambutol-d4Toronto ForschungschemikalienE889802
EthionamidToronto ForschungschemikalienE890420
Ethionamid-d5ClearSynthCS-O-06597
AmeisensäureSigma-AldrichF0507-100mL
GlasflaschenCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologienInfinity 1260
HPLC-QualitätsacetonitrilHoneywell015-4
HPLC-Qualitäts-MethanolHoneywell230-1L
HPLC-QualitätswasserAqua Solutions Inc.W1089-4L
IsoniazidToronto ForschungschemikalienI821450
Isoniazid-d4Toronto ForschungschemikalienI821452
LC-Säule, Synergi 2,5 μm Polar RP 100 A 100 x 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
LC-SchutzpatronePhenomenexAJ0-8788
LC-SchutzpatronenhalterPhenomenexAJ0-9000
LC-MS/MS-QuantitationssoftwareSciexMultiquant 2.1
LevofloxacinSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacin-d8Toronto ForschungschemikalienL360002
LinezolidToronto ForschungschemikalienL466500
Linezolid-d3Toronto ForschungschemikalienL466502
MikrozentrifugenröhrenE& K Scientific695554
MoxifloxacinToronto ForschungschemikalienM745000
Moxifloxacin-13C, d3Toronto ForschungschemikalienM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto ForschungschemikalienO667600
Pretomanid (PA-824)Toronto ForschungschemikalienP122500
ProthionamidToronto ForschungschemikalienP839100
Prothionamid-d5Toronto ForschungschemikalienP839102
PyrazinamidToronto ForschungschemikalienP840600
Pyrazinamid-15N, d3Toronto ForschungschemikalienP840602
Septumkappen für InjektionsphiolenAgilent Technologien5185-5862
Turbovap LV-VerdampferBiotage103198/11

Referenzen

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  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Pre....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Haaranalysetherapeutisches Drug MonitoringMulti Analyt QuantifizierungfestphasenextraktionsfreiMethanolextraktionIsotopolog InternstandardValidierung der Kalibrierkurvedirekt beobachtete Therapie

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