Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Entwicklung intrazellulärer Proteinsensoren in Säugetierzellen

2.8K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28. April 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung genetisch kodierter intrazellulärer Protein-Sensor-Aktuatoren vor. Das Gerät weist Zielproteine spezifisch über intrazelluläre Antikörper (Intrabodies) nach und reagiert mit dem Einschalten der Gentranskriptionsausgabe. Es wurde ein allgemeiner Rahmen entwickelt, um Intrakörper schnell zu ersetzen und einen schnellen Nachweis jedes gewünschten Proteins zu ermöglichen, ohne die allgemeine Architektur zu verändern.

Zusammenfassung

Proteine können als Biomarker für pathologische Zustände wie neurodegenerative Erkrankungen, Infektionen oder metabolische Syndrome fungieren. Die Entwicklung von Zellen, die diese Biomarker erkennen und darauf reagieren, kann zum Verständnis der molekularen Mechanismen beitragen, die Pathologien zugrunde liegen, sowie zur Entwicklung neuer zellbasierter Therapien. Es wurden zwar mehrere Systeme zum Nachweis extrazellulärer Proteine entwickelt, aber es fehlte ein modulares Framework, das leicht umgebaut werden kann, um verschiedene intrazelluläre Proteine zu erkennen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Implementierung einer modularen genetischen Plattform, die intrazelluläre Proteine erkennt und eine spezifische zelluläre Reaktion aktiviert. Das Gerät arbeitet mit intrazellulären Antikörpern oder kleinen Peptiden, um das interessierende Protein mit hoher Spezifität zu erfassen und die transkriptionelle Aktivierung von Ausgangsgenen durch ein TEV-Protease (TEVp)-basiertes Aktuatormodul auszulösen. TEVp ist eine virale Protease, die selektiv kurze verwandte Peptide spaltet und aufgrund ihrer hohen Orthogonalität zur Spaltstelle in der Biotechnologie und synthetischen Biologie weit verbreitet ist. Insbesondere haben wir Geräte entwickelt, die Protein-Biomarker von Virusinfektionen und genetischen Krankheiten erkennen und darauf reagieren, einschließlich mutiertem Huntingtin, NS3-Serin-Protease, Tat- und Nef-Proteinen, um Infektionen mit der Huntington-Krankheit, dem Hepatitis-C-Virus (HCV) bzw. dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) nachzuweisen. Wichtig ist, dass das System von Hand auf das gewünschte funktionelle Input-Output-Ergebnis zugeschnitten werden kann, wie z. B. Fluoreszenzanzeigen für Biosensoren, Stimulation der Antigenpräsentation für die Immunantwort oder Initiierung der Apoptose zur Eliminierung ungesunder Zellen.

Einleitung

Die Erforschung und Modulation zellulärer Reaktionen über kontrollierbare manipulierte Genschaltkreise sind wichtige Ziele in der Synthetischen Biologie 1,2,3 für die Entwicklung prospektiver Werkzeuge mit relevanten biologischen oder medizinischen Anwendungen in den Bereichen Krebs 4, Infektionen5, Stoffwechselerkrankungen6 und Immunologie7.

Die Neuprogrammierung von Zellfunktionen als Reaktion auf bestimmte Signale erfordert die Entwicklung intelligenter Schnittstellen, die die Erfassung extrazellulärer oder intrazellulärer dynamischer Veränderungen (Input) mit der nachgelagerten Verarbeitung verknüpfen und entweder zu diagnostischen Zwecken (z. B. Reportergene) oder zur Neuverdrahtung der Zellantwort (Therapeutika) spezifische Ausgaben auslösen. Bei den von dem Sensormodul detektierten Eingängen kann es sich um kleine Analyten8, Proteine9, 10, 11 oder microRNAs11, 12, 13 handeln, die spezifisch für den Ausbruch oder das Fortschreiten einer Krankheit sind. Darüber hinaus kann eine komplexe Schaltkreisregulation durch die Verarbeitung von Informationen mit mehreren Eingaben erreicht werden, wodurch die strenge Kontrolle über die Transgenexpression als Reaktion auf die definierten Bedingungen erhöhtwird 14,15,16. Beispielsweise können microRNA-basierte Sensoren bestimmte Zelltypen, wie z. B. Krebszellen, identifizieren und deren Clearance mit der Expression eines apoptotischen Gensinduzieren 13. Da microRNAs in synthetischen Schaltkreisen auf modulare Weise leicht implementiert werden können, stellen sie einen weit verbreiteten Input für genetisch kodierte Biosensorendar 12,13,17. Proteine sind auch ein gültiger Biomarker für genetische Mutationen, Krebs und Infektionen, und in der Tat wurde über eine Reihe von extrazellulären Proteinsensorgeräten berichtet18,19.

Viele der Schaltkreise, die extrazelluläre Proteine nachweisen, beruhen auf der Verwendung von manipulierten Rezeptoren, die einen Transkriptionsfaktor (TF) an die Membran binden, der mit einer TEVp-responsiven Spaltstelle (TCS) fusioniert ist. Ein großer Vorteil des TEVp ist die Spezifität der Spaltung und die fehlende Interferenz mit der endogenen Proteinverarbeitung. In diesen Systemen ist TEVp mit einem zweiten Peptid fusioniert, das bei der Bindung der extrazellulären Moleküle mit dem manipulierten Rezeptor interagiert. Somit induzieren die externen Eingänge eine TEVp-vermittelte Spaltung und TF-Freisetzung. Systeme, die mit diesem Mechanismus funktionieren, sind Tango/TEVp18, lichtinduziert20 und Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)19. Trotz Fortschritten beim Nachweis extrazellulärer Proteine wurde die Technologie zur modularen Detektion intrazellulärer Proteine noch nie zuvor realisiert, mit der Einschränkung, dass viele Build-and-Test-Iterationen für einzelne Geräte durchlaufen werden müssen, die auf ein bestimmtes Protein reagieren.

Unser System ist die erste Plattform für intrazelluläre Proteinsensorik21. Die Modularität wird durch die Verwendung von Intrabodies gewährleistet, die die Spezifität zum Ziel definieren, während die Zellreprogrammierung TEVp-vermittelt ist. Konkret ist ein Intrabody membrangebunden und mit dem C-Terminus mit einem fluoreszierenden Protein mKate, einem TCS und einem TF (Fusionsprotein 1) fusioniert; der zweite Intrakörper ist mit dem TEVp fusioniert und befindet sich im Zytosol (Fusionsprotein 2) (Abbildung 1).

Die Interaktion zwischen zwei Intrakörpern und dem Zielprotein findet also im Zytoplasma statt und führt zu einer TCS-Spaltung durch TEVp, was zu einer TF-Translokation in den Zellkern führt, um die funktionelle Ausgabe zu aktivieren. Das Sensor-Aktuator-Gerät wurde erfolgreich auf vier intrazelluläre krankheitsspezifische Proteine getestet: NS3-Serinprotease, die vom HCV-Virus exprimiertwird 22, Tat- und Nef-Proteine aus der HIV-Infektion23,24 und mutiertes Huntingtin (HTT) der Huntington-Krankheit25. Die Ausgangsexpression umfasst fluoreszierende Reporter, apoptotische Gene (hBax)26 und Immunmodulatoren (XCL-1)27. Wir zeigen, dass das System auch die pathologische Funktionalität seiner Ziele beeinträchtigen kann. Zum Beispiel stört das Nef-responsive Gerät die Ausbreitung einer Virusinfektion, indem es das Zielprotein sequestriert und die Heruntermodulation des HLA-I-Rezeptors auf infizierten T-Zellen rückgängig macht24. Die beschriebene Sensor-Aktuator-Plattform ist die erste dieser Art für die Detektion intrazellulärer Proteine und kann möglicherweise zur Detektion abnormaler Proteinexpression, posttranslationaler oder epigenetischer Modifikationen für diagnostische und therapeutische Zwecke eingesetzt werden20.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Konstruktionsprinzipien für den Aufbau und Test des Sensor-Aktor-Geräts

  1. Wähle ein Protein aus, das dich interessiert.
    HINWEIS: Wir haben ein System für Proteine entwickelt, die sich im Zytoplasma befinden oder zwischen dem Zytoplasma und anderen Kompartimenten pendeln.
  2. Wählen Sie zwei Intrakörper aus, die unterschiedliche Epitope des Zielproteins binden. In unserer Studie haben wir Proteine ausgewählt, für die die Intrakörper bereits entwickelt und getestet wurden 28,29,30,31. Wenn Intrabodies nicht verfügbar sind, sollten sie neu entwickelt werden.
    HINWEIS: Eine Alternative zu Intrabodies können andere Moleküle sein, die mit dem interessierenden Protein interagieren. Zum Beispiel umfassen die Nef-Sensorgeräte einen Intrakörper (sdAb19) und die SH3-Domäne einer p59fyn-Protein-Tyrosinkinase32.
  3. Entwerfen Sie die Plasmide in silico mit DNA-Sequenzen, die für die Fusionsproteine kodieren.
    HINWEIS: Software für das Plasmiddesign ist kostenlos erhältlich oder kann erworben werden.
    1. Generieren Sie Sequenzen, die die folgenden Module enthalten: Membran-Tag, Fluoreszenzmarker (z. B. mKate), Intrabody, TCS und TF für Fusionsprotein 1 und Intrabody und TEVp für Fusionsprotein 2.
      HINWEIS: Der Aufbau einer neuen Architektur, die auf dem Zusammenspiel mehrerer Komponenten basiert, erfordert die Beachtung von Parametern, die die Signalaktivierung maximieren können, wenn das Zielprotein erkannt wird. Insbesondere konzentrierten wir uns auf die TEVp-Aktivität und Flexibilität der chimären Proteine, um die Protein-Protein-Interaktion zu erleichtern (Tabelle 1). Alle diese Funktionen sind in den folgenden Punkten aufgeführt.
    2. Fügen Sie eine flexible Glycin-Serin-Linkerdomäne (LD) zwischen dem Intrabody-TCS und/oder dem TEVp-Intrabody ein. Die LD kann eine variable Länge haben (0, 10 oder 15 Aminosäuren-AA).
    3. Fusionsprotein 1: Designvarianten, die das hochaffine TCS (S) oder das niedrigaffine TCS (L) enthalten, um die TEVp-Spaltaktivität zu regulieren. Die Ausprägung dieses Konstrukts wird von einem konstitutiven Promotor angetrieben. Fügen Sie den GAL4VP16 Transkriptionsfaktor am C-Terminus des TCS hinzu, um die Translokation in den Zellkern nach der TEVp-Spaltung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Wir haben den hEF1a-Promotor verwendet, es können aber auch andere konstitutive Promotoren gewählt werden.
    4. Fusionsprotein 2: Verwenden Sie einen konstitutiven (hEF1a) oder Doxyclycin-induzierbaren (pTET) Promotor, um die TEVp-Transkription abzustimmen. Verwenden Sie eine Abbaudomäne (DD), die durch den kleinen Molekülschild reguliert wird, um die Proteinstabilität zu modulieren.
      HINWEIS: Möglicherweise können auch andere induzierbare Systeme gewählt werden, die die Proteinexpression abstimmen.
    5. Ausgabe: Platzieren Sie ein Reportergen stromabwärts eines UAS-Promotors, der auf GAL4VP16 Transkriptionsfaktor reagiert. Wählen Sie die Ausgabe entsprechend der Anwendung des Geräts (z. B. fluoreszierendes Protein, Zytokin usw.).
  4. Führen Sie das Klonen mit einer beliebigen Strategie durch. Hier haben wir Plasmide mit Golden-Gate- oder Gateway-Technologien gebaut.
  5. Testen Sie die verschiedenen Konfigurationen des Geräts in den gewünschten Zelllinien durch transiente Transfektion. Co-transfizieren die Zellen mit den erhaltenen Plasmiden für die Fusionsproteine 1 und 2 und das fluoreszierende Reportergen, wie z.B. UAS-EYFP. Fusionsprotein 1 enthält ein rot fluoreszierendes Protein (mkate), das als Transfektionsmarker verwendet wird.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit einfach zu transfizierenden Zelllinien, wie z. B. HEK293FT Zellen, um die Geräte zu testen.
    1. Transfektion in HEK293FT Zellen. 2 x 105 Zellen in eine 24-Well-Platte mit 500 μl DMEM aussäen. Transfizieren Sie Zellen mit 300 ng Gesamt-DNA unter Verwendung des Transfektionsreagenzes, wirbeln Sie die Mischung vor und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT.
      1. Legen Sie die Zellen in einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator. 24 Stunden nach der Transfektion frisches Kulturmedium zugeben.
    2. Transfektion in Jurkat-Zellen. Verwenden Sie 3 x 105 Zellen in 500 μl RPMI-Zellkulturmedium für eine 24-Well-Platte. Führen Sie die Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Verwenden Sie 2-4 μg Gesamt-DNA für jede Probe. 500 μl frisches Zellkulturmedium 24 h nach der Transfektion zugeben.
      1. Während der Elektroporation Zellen und DNA-Mischung auf Eis legen. Legen Sie die Zellen dann in den 37 °C/5 % CO2 -Inkubator.
        HINWEIS: Je nach Anwendung des Geräts können unterschiedliche Zelllinien und Transfektionsmethoden ausgewählt werden.
  6. Erfassen Sie Mikroskopbilder, um ein qualitatives Verständnis der Funktionalität des Geräts zu erhalten. Bestätigung der Membranlokalisierung des Fusionsproteins 1 durch Detektion des Fluoreszenzsignals (mkate) in der Nähe der Zellmembran. Visualisieren Sie den Fluoreszenzausgang (EYFP) in Gegenwart oder Abwesenheit (Negativkontrolle-NC) des Zielproteins.
    1. Verwenden Sie das mit Tx Red- und GFP-Lichtwürfeln ausgestattete Zellbildgebungssystem, um mKate- und EYFP-Fluoreszenzproteine zu detektieren. Verwenden Sie das 10-fach- oder 20-fach-Objektiv.
      HINWEIS: Verwenden Sie nicht transfizierte Zellen, um sicherzustellen, dass keine Autofluoreszenz stattfindet.
  7. Analysieren Sie die Transfektion mit der Durchflusszytometrie (FACS).
    HINWEIS: Siehe Protokoll 2 für die Probenvorbereitung.
    1. Bewerten Sie die Geräte in Gegenwart des Zielproteins. Erstellen Sie eine experimentelle Matrix, die Varianten des Fusionsproteins 1 und 2 kombiniert und TEVp mit (i) konstitutivem hEf1a-Promotor, (ii) Doxycyclin-induzierbarem TET-Promotor und (iii) Schild für Proteinstabilität moduliert. Doxycyclin zugeben und in Konzentrationen (0-1000 nM) abschirmen.
    2. Führen Sie eine FACS-Analyse durch, um die Falteninduktion von EYFP zwischen Proben mit oder ohne interessierendes Protein zu vergleichen.
      HINWEIS: Die Induktion mit der höchsten Faltung entspricht der größten Eingangsempfindlichkeit im ON-Modus (Vorhandensein des Zielproteins) im Vergleich zum OFF-Modus (Abwesenheit des Zielproteins).
  8. Testen Sie die Funktionalität des Gerätes in Bezug auf die gewünschten Anwendungen.
    1. Führen Sie eine FACS-Analyse durch, um den Gehalt an Ausgangsproteinen oder Apoptose oder andere relevante Assays zu messen.
    2. Führen Sie eine RT-PCR-Analyse durch, wenn der Ausgangsteil des Geräts die Expressionsniveaus von Zielgenen reguliert. Berechnen Sie 2-ddCT in Bezug auf das Housekeeping-Gen (GAPDH oder Äquivalent) und vergleichen Sie die Faltungsänderung der Ausgangsexpression im EIN- und AUS-Modus.

2. Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrie-Analyse

  1. Führen Sie 48 Stunden nach der Transfektion eine quantitative Analyse von Proteingeräten mit einem Durchflusszytometer (FACS) durch.
    1. Aspirieren Sie das DMEM-Medium und waschen Sie HEK293FT Zellen mit 300 μl PBS. 100 μl Trypsin zugeben und 2-4 Minuten im 37 °C/5 % CO2 -Inkubator belassen lassen.
      HINWEIS: Jurkat-Zellen benötigen kein Trypsin.
    2. Fügen Sie 400 μl DMEM-Medium ohne Phenolrot hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, um die Bildung von Klumpen zu vermeiden. Transfer in FACS-Röhrchen.
    3. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, das mit 405-, 488- und 561-nm-Lasern ausgestattet ist.
    4. Erfassen Sie 30.000 bis 100.000 Ereignisse, die aus der lebenden Zellpopulation ausgewählt wurden, mit den folgenden Zytometereinstellungen: 488-nm-Laser und 530/30-nm-Bandpassfilter für EYFP/EGFP, 561-nm-Laser und 610/20-nm-Filter für mKate und 405-nm-Laser, 450/50-Filter für EBFP.
      HINWEIS: Um das Durchflusszytometer einzurichten, schließen Sie nicht transfizierte Zellen und Zellen ein, die mit einzelnen fluoreszierenden Proteinen transfiziert wurden.
    5. Führen Sie die Analyse der gesammelten Proben mit der bevorzugten Software (z. B. DIVA-Software, Flowjo oder TASBE33-Methode) durch.

3. Charakterisierung des HCV-Sensor-Aktuators

  1. Wählen Sie Intrakörper aus, um das NS3-Protein nachzuweisen. scFv35 und scFv162 binden an zwei verschiedene Epitope und wurden daher ausgewählt.
  2. Design- und Testvarianten des NS3-responsiven Bauelements gemäß der in Schritt 1.3 beschriebenen Begründung (z. B. Fusionsprotein 1: Membran-Tag, mKate, Einzelkettenfragment-Intrakörper scFv35, LD0, TCS-L und TF GAL4VP16; Fusionsprotein 2: einzelkettiges Fragment intrabody scFv162, LD0 und TEVp; Ausgang: UAS-EYFP oder UAS-hBax (Apoptose); NS3 (siehe Tabelle 2)).
  3. Testen Sie die Konstrukte in HEK293FT Zellen.
    HINWEIS: Stellen Sie für jedes Experiment eine Negativkontrolle ein, d. h. die Abgabe des Geräts und die Ausgabe der Quantifizierung in Abwesenheit des interessierenden Proteins.
    1. Testen Sie die Geräte auf TEVp unter einem konstitutiven Promotor in Gegenwart oder Abwesenheit von NS3. Die Transfektion des Fusionsproteins 1 (Schritt 1.3.3), des Fusionsproteins 2 (Schritt 1.3.4) und des EYFP-Ausgangsschritts (1.3.5) in HEK293FT Zellen wird wie in Schritt 1.5.1 beschrieben durchgeführt. Analysieren Sie die Proben 48 Stunden nach der Transfektion, indem Sie den Fluoreszenzreporter (EYFP) mittels Durchflusszytometrie messen (Protokoll 2).
    2. Beurteilung der Interaktion intrabody-NS3 durch mKate und BFP-Kolokalisation unter Verwendung des BFP-NS3-Fusionsproteins. Transfizieren Sie Zellen mit dem Fusionsprotein 1, das mKate enthält, und mit einem BFP-NS3. 48 h nach der Transfektion, Beobachtung der Zellen am konfokalen Mikroskop (63x Objektiv), um die Co-Lokalisierung von fluoreszierenden Proteinen zu testen.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen BFP (nicht mit NS3 abgesichert) als Negativkontrolle. In diesem Zustand sollte BFP eine diffuse zelluläre Lokalisation aufweisen und nicht mit dem membrangebundenen mKate kolokalisieren.
    3. Testen Sie die Geräte unter dem pTET-Promotor in Gegenwart oder Abwesenheit von NS3 auf TEVp. Vergleichen Sie EYFP in Abwesenheit und Vorhandensein von NS3. Co-transfizierte Zellen mit Fusionsprotein 1 (Schritt 1.3.3), Fusionsprotein 2 (Schritt 1.3.4) und EYFP-Ausgabe (Schritt 1.3.5) unter Verwendung des in Schritt 1.5.1 beschriebenen Protokolls. Transfektionen werden in Gegenwart oder Abwesenheit von NS3 durchgeführt. Analysieren Sie die Proben 48 Stunden nach der Transfektion, indem Sie den Fluoreszenzreporter (EYFP) mittels Durchflusszytometrie messen (Protokoll 2).
  4. Tötung der Testzelle, die von einem NS3-Gerät gesteuert wird.
    1. Ersetzen Sie die EYFP-Ausgabe durch das apoptotische Gen hBax.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3. Sammeln Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion und waschen Sie sie mit PBS, bevor Sie den Assay starten.
    3. Führen Sie einen Apoptose-Assay mit Annexin V durch, das an Pacific Blue konjugiert ist. Färbezellen mit apoptotischem Marker Annexin V (konjugiert mit 2,5 μl Pacific Blue), verdünnt in Bindungspuffer (Volumenverhältnis 1:20) für 10 min bei Raumtemperatur.
    4. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Berechnen Sie das Apoptoseniveau innerhalb der Population als Anzahl der Pacific-Blue (Annexin V) positiven Zellen.

4. Charakterisierung des Nef-responsiven HIV-Sensor-Aktuators

  1. Wählen Sie Intrakörper aus, die an Nef binden. Es wurden Einzeldomänen-Intrakörper sdAb19 und SH3 ausgewählt, da sie an unterschiedliche Epitope binden.
    HINWEIS: SH3 ist kein Intrakörper, sondern eine Domäne der p59-Fyn-Protein-Tyrosinkinase, die physiologisch mit Nef interagiert.
  2. Design- und Testvarianten von Nef-responsiven Bauelementen gemäß der in Schritt 1.3 beschriebenen Begründung (z. B. Fusionsprotein 1: Membran-Tag, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L und GAL4-VP16; Fusionsprotein 2: SH3, LD0 und TEVp; Ausgang: UAS-EYFP; Nef (siehe Tabelle 3)).
  3. Testen Sie die Geräte in HEK293FT- und Jurkat-T-Zellen.
    HINWEIS: Für jedes Experiment legen wir eine Negativkontrolle fest, d. h. die Abgabe des Geräts und die Ausgabequantifizierung in Abwesenheit des interessierenden Proteins
    1. Transfektion von HEK293FT: Befolgen Sie das in Schritt 1.5.1 beschriebene Verfahren bei Vorhandensein oder Fehlen von Nef.
    2. Transfektion von Jurkat-T-Zellen: Befolgen Sie das in Schritt 1.5.2 beschriebene Verfahren in Gegenwart oder Abwesenheit von Nef.
    3. 48 Stunden nach der Transfektion, analysieren Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer, wie in Protokoll 2 beschrieben.
  4. Infizieren Sie Jurkat-Zellen mit HIV-LAI-Stämmen zum HIV-Nachweis.
    1. Bereiten Sie die Virusbestände mindestens 48 Stunden vor dem Experiment vor. Verwenden Sie Viren, die aus der Transfektion von HEK-293T-Zellen mit den infektiösen molekularen Klonen (NIH AIDS-Reagenzienprogramm) gewonnen wurden, und kommerzielle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Konzentrieren Sie das Virus nach 40 h durch Ultrazentrifugation für 1 h, 64.074 x g, 4 °C auf 20 % Saccharose, um virale partikelfreie Proteine zu vermeiden. Titer viraler Bestände mit HIV-1 p24 ELISA.
    2. Infizieren Sie Zellen mit HIV-1-Stämmen mit 500 ng p24-Inokulum. 40 h nach der Infektion wird der Prozentsatz der infizierten Zellen quantifiziert, indem das virale Protein p24 mit KC57-FITC-konjugierten Antikörpern nachgewiesen und eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird.
    3. Färben Sie die Zellen mit AlexaFluor 647 konjugierten Antikörpern, Klon W6/32 gegen HLA-A, B, C. Fixieren Sie die Zellen und analysieren Sie sie auf einem Durchflusszytometer. Nef-vermittelte die Heruntermodulation von HLA-I in Jurkat-T-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit des Proteinsensors.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Eine Architektur für den modularen intrazellulären Proteinnachweis
Wie in Abbildung 1 gezeigt, besteht das Gerät aus: 1) Intrabody 1, der mit dem membrangebundenen Fluoreszenzmarker (mKate) und der TEVp-Spaltstelle (TCS) verbunden ist, gefolgt von einem Transkriptionsaktivator GAL4VP16 (TF); 2) Intrabody 2 fusioniert mit TEV-Protease (TEVp), frei im Zytosol; 3) ein synthetischer Promotor, der auf GAL4VP16 reagiert und die Expression eines Reportergens antreibt. Die Modula...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Bis vor kurzem wurde die Befragung von Zellen auf der Grundlage einer intrazellulären Umgebung mit Systemen durchgeführt, die de novo für spezifische Ziele entwickelt wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Beispiel für den neuesten zelltechnischen Ansatz zur Proteinsensorik und -aktuierung in einem Gerät, der schnell an neue gewünschte Biomarker angepasst werden kann.

Dieses bahnbrechende System erkennt intrazelluläre Proteine und liefert einen spezi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Istituto Italiano di Tecnologia unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AlexaFluor 647 Maus Anti-Human-HLA-A, B, C Antikörper-Klon W6/32Biolegend311414Antikörper
Annexin VLifeTechnologiesA35122Apoptose-Marker
AttracteneQiagen301005Transfektionsreagenz
BD Falcon RundbodenröhrchenBD Biosciences352053FACS-Röhrchen
DoxycyclinClonetech-Zellkultur: Medikamente
Dulbeccos modifiziertes Eagle-MediumCellgro10-013-CMZellkultur: Medium
Evos Cell Imaging SystemLife TechnologyEVOS M5000Bildgebungssysteme; Infektiöse molekulare Klone
FACSDiva8-SoftwareBD Biosciences659523FACS-Software
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR-Reaktion
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Zellkultur: Medium
Gateway SystemLifeTechnologies-PlasmidConstruction
Golden Gate Systeminhouse-PlasmidConstruction
HEK 293FTInvitrogenR70007Zellkultur: Zellen
Infusion Klonierung SystemClonetech638920Plasmid Construction
JetPRIME ReagenzPolyplus Transfektion114-15Transcfection Reagenz
Jurkat CellsATCCTIB-152Zellkultur: Zellen
L-GlutaminSigma-AldrichG7513-100MLZellkultur: Mittleres
Lipofectamin LTX mit Plus-ReagenzThermo Fisher Scientific15338030Transfektionsreagenz
LSR Fortessa Durchflusszytometer (405, 488 und 561  nm-Laser)BD Biosciences649225Durchflusszytometer
MicroAmp Schnelle optische 96-Well-Reaktionsplatte (0,1 μl; mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR-Reaktion
Neon Transfection SystemLife TechnologiesMPK10025Transfektionsreagenz
Nicht-essentielle AminosäurenHyCloneSH3023801Zellkultur: Medium
Opti-MEM I reduziertes SerummediumLife Technologies31985070Transfektionsmedium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4458-100MLZellkultur: Medium
QuantiTect Reverse TranskriptionskitQiagen205313Rev Transkriptase-Kit
RNeasy Mini KitQiagen74106RNA-Extraktionskit
RPMI-1640ATCCATCC 30­ 2001Zellkultur: Medium
ShieldClonetech632189Zellkultur: Medikamente
SpheroTech RCP-30-5-A KügelchenSpherotechRCP-30- 5A-2Kompensationseinrichtung
StepOnePlus 7500 Schnelle MaschineAngewandte Biosysteme4351106qPCR-Reaktion

Referenzen

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

TEV Proteasegenetische Plattformantik rperbasierte SensorikPeptiderkennungtranskriptionelle AktivierungHuntington KrankheitHepatitis C VirusHIV Nachweis

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.