Method Article

Ein Mausmodell von unvollständig resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvante Therapien

DOI:

10.3791/60882

⸱

July 28th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3College of Science, Health, Engineering and Education, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Mausmodell der unvollständigen chirurgischen Resektion von Weichteilsarkom zum Testen (neo)adjuvante Therapien.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgie ist oft die erste Behandlung für viele solide Tumoren. Lokale Rückfälle treten jedoch häufig nach primärer Tumorresektion auf, trotz adjuvanten oder neoadjuvanten Therapien. Dies tritt auf, wenn chirurgische Ränder nicht ausreichend tumorfrei sind, was zu Restkrebszellen führt. Aus biologischer und immunologischer Sicht ist die Operation kein Nullereignis; die Wundheilungsumgebung ist dafür bekannt, sowohl pro- als auch antitumorigenice Wege zu induzieren. Infolgedessen sollten präklinische Modelle für die Arzneimittelentwicklung, die darauf abzielen, einen lokalen Rückfall zu verhindern, eine chirurgische Resektion bei der Prüfung neuer (neo-)adjuvanten Therapien beinhalten, um die klinischen Einstellungen bei Patienten zu modellieren, die mit einer Operation behandelt wurden.

Hier beschreiben wir ein Mausmodell der unvollständigen chirurgischen Resektion von WEHI 164 Weichteilsarkom, das das Testen von (neo)adjuvanten Therapien bei der Einstellung einer Wundheilungsreaktion ermöglicht. In diesem Modell werden 50% oder 75% des Tumors entfernt, so dass einige Krebsgewebe in situ zurückbleiben, um grobe Resterkrankungen nach der Operation im klinischen Umfeld zu modellieren. Dieses Modell ermöglicht das Testen von Therapien im Rahmen der Operation unter Berücksichtigung der Wundheilungsreaktion, die die Wirksamkeit von (neo)adjuvanten Behandlungen beeinflussen kann. Die unvollständige chirurgische Resektion führt zu einem reproduzierbaren Nachwachsen des Tumors bei allen Mäusen in Ermangelung einer adjuvanten Therapie. Adjuvante Behandlung mit Checkpoint-Blockade führt zu reduziertem Tumorwachstum. Dieses Modell eignet sich somit für die Erprobung von Therapien im Rahmen der Entschärbungschirurgie und der damit verbundenen Wundheilungsreaktion und kann auf andere Arten von festem Krebs ausgedehnt werden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgie bleibt die Hauptbehandlungsoption für viele solide Tumoren1, einschließlich Weichteilsarkom2,3. Trotz Verbesserungen in der Krebschirurgie Und Kombinationen mit (neo)adjuvanten Therapien besteht nach wie vor ein hohes Risiko für Krebsrückfälle und Metastasen nach primärer Tumorresektion4,5. Bei Weichteilsarkomen treten Rückfälle besonders lokaregional am Operationsort auf, was zu erhöhter Morbidität und Mortalität führt. Im klinischen Umfeld kann es schwierig sein, genügend ausreichende Margen zu erhalten (z. B. aufgrund anatomischer Zwänge), was zu einer unvollständigen Resektion und einem anschließenden Tumorrezidiv6führt. Chirurgischer Stress und der anschließende Prozess der Wundheilung sind dafür bekannt, eine immunsuppressive Tumormikroumgebung zu schaffen, die für Tumorrezidive7,8günstig ist. Daher sollte die Entdeckung und Entwicklung neuer Therapien für Weichteilsarkom, insbesondere Immuntherapien, idealerweise die chirurgische Wundheilungsreaktion berücksichtigen.

Die meisten präklinischen Studien für adjuvante Therapien werden zunächst mit subkutanen syngenischen oder Xenotransplant-Mausmodellen durchgeführt, ohne die chirurgischeN Belastungen und die Wundheilungsreaktion9,10zu integrieren. Daher haben wir ein syngenes subkutanes Maus-Weichteilsarkom-Modell mit unvollständiger chirurgischer Resektion entwickelt. WEHI 164 Fibrosarkomzellen werden subkutan geimpft, und sobald Tumore festgestellt sind, entfernen wir 50-75% der Tumormasse (Abbildung 1A-E). Tumore wachsen konsequent aus dem verbleibenden Tumor. Dieses Modell ermöglicht das Testen von adjuvanten Therapien unter Berücksichtigung der Wirkung von chirurgischem Stress und Wundheilung. Ähnliche chirurgische Modelle der unvollständigen Resektion wurden in einer Reihe von Studien von mehreren Gruppen verwendet und festgestellt, reproduzierbar und wirksam11,12,13. Hier finden Sie eine detaillierte Beschreibung dieses Protokolls.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die in diesen Experimenten verwendeten Tiere wurden aus dem Animal Resource Centre (Perth, Western Australia) gewonnen. Die Tiere wurden am Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia) unter standard pathogenfreien Bedingungen gehalten. Alle Experimente wurden nach dem Protokoll durchgeführt, das vom Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee genehmigt wurde. IN diesen Experimenten wurden BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen eingesetzt. Die WEHI 164 Fibrosarkom-Zelllinie wurde von CellBank Australia (Westmead, NSW) gewonnen.

1. Impfung von Zellen

  1. Vorbereitung von Zellen und Tieren
    1. Stellen Sie sicher, dass die Zellenlinie im empfohlenen Medium beibehalten wird. Zum Beispiel halten WEHI 164 Zelllinie in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 10% fetales Rinderserum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin.
      HINWEIS: Durchgangszellen mindestens 3 und bis zu 5 Mal nach der Entfernung aus der kryogenen Lagerung. Um eine optimale Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten, sollten Zellen geteilt werden, wenn sie zwischen 70-80% konfluent sind. Tumorzelllinien sollten auf Mykoplasmen getestet werden, da eine Infektion das Zellwachstum verändern und die Immunantwort in vivo beeinflussen kann.
    2. Einen Tag vor der Impfung rasieren Sie Mäuse an der unteren rechten Flanke mit Clippern.
      HINWEIS: Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen mit normalem Gewicht (16 -22 Gramm) wurden in diesem Experiment verwendet.
    3. Am Tag der Impfung, ernten WEHI 164 Zellen, wenn 70-80% konfluent durch Trypsinisierung.
      1. Saugen Sie das Kulturmedium aus den Gewebekulturkolben und fügen Sie dann sterile Phosphat gepufferte Lösung (1x PBS), um restliche Spuren von fetalem Rinderserum (FBS) zu entfernen.
      2. Aspirieren Sie die PBS aus den Gewebekulturkolben. Fügen Sie 3 ml 0,05% Trypsin (für einen T75-Kolben) hinzu und wirbeln Sie dann den Kolben so, dass die gesamte Oberfläche des Kolbens mit Zellen mit Trypsin bedeckt ist.
      3. Inkubieren Sie den Kolben bei 372 °C, 5% CO2-Inkubator für 3 min. Überprüfen Sie zellenperiodisch, indem Sie auf die Seiten des Kolbens tippen, um zu sehen, ob sich die Zellen entfernt haben.
      4. Entfernen Sie Kolben aus dem Zellkultur-Inkubator und fügen Sie 5 ml Medien hinzu, die mit FBS ergänzt werden, um das Trypsin zu neutralisieren.
        HINWEIS: Lassen Sie Zellen nicht länger als nötig in Trypsin, da dies Zellen schädigen und zu einer geringen Zelllebensfähigkeit führen kann.
      5. Pipettenaufhängung mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zellsuspension in ein konisches Zentrifugenrohr übertragen.
      6. Pelletzellen durch Spinnen bei 350 x g für 3 min.
    4. Waschen Sie die Zellen dreimal in 1x PBS.
      1. Resuspend Zellen in 50 ml sterilen 1x PBS und Waschen von Zellen durch Pipettieren Zellsuspension nach oben und unten. Pelletzellen durch Spinnen bei 350 x g für 3 min.
      2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in 15 ml sterilen 1x PBS. Waschen Sie Zellen durch Pipettierzellaufhängung nach oben und unten. Pelletzellen durch Spinnen bei 350 x g für 3 min.
      3. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in genau 10 ml sterilen 1x PBS wieder aus. Zellen wie in Schritt 1.1.4.2 waschen und eine kleine Menge (ca. 100 l) Zellsuspension zum Zählen in ein Zentrifugenrohr übertragen. Pelletzellen durch Spinnen bei 350 x g für 3 min.
    5. Bestimmen Sie die Zellennummer mithilfe der Trypan Blue-Ausschlussmethode mithilfe eines Hämozytometers oder eines automatisierten Zellenzählers. Zellen in sterilen 1x PBS in einer Konzentration von 5 x 106 Zellen/ml resuspendieren. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
      HINWEIS: Die Lebensfähigkeit von Tumorzellen sollte gleich oder über 80 % liegen, um ein reproduzierbares Tumorwachstum zu gewährleisten.
  2. Subkutane Impfung
    1. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich und füllen Sie eine Spritze mit einer 26 G Nadel mit 100 l Zellsuspension (5 x 105 Zellen) in sterilen 1x PBS. Wiederholen Sie das Mischen von Zellen, bevor Sie die nächste Spritze laden.
      HINWEIS: Halten Sie Zellen während des gesamten Verfahrens auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
    2. Halten Sie die Maus entsprechend zurück, um den Zugriff auf die untere rechte Flanke zu gewährleisten. Impfen Sie die Maus subkutan auf der rasierten unteren rechten Flanke.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Impfung nicht im Peritoneum befindet, indem Sie die Nadel leicht anheben, die unter der Haut sichtbar sein sollte. Nach der Impfung sollte sich unter der Haut ein blasenartiger Klumpen bilden.
    3. Überwachen Sie Mäuse gemäß der geltenden Ethikzulassung und führen Sie eine chirurgische Resektion durch, wenn die Tumore auf eine Größe von etwa 50 mm2angewachsen sind.

2. Teilweise chirurgische Resektion des Tumors

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert ZWEI Forscher; eine für chirurgische Eingriffe (SURGEON) und eine andere für die Mausüberwachung (ASSISTANT).

  1. Operation Setup
    1. Am Tag 12 nach der Inokulation, wenn Tumore eine Größe von ca. 50 mm2erreicht haben, Dosiermäuse mit 100 l (0,1 mg/kg) Buprenorphin s.c. in der Halsschnupzer, 30 Minuten vor der Operation.
    2. Richten Sie den Operationsbereich mit einem mit Banklack überzogenen Wärmepolster ein und richten Sie einen Nasenkegel für die Anästhesie ein. Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge vor der Verwendung, und zwischen jedem Tier mit einem Wärmeperlensterilisator, so dass Werkzeuge vor dem Gebrauch abkühlen. Lassen Sie die folgenden chirurgischen Geräte sauber und in Reichweite: Chlorhexidin, Tupfer, Gaze, Augengel, zwei gekrümmte Zangen, Schere, Clip-Applikator, Clip-Entferner, Clip-Nachfüllungen (Abbildung 2A, 2B).
    3. Erwärmen Sie die Heizkammer auf 37 °C und richten Sie ein weiteres Wärmepolster für die Rückgewinnung ein (Abbildung 2C). Legen Sie sterilisierte Werkzeuge auf eine sterile Oberfläche wie autoklavierte Pads.
  2. Anästhesie
    1. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und befeuchten Sie die Maus mit 4% Isofluran (4% in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 L/min), bis sich die Atemfrequenz auf etwa 60 Atemzüge pro Minute (1 pro Sekunde) verlangsamt (dies dauert in der Regel <1 min).
      HINWEIS: Lassen Sie die Maus nicht zu lange in der Kammer, da dies zu Erstickung und Tod führen kann. Nur eine Maus unter Anästhesie zu einer Zeit.
    2. Übertragen Sie die Maus auf das Wärmepolster auf dem Operationstisch, legen Sie die Maus mit der Nase in den Nasenkegel und halten Sie den Anästhesiezustand mit 3-4% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 0,5 l/min. Überwachen Sie die Atemfrequenz, um sicherzustellen, dass die Tiefe der Anästhesie erhalten bleibt.
      HINWEIS: Der ASSISTANT muss die Atmung der Maus während der gesamten Operation überwachen, um sicherzustellen, dass das richtige Maß an Anästhesie beibehalten wird. Senken Sie die Anästhesiekonzentration, wenn die Atmung zu langsam wird, oder erhöhen Sie die Konzentration, wenn die Tiefe der Anästhesie zu flach ist. Wenn die Maus anfängt zu schnappen, entfernen Sie die Maus aus dem Nasenkegel, verringern Sie die Anästhesiekonzentration und warten Sie, bis sich die Atmung normalisiert, bevor Sie sie wieder auf den Nasenkegel legen.
    3. Führen Sie einen "Pinch-Test" und einen "Cornealreflextest"14 durch, um sicherzustellen, dass die Maus vor Beginn der Operation vollständig beästhetisiert wird.
      HINWEIS: Die Bewegung eines beliebigen Teils der Maus ist ein Hinweis darauf, dass die Maus nicht vollständig beästhetisiert ist. Das Tier sollte sofort durch Erhöhung der Anästhesiekonzentration zusätzlich anästhesien.
    4. Bedecken Sie die Augen der Maus mit einer kleinen Menge ophthalmologischem Gel, um Augentrockenheit zu vermeiden.
  3. Chirurgischer Eingriff (SURGEON)
    1. Den Operationsbereich 3 mal mit alkoholischem Chlorhexidin abwischen. Mit Zangen und einer Schere, machen Sie einen 1 cm geraden Schnitt entlang der rückenden Seite, 3 mm vom Tumor entfernt(Abbildung 3A, 3B).
      HINWEIS: Die Standardisierung des Schnitts auf 1 cm in jeder Maus (mit einem Lineal) ermöglicht eine gleichmäßige Beurteilung der Wundheilung zwischen Mäusen. Das Auffinden des Inzisions 3 mm vom Tumor entfernt ermöglicht eine nachfolgende intratumorale adjuvante Therapie ohne Leck aus der Wunde.
    2. Mit einer Pinzette die Fazien und das subkutane Fettgewebe zwischen Tumor und Peritoneum wegziehen. Der subkutane Tumor ist normalerweise an der Hautseite befestigt.
    3. Öffnen Sie die Wunde, indem Sie die Haut vorsichtig auf der Tumortragenden Seite mit einer Pinzette halten, und "invertieren" Sie den Tumor, so dass er außen sichtbar ist (Abbildung 3C, 3D).
      HINWEIS: Der zu entmassenhafte Tumorabschnitt sollte der Öffnung am nächsten sein, um genügend Haut zu haben, um die Wunde zu schließen. Achten Sie darauf, die Haut nicht zu schneiden, wenn Sie den Tumor entfernen.
    4. Schneiden Sie die Tumorkapsel mit einer Schere von der Hälfte ab, um sie zu entfernen, beginnend mit der Basis des Tumors, die der Öffnung am nächsten liegt.
    5. Für 50% Debulk-Chirurgie, schneiden Sie über die Mitte des Tumors. Mit gekrümmten Zangen, schaufeln Sie den Abschnitt des Tumors entfernt werden (50%); schöpfen Sie alle Reste aus dem entbulkten Bereich.
    6. Für 75% Debulk, führen Sie eine 50% Tumor-Debulk wie in Teil 2.3.5 oben. Dann schneiden Sie in die Hälfte der verbleibenden 50% des Tumors und schöpfen 25% des Tumors, mit gekrümmten Zangen wie oben beschrieben.
  4. Schließen der chirurgischen Stelle
    1. Legen Sie den restlichen Tumor wieder unter die Haut, und ziehen Sie mit Zangen die Hautklappen zusammen und richten Sie die Haut entlang der Wunde aus.
    2. Halten Sie die Haut 5 mm vom Rand der Wunde zusammen, und verwenden Sie chirurgische Clips, um die Wunde zu schließen, beginnend auf der Seite, die der Zange am nächsten ist. Tragen Sie so viele Clips wie nötig auf, um sicherzustellen, dass kein darunter liegendes Gewebe exponiert wird. Im Allgemeinen werden drei bis vier Clips mit 2 mm Lücken zwischen Clips aufgebracht.
      HINWEIS: Wenn Clips nicht gut aufgetragen werden, entfernen Sie sie mit einem Clip-Entferner und ersetzen Sie sie durch neue Clips.
  5. Rückgewinnung von Mäusen (ASSISTANT)
    1. Lassen Sie die Mäuse sich erholen, indem Sie sie in die warme Heizkammer (37 °C) geben.
    2. Legen Sie den Käfig der Maus auf das Heatpad. Überwachen Sie die Mäuse in der Heizkammer, bis sie sich vom Anästhetikum erholt haben (wach und gehend) und legen Sie die Mäuse dann wieder in den Käfig. Lassen Sie den Käfig auf dem Heatpad für weitere 10 Minuten, bis die Mäuse aktiver geworden sind.
    3. Geben Sie den Mäusen feuchte und weiche Nahrung. Überwachen Sie die Mäuse 1 Stunde nach der Operation auf Genesung und stellen Sie sicher, dass die Clips an Ort und Stelle bleiben. Stellen Sie sicher, dass der Käfig halb auf/die Hälfte des Wärmepolsters ist, damit die Tiere die Temperatur selbst regulieren können, während sie unbeaufsichtigt sind.
    4. Dosis Mäuse mit 0,1 mg/kg Buprenorphin (100 l subkutan in der Scruff des Halses), 6-8 Stunden nach der Operation (am Ende des Tages). Überwachen Sie Mäuse früh am nächsten Morgen und dosieren Sie Mäuse wieder mit 0,1 mg/kg Buprenorphin (100 l subkutan in der Halsschübe). Geben Sie mehr nasses Essen nach Bedarf.
    5. Überwachen Sie Mäuse täglich für die nächsten sieben Tage. Clips können nach sieben Tagen mit dem Clip-Entferner entfernt werden.
  6. Adjuvante oder neoadjuvante Behandlung
    1. Behandeln Sie Mäuse peri-operativ mit (neo)adjuvanten Therapie zu einem bestimmten Zeitpunkt, je nach der Behandlung von Interesse.
    2. Behandeln Sie z. B. Mäuse mit einer Dosis von 100 g Anti-CTLA-4 intraperitoneal (i.p.) am 15. Tag nach der Impfung oder mit drei Dosen von 200 g Anti-PD-1 i.p. am Tag 15, 17 und 19 nach der Impfung.
  7. Experimentelle Kontrollen
    1. Wenn Sie dieses Modell verwenden, um die Auswirkungen von Entzündungen/Wundheilung zu bewerten, sollten Sie die folgenden Kontrollgruppen verwenden: 1) No-surgery control (Behandlungen können noch intratumoral verabreicht werden); 2) Scheinchirurgie Kontrolle: Ein chirurgischer Schnitt wird in der Haut gemacht; der Tumor wird manipuliert und exponiert, aber kein Tumorgewebe entfernt; die Wunde wird mit Clips geschlossen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumorwachstum bis zu einer Größe von 50 mm2 ist eine ideale Größe für partielle Ablagerungen. Die unvollständige chirurgische Resektion von 50 mm2 Tumoren führt zu 100% (n=5) reproduzierbarem Nachwachsen der Tumoren in Abwesenheit einer adjuvanten Immuntherapie (Abbildung 4A). Als nächstes verwendeten wir das Modell, um adjuvante Immuntherapien mit Antikörpern gegen Checkpoint-Moleküle Cytotoxic T Lymphozyten Associated ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir bieten ein Protokoll für ein Mausmodell der unvollständigen chirurgischen Resektion von Weichteilsarkom, um perioperative Therapien zu testen. Wir standardisierten auch den chirurgischen Schnitt, um die Beurteilung der Wundheilung zwischen Mäusen nach der Behandlung zu ermöglichen.

Die Tumorplatzierung ist ein wichtiger Bestandteil dieses Protokolls. Wir haben uns für ein subkutanes Tumormodell entschieden, um einen einfachen chirurgischen Zugang zur Tumorstelle und die Verabreichung lokal...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Angaben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von der Socke es an Sarcoma unterstützt! Foundation, die Australian and New Zealand Sarcoma Association, die Children es Leukemia & Cancer Research Foundation und Perpetual Philanthropy. W.J.L wird von einem Simon Lee Fellowship und einem Forschungsstipendium des National Health and Medical Research Council und des Cancer Council WA unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
26 gauge 0,5 mL InsulinspritzeBecton Dickinson, Australien326769Keine
2-MercaptoethanolLife Technologies Australia Pty Ltd21985023Keine
Anässetische GasmaschineDarvall Vet, AustralienArtikelnummer: 2848Keine
Anti-CTLA-4BioXcell, USABE0164Keine
Anti-PD-1BioXcell, USABP0273Keine
Buprenorphinhydrochlorid-Injektion, 0,3 mg/mlRB Gesundheitswesen UK Limited, UK55175Verschreibungspflichtige Bestellung
Chlorhexidin Chirurgisches Peeling 4%Perigo Australien, AustralienCHL01449F(PeelingKeine
Fötales RinderserumCellSera, AustralienAU-FBS-PGKeine
Pinzette Fein 10,5 cmChirurgisches Haus, WestaustralienCC74110Keine
Pinzette Fein 12 cm GezahntChirurgisches Haus, WestaustralienCC74212Keine
Zange Hals 14 cmChirurgisches Haus, WestaustralienCD01114Keine
HeizkammerDatesand Ltd, UKMini-ThermacageKeine
HEPES (1M)Life Technologies Australia Pty Ltd15630080Keine
IsofluranHenry Schein Animal Health, AustraliaArtikelnummer: 29405Rezeptbestellung
Gleitende AugensalbeAlconn/aKeine
Penicillin / Streptomycin 1000XLife Technologies Australia Pty Ltd15140122Keine
Phosphat gepufferte Lösung 10xLife Technologies Australia Pty Ltd70013-032Keine
Reflex 7mm ClipsAble wissenschaftlich, AustralienAS59038Keine
Reflex 7mm Wound Clip ApplikatorFähig wissenschaftlich, AustralienAS59036Keine
Reflex Wound Clip RemoverFähig wissenschaftlich, AustralienAS59037Keine
Nagetier Qube Anästhesie AtemkreislaufDarvall Vet, Australien#7885Keine
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-GlutaminLife Technologies Australia Pty Ltd21870092Keine
Schere Iris STR 11 cmOP-Haus, WestaustralienKF3211Keine
Schere Iris STR 9 cmOP-Haus, WestaustralienJH4209Keine
Kleine InduktionskammerDarvall Vet, AustralienArtikelnummer: 9630Keine
TrypLE express 1xLife Technologies Australia Pty Ltd12604-021Keine
Germinator 500 Glasperlen-SterilisatorCellpoint Scientific Inc., USA5-1460-DK

References

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