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Methodenartikel

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

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DOI:

10.3791/60909

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12. März 2020

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1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Zusammenfassung

Herzfibrose als Reaktion auf Verletzungen ist eine physiologische Reaktion auf die Wundheilung. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Fibroblasten-Subtypen zu untersuchen und zu zielen, die Fibrose mildern. Die Fibroblastenforschung wurde jedoch aufgrund des Fehlens universell akzeptabler Fibroblasten-Marker behindert, um ruhehafte sowie aktivierte Fibroblasten zu identifizieren. Fibroblasten sind eine heterogene Zellpopulation, was sie schwer zu isolieren und zu charakterisieren macht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Anreicherung von Fibroblasten und Myofibroblasten aus unverletzten und verletzten Mausherzen. Die Verwendung eines Standard- und zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Fibroblasten wird die Untersuchung ihrer Rolle bei der Homöostase sowie der Fibrosemodulation ermöglichen.

Einleitung

Herzfibroblasten, Zellen mesenchymaler Herkunft, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der elektrischen Leitung und mechanischen Kräfte im Herzen zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Herzarchitektur während der Homöostase1. Nach der Verletzung werden diese Zellen aktiviert, erweitern und produzieren extrazelluläre Matrixproteine (ECM)2. Viele präklinische Studien haben Fibroblasten als kritische zelluläre Regulatoren aufgedeckt, die die strukturelle Integrität eines verletzten Herzens3 sowie Haupteffektorzellen, die für die unkontrollierte Produktion und Ablagerung von ECM-Proteinen verantwortlich sind, aufrecht erhalten, was zu einer steifen Narbenbildung und Herzinsuffizienzführt 4. Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, was es schwierig macht, ihre reparative Funktion von pro-fibrotischen maladaptiven Eigenschaften zu sezieren. Kürzlich wurde die funktionelle Heterogenität von zwei unterschiedlichen Fibroblasten-Subtypen nach Einer Myokardverletzung definiert, was auf die Möglichkeit hindeutet, verschiedene Fibroblasten-Subtypen zu isolieren und ihre Rolle bei der Wundheilung zu untersuchen5.

Die Gewinnung einer reinen Fibroblastenpopulation ist entscheidend für die Abgrenzung ihrer funktionellen Rolle bei Derinstandunden- und Fibrose. Das Vorhandensein mehrerer Fibroblastenmarker, die andere Zelltypen erkennen, macht es jedoch schwierig, eine im Wesentlichen reine Fibroblastenpopulation zu isolieren6. Mehrere elegante Studien haben clevere Wege entwickelt, um Herzfibroblasten von unverletztem und verletztem Myokard zu isolieren. Die beliebteste und etablierteste Methode zur Anreicherung von Fibroblasten ist durch selektive Adhäsion nach enzymatischer Gewebeverdauung7.

Zusätzlich wurde die fluoreszenaktivierte Zellsortierung (FACS) von Fibroblasten auf Basis von Zelloberflächenantigenen erfolgreich beschrieben8. In der Studie wurden die mesenchymalen Zellen nach enzymatischer Verdauung als Lineage-negativ (Lin: Ter119-CD45-CD31)und gp38-positiv (gp38+) aus Mausherzen sortiert. Gp38+ve-Zellen wurden aufgrund ihrer Koexpression von col1-1 und anderen mesenchymalen Markern als Fibroblasten bestätigt. Obwohl die meisten Gewebeverdauungen nach dem Austeilen des Ventrikels in einer Petrischale abgeschlossen sind, hat eine aktuelle Studie die Verwendung einer direkten Nadelenzymperfusion des linken Ventrikels untersucht, um Myozyten und Nicht-Myozyten zu isolieren, die Fibroblasten enthalten9. Fibroblasten wurden dann in diesem Fall durch selektive Haftung isoliert.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Anreicherung von Fibroblasten mit drei Methoden. Die erste ist eine bereits etablierte Methode mit selektiver Adhäsion von Fibroblasten nach enzymatischer Verdauung. Die zweite Methode wird verwendet, um in erster Linie verletzungsinduzierte Alpha glatte Muskel exsemitenDe Myofibroblasten zu isolieren. Die dritte Methode beinhaltet die sequenzielle, magnetische Erschöpfung einer enzymverdauten Herzzellsuspension von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen. Nach erschöpfender Erschöpfung werden Fibroblasten/Myofibroblasten basierend auf dem Vorhandensein des Antigens MEFSK4 unter Verwendung magnetischer Perlen isoliert. Kürzlich wurde MEFSK4 als Antigen beschrieben, das sowohl bei ruhelösenden als auch bei aktivierten Fibroblasten vorliegt, was es zu einem geeigneten Marker für die Fibroblasten-Identifikation und -Isolierung macht. Natürlich haben alle hier beschriebenen Methoden einzigartige Einschränkungen. Es wird daher dringend empfohlen, die Reinheit der isolierten Zellpopulation durch Strömungsanalyse, Immunfärbung und semiquantitative Echtzeit-PCR zu überprüfen. Diese Methoden können jedoch erweitert werden, und zusätzliche Marker können hinzugefügt werden, um andere kontaminierende Populationen auszuschließen, bevor die Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen für wichtige Experimente verwendet werden.

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Protokoll

Diese Studie hält strikt an den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health fest. Der Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte das Protokoll (Protokollnummer: M1600076-01).

1. Herzsektion

  1. Lösungsvorbereitung
    1. KHB-Puffer
      1. Mit einem Rührstab langsam 9,4 g Krebs-Henseleit-Pufferpulver (KHB) in 900 ml DDI-Wasser auflösen.
        HINWEIS: Puffer wird ausfallen, wenn zu schnell oder zu lange gerührt. Der KHB-Puffer muss während der Fibroblastenisolation kalt sein.
      2. 2,9 mM CaCl2 und 24 mM NaHCO3hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2–7,3 ein und verdünnen Sie ihn auf ein Volumen von 1 L mit dH2O.
      3. Mit einem sterilen Filter (0,22 m) bis zu 4 °C lagern. Auf Eis oder bei 4 °C für die Dauer der Isolation.
    2. Kollagenase Verdauungscocktail
      1. Bereiten Sie Verdauungscocktail am Tag der Fibroblasten-Isolierung vor. Bestimmen Sie das geeignete Volumen des Verdauungscocktails entsprechend der Anzahl der Herzen; 5 ml Cocktail pro 1 Herz.
      2. Bereiten Sie kollagennasemischung (siehe Tabelle der Materialien) und DNase I gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
      3. Für 20 ml Gesamtvergärungscocktail 17,5 l DNase I, 180 l 1 M HEPES und 500 l Kollagenase zu einem leeren 50 ml konischen Rohr geben.
      4. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen von Hanks Balanced Salt Lösung (HBSS) mit Ca2+ und Mg2+ hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.
    3. Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer
      1. Bestimmen Sie das benötigte Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der Herzen (5 ml/Herz). Verdünnen Sie den 10x RBC Lyse-Lagerpuffer mit dH2O auf 1x.
    4. Fibroblastenmedien: 10% FBS in DMEM F-12
      1. Fügen Sie 10% FBS zu DMEM-F12 mit L-Glutamin und HEPES hinzu. Fügen Sie 10 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2,5 g/ml Antimykotika und 2,5 g/ml Mykoplasmen prophylaktisch hinzu (siehe Materialtabelle). Bei 4 °C lagern.
  2. Herzsektion
    1. Bereiten Sie eine 6 Brunnenplatte auf Eis mit 2 ml kaltem KHB pro Brunnen vor, um Herzen während der Zerlegung zu speichern. Verwenden Sie autoklavierte chirurgische Schere und Zange.
    2. Euthanisieren Sie Mäuse im Alter von 12 Wochen oder älter durch Isofluran-Überdosierung, und folgen Sie mit zervikalen Dislokation.
    3. Alternativ können Sie bei aktivierter Fibroblastenisolation einen Myokardinfarkt bei 12 Wochen alten Mäusen durch koronare Arterienligation10induzieren. Euthanisieren Sie die Mäuse 8-10 Tage nach der Verletzung.
    4. Sprühen Sie Körper mit 70% Ethanol und orientieren, so dass die ventrale Seite dem Experimentator gegenüber steht. Anhänge anheften oder zurückhalten, um Interferenzen zu vermeiden.
    5. Schneiden Sie die Bauchhaut und den Muskel auf, aber vermeiden Sie das Durchstechen der Leber. Schneiden Sie vertikal in Richtung des Brustbeins, und öffnen Sie vorsichtig den Thorax, während das Piercing des Herzens zu vermeiden. Fahren Sie fort, durch den Brustkorb zu schneiden, um das Herz freizulegen.
    6. Heben Sie das Herz mit Zangen sanft aus der Brust und schneiden Sie alle Lungen oder überschüssiges Gewebe ab, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist. Entfernen Sie den Ventrikel und legen Sie ihn in einen Brunnen von 6 Brunnenplatten mit kaltem KHB. Setzen Sie die Herzen auf diese Weise fort, bis alle Proben isoliert wurden.
  3. Enzymatische Dissoziation des Herzens
    1. Mit Zangen, immer wieder drücken und agitieren das Herz in KHB, um überschüssiges Blut zu entfernen. Übertragen Sie das Herz auf eine saubere sterile 10 cm2 Platte. Mit einer einschneidigen Klinge, schnell das Herz in kleine Stücke zerkleinern.
    2. Fügen Sie 1 ml Kollagennase-Verdauungscocktail hinzu und weiter hacken, bis die Stücke klein genug sind, um sie mit einer 1 ml Mikropipette zu übertragen. Stücke auf ein 50 ml konisches Rohr mit einer 1 ml Mikropipette übertragen. Waschplatte 2x mit 2 ml Kollagenase-Verdauungscocktail.
      HINWEIS: Das Abschneiden eines Teils der Pipettenspitze kann helfen, größere Herzstücke zu sammeln, die sonst in der Pipettenspitze stecken bleiben könnten.
    3. Konische Röhre bei 37 °C für 30 min mit Schaukeln oder Rührung inkubieren. Sicheres Rohr nach Bedarf. 10x mit einer 5 ml Pipette aufheben, bis der Inhalt homogen ist, und das konische Rohr bei 37 °C für 15 min mit Drehung oder Rührung inkubieren.
    4. 10x mit einer 10 ml Pipet bis homogen aussetzen. Setzen Sie ein 40 m'm-Zellensieb ein, indem Sie den Filter mit 1–2 ml KHB-Puffer auf einem neuen 50 ml konischen Rohr benetzen. Fügen Sie 25 ml KHB-Puffer zur Verdauungssuspension hinzu, suspendieren und filtern Sie durch ein grundiertes 40-m-Zellsieb. Ändern Sie den Filter nach Bedarf.
      HINWEIS: Wenn sich die Filtration verlangsamt, kann ein leicht esbendes Rohr oder die Verwendung einer 1 ml Mikropipette zum Ziehen einer Suspension von der Unterseite des Filters der Zellsuspension helfen, ein teilweise blockiertes 40-m-Zellsieb zu durchlaufen.
    5. Zentrifuge bei 400 x g und 4 °C für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1x RBC-Lysepuffer (5 ml/Herz) wieder auf. Inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
    6. Zentrifuge bei 400 x g und RT für 10 min. Überstand entfernen und dann waschen, indem Sie Pellet in 1 ml KHB-Puffer wieder aufhängen.
    7. Fügen Sie 9 ml KHB-Puffer hinzu und filtern Sie durch grundiertes 40-m-Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 400 x g und RT für 10 min.
    8. Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie sich in 1 ml Fibroblastenmedium oder PBS wieder aus, und bestimmen Sie die Zellnummer. Fibroblasten können mit den drei unten beschriebenen Methoden isoliert werden.

2. Isolierung von Fibroblasten von Dereinzelsuspension

  1. Fibroblastenisolierung: Differentialbeschichtung (Abbildung 1)
    1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie 2 ml Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzufügen und die Platte wirbeln, um den Brunnenboden zu bedecken.
    2. Resuspend Zellen in 1 ml Medien pro Herz. Platte 1 ml Zellsuspension pro Brunnen, so dass ein Herz (theoretisch) pro Brunnen plattiert wird. Zum Beispiel würden sechs Herzen in 6 ml Medien resuspendiert und dann in sechs Brunnen mit 1 ml Zellsuspension pro Brunnen plattiert.
    3. Wirbelplatte, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Fügen Sie ein zusätzliches 1–2 ml Medium pro Brunnen für ein Gesamtvolumen von bis zu 5 ml pro Bohrgut hinzu und brüten Bei 37 °C für 4 h.
    4. Fibroblasten werden durch selektive Haftung nach 4 h getrennt. Entfernen Sie ungebundene und abgestorbene Zellen, indem Sie Medien entfernen. Angebundene Zellen mit 2 ml PBS waschen und 2–4 ml sterile Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzufügen. Bei 37 °C bis zur Konvergung inkubieren. Wechseln Sie alle 2–4 Tage die Medien.
  2. Fibroblastisolation: FACS mit einem GFP-Reporter-Mausmodell (Abbildung 1)
    1. FACS-Puffer
      1. Bereiten Sie 15 ml von 5% fetalem Rinderserum (FBS) in dPBS ohne Ca2+ und Mg2+vor. Auf Eis oder bei 4°C aufbewahren.
    2. FC-Blockerlösung
      1. Bereiten Sie 0,5 L FC-Blocker (gereinigte Anti-Maus-CD16/CD32) in 25 l FACS (1:50 Verdünnung) vor. Pro Probe sind 25 L FC-Blockerlösung erforderlich. Auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
    3. Probenvorbereitung und Antikörperfärbung
      HINWEIS: Antikörperverdünnungen können im Voraus vorbereitet werden, aber dies kann Licht- oder Temperaturexposition riskieren.
      1. Bereiten Sie 7AAD oder Ghost Dye violett 510 vor, das ist 2x die erforderliche Verdünnung im FACS-Puffer. Siehe Tabelle 1 für Antikörper und Verdünnungen.
      2. 500.000 frisch isolierte Zellen in 25 L FC-Blockerlösung aussetzen, um eine unspezifische Bindung der FC-Antikörperregion an einen FC-Rezeptor zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
      3. Fügen Sie 7AAD oder Ghost Dye violett 510 Antikörper auf das endige Volumen von 25 l Zellsuspension. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
      4. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4°C.
      5. Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in Diedurchflusszytometrierohr.
    4. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
      HINWEIS: GFP-SMA Reportermäuse waren ein Beitrag von Dr. Ivo Kalajzic11. Diese Maus drückt GFP unter dem Alpha-Glattmuskelzell-Promotor aus. SMA wurde als Marker für aktivierte Fibroblasten (Myofibroblasten)12verwendet.
      1. Für aktivierte Fibroblasten (SMA, die Myofibroblasten ausdrücken) Isolation, induzieren Myokardinfarkt bei 12 Wochen alten GFP-SMA-Mäusen durch koronare Arterienligation. Opfern Sie die Mäuse 8-10 Tage nach der Verletzung.
      2. Nach der einzelzelligen Suspension aus den verletzten Mäuseherzen sortieren Sie sMA+ve Fibroblasten nach grünem fluoreszierendem Protein (GFP). Verwenden Sie unbefleckte, nicht verletzte Fibroblasten, um das Hintergrundsignal im GFP-Kanal nach der Kompensation einzustellen.
      3. Gate für lebende GFP+ve Zellen durch Gating für 7AAD-ve/GFP+ve Zellen oder Ghost Dye violett 510-ve/GFP+ve Zellen und sortieren GFP exemitenklich sMA+ve Myofibroblasten. Sammeln Sie die Zellen in Fibroblastenmedien.
  3. Fibroblastenisolation: magnetische Perlenisolierung von Fibroblasten (Abbildung 1)
    1. Ausgleichspuffer
      HINWEIS: Bereiten Sie immer einen neuen Puffer für Isolierungen vor.
      1. Bereiten Sie 0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS vor. Entgasen Sie den Puffer, indem Sie die Lösung rühren, während Sie ein Vakuum am Deckel des Behälters befestigen.
        HINWEIS: Rühren entfernt überschüssiges Gas aus der Lösung, die dann durch das Vakuum entfernt wird, so dass Blasen die Trennsäule bei der Verwendung nicht verstopfen.
    2. Magnetische Etikettierung: CD45+ hämatopoetische Zellen
      1. Zentrifuge isolierte Zellen von Mäuseherzen bei 500 x g für 5 min, dann entfernen Sie den Überstand.
      2. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Ausgleichspuffer wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
      3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie oben und setzen Sie das Zellpellet in 90 L Ausgleichspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen wieder auf. Fügen Sie 10 L CD45+ magnetische Perlen pro 1 x 107 Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und mindestens 15 min bei 4°C inkubieren.
      4. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 ml Gleichgewichtspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen, dann Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4°C.
      5. Überstand entfernen, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und bis zu 1 x 107 Gesamtzellen in 2 ml Ausgleichspuffer wieder aussetzen. Wenn mehr als 107 Zellen vorhanden sind, skalieren Sie den Puffer linear. Übergeben Sie Zellen durch einen 40-mm-Filter, um zu verhindern, dass Zellaggregationen die Trennsäulenmatrix verstopfen.
    3. Magnetische Trennung: CD45+ hämatopoetische Zellen
      1. Legen Sie die Trennsäule in das Magnetfeld eines geeigneten Separators und einer Ausgleichssäule mit mindestens 3 ml PBS.
      2. Sammeln Sie nicht beschriftete Zellen im Flowthrough (FT) und waschen Sie die Säule 3x mit 3 ml Ausgleichspuffer. Sammeln Sie Wähes mit FT. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen. Platzieren Sie die Säule auf einem 15 ml konischen Rohr.
      3. Spülen Sie magnetisch beschriftete CD45+ Zellen aus, indem Sie 5 ml Ausgleichspuffer auf die Säule pfeifen und die Zellen mit einem mit der Säule gelieferten Kolben fest eintauchen.
      4. Zentrifugeneluent sowie FT/Waschfraktionen bei 500 x g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    4. Magnetische Etikettierung und Trennung: CD31+ Endothelzellen
      1. Wiederholungsprotokoll für CD45+ magnetische Etikettierung und Trennung (Abschnitte 2.3.2–2.3.3), außer CD31+ magnetische Perlen verwenden, um mit dem FT zu inkubieren und Teile aus der CD45+ Isolierung zu waschen.
    5. Magnetische Etikettierung und Trennung: MEFSK4+ Fibroblasten
      1. Wiederholen Sie das Protokoll für CD45+ magnetische Etikettierung mit dem MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper anstelle von Magnetperlen. Zentrifugieren Sie die FT- und Wash-Teile aus der CD31+ Isolierung bei 500 x g für 5 min, dann entfernen Sie Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Ausgleichspuffer aus, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
      2. Fügen Sie 10 L MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper pro 1 x 107 Zellen hinzu. Mindestens 15 min bei 4 °C inkubieren.
      3. Waschen Sie MEFSK4-Antikörpergebundene Zellen, indem Sie 5 ml Ausgleichspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen hinzufügen, dann Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
      4. Entfernen Sie Überstand und Resuspend in Anti-APC-Perlen, mit dem gleichen Volumen von MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper verwendet. 15 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
      5. Zentrifugieren bei 500 x g für 10 min. Überstand entfernen, in 2 ml Gleichgewichtspuffer pro 1 x 107 Gesamtzellen wieder aufsetzen und mit der magnetischen Trennung fortfahren, wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.3.3). Magnetisch getrennte MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve Fibroblasten können für Reinheitsanalysen und andere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden.

3. Reinheits- und Funktionsanalyse der isolierten Fibroblastenpopulation

  1. FACS-Populationsreinheitsanalyse: SMA-GFP-Zellanalyse (Abbildung 2)
    1. Heben Sie frisch isolierte Zellen in 25 l fc Blockerlösung ab, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
    2. Optional: Fügen Sie 25 L 7AAD oder Ghost Farbstoff violett 510 zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
    3. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
    4. Pellet in 50 L FACS-Puffer resuspendieren. Cd31-PE-, CD45-APC- und AN2/NG2-Antikörper direkt zur Zellsuspension hinzufügen. 15 min auf Eis inkubieren (Tabelle 1).
    5. Waschen durch Erneutanhalten in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
    6. Fügen Sie Esel Anti-Ratte AlexaFluor 405 sekundären Antikörper zu den Zellen, die mit unkonjugierten primären Antikörper gekennzeichnet sind. 30 min auf Eis bebrüten.
    7. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
    8. Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in ein beschriftetes Durchflusszytometrierohr für die Strömungsanalyse.
      HINWEIS: Die FACS-Analyse zur Charakterisierung der Expression von MEFSK4-Antigen auf isolierte Fibroblasten wird in Abschnitt 3.3 beschrieben.
  2. Fibroblasten-Reinheitsanalyse: Immunfluoreszenz (Abbildung 3A)
    1. Samen 30.000 primäre Fibroblasten (P0-P1) pro Brunnen auf Decklippen in einer 24 Brunnenplatte und Kultur bis 80% konfluent platziert. Oder konzentrieren Sie sortierte CD45+ und CD31+ Zellen (30.000 Zellen pro Brunnen) auf einem Deckzettel von Cytospin bei 400 x x g (eine Methode, die verwendet wird, um Zellen direkt und gleichmäßig auf einen Deckzettel in einer 24-Well-Platte zu deponieren).
    2. Fix Zellen mit kaltem Aceton für 15 min. Waschen Sie 3x mal mit PBS.
    3. Blockrutschen in 10% Ziegenserum. Inkubationsschlitten mit primären Antikörpern über Nacht (Tabelle 2).
    4. Schlitten 3x in PBS waschen. Sekundärantikörper für 2 h inkubieren (Tabelle 2).
    5. Gegenfleck-Rutschen und mounten Sie mit einem Tropfen DAPI in langsam verblassenden Montagemedien.
  3. FACS-Populationsreinheitsanalyse: MEFSK4-Sondierung (Abbildung 3B)
    1. Heben Sie frisch isolierte Zellen in 25 l FC-Blockerlösung aus, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
    2. Optional: Fügen Sie 25 L 7AAD oder Ghost Farbstoff violett 510 zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
    3. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
    4. Pellet in 50 L FACS-Puffer resuspendieren. Fügen Sie MEFSK4-Antikörper direkt zur Zellsuspension hinzu. 15 min auf Eis brüten (Tabelle 1).
    5. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
    6. Fügen Sie Ratte IgG-APC zu den Zellen hinzu (Tabelle 1). 30 min auf Eis bebrüten.
    7. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
    8. Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in Durchflusszytometrierohr für die Strömungsanalyse.
  4. Fibroblasten-Reinheitsanalyse: semiquantitative Echtzeit-rtPCR (Abbildung 3C)
    1. RNA-Isolation und semiquantitative Echtzeit-PCR
    2. Nach der Anreicherung von Fibroblasten kannen Sie RNA mit einem RNA-Isolationskit isolieren (siehe Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
    3. Vervollständigen Sie die DNA-Synthese des ersten Strangs mit einem cDNA-Synthesekit (siehe Tabelle der Materialien),die den Anweisungen des Herstellers folgend.
    4. Führen Sie semiquantitative Echtzeit-PCR5durch.
  5. Fibroblasten-Funktionsanalyse: Kollagen-Gel-Kontraktilitätstest (Abbildung 4)
    1. Kollagenlösung
      1. Bereiten Sie 20 mM HEPES und 44 mM NaHCO3 in DMEM vor. 1,67 mg Rattenkollagen typ 1 pro 1 ml DMEM mit HEPES und NaHCO3hinzufügen.
    2. TGF-ergänzung DMEM
      1. Bereiten Sie 10% FBS in DMEM mit Antibiotika und Anti-Pilz. Fügen Sie TGF zu einer Endkonzentration von 1 ng/ml hinzu.
    3. Zell/Kollagen-Mischung und Beschichtung
      1. Bereiten Sie die Zellsuspension (P3-P5) vor und bestimmen Sie das erforderliche Volumen, um 3,3 x 105 Zellen zu erhalten.
      2. Fügen Sie das Suspensionsvolumen mit 3,3 x 105 Zellen zu einer ausreichenden Kollagenlösung hinzu, um 1 ml Gesamtvolumen zu erhalten.
        HINWEIS: Die Konzentration von Rattenkollagen Typ 1 sollte jetzt 1,5 mg/ml betragen.
      3. In einer 48-Well-Platte, Samen 300 l Zell-Kollagen-Mix pro Brunnen (ca. 1 x 105 Zellen/ Well). Bei 37 °C für 15–20 min inkubieren, bis gegelt wird.
      4. Verwenden Sie eine 30 G Nadel, um Gel von den Brunnenwänden zu trennen. Fügen Sie jedem Brunnen 600 L TGF und FBS hinzu, die DMEM ergänzen. Bildschilder auf einem reflektierenden Scanner bei 24 h und 48 h.
        HINWEIS: Alle Immunfluoreszenzexperimente wurden an einer Durchflusszytometriemaschine durchgeführt, die mit drei Lasern (405 nm, 488 nm und 640 nm) ausgestattet ist. Die Daten wurden mit Hilfe einer Flow Data Acquiring Software (Tabelle der Materialien) erfasst. Weitere Datenanalysen wurden mit einer Flow-Data-Analyse-Software durchgeführt. AlexaFluor 405 und Ghost Dye Violet 510 wurden mit dem 405 nm Laser begeistert und mit einem 450/50 BP bzw. 525/50 BP Filter gesammelt. GFP und PE wurden durch den 488 nm Laser begeistert und mit den Filtern 530/30 BP bzw. 575/26 BP gesammelt. Entweder APC oder AlexaFluor 647 wurde durch den 640 nm Laser begeistert und mit einem 670/14 BP Filter gesammelt. Alle Zellsortierungsexperimente wurden an einer Durchflusszytometriemaschine(Materialtabelle) durchgeführt, die mit vier Lasern (405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm) ausgestattet war. 7-AAD wurde mit dem 561 nm Laser aufgeregt und mit einem 670/14 BP Filter gesammelt. GFP und Ghost Dye Violet 510 wurden mit den gleichen Laser/Filter-Kombinationen wie oben beschrieben gesammelt. Alle Sortierexperimente nutzten eine 100 Umdüse mit einer 17 psi Druckkonfiguration für eine erhöhte nachgeschaltete Lebensfähigkeit der Zielzellen.

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Ergebnisse

Strömungs-Gating-Schema demonstriert Myofibroblast-Isolation mit SMA-GFP-Reportermäusen
Unverletzte Herzen zeigten keine nachweisbaren GFP+ Zellen im Mausmodell des SMA-GFP-Reporters; Daher wurden sie verwendet, um ein Tor für das Hintergrundsignal des GFP-Kanals nach der Kompensation zu errichten (Abbildung 2). SMA+ Zellen wurden auf der Grundlage des Vorhandenseins der GFP-Expression aus dem verletzten linken Ventrikel 10 Tage nach MI sortiert. Ein...

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Diskussion

Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die durch verschiedene Marker identifiziert werden. Die Proteinmarker, die verwendet wurden, um Fibroblasten zu identifizieren, sind Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2), Fibronectin, Vimentin, Kollagen I und III und Thy115,,16,17,18,19,20. Während Vimentin verwendet wurde, u...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Ivo Kalajzic für die SMA-GFP-Mäuse danken. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (NIH) unter der Award-Nummer R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering des NIH unterstützt. unter Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) und Scientist Development Grant der American Heart Association unter Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow-Zytometrie-Analysen wurden am VUMC Flow Cytometry Shared Resource durchgeführt, das vom Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und dem Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404) unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
Aceton
Antimykotikum (Amphotericin B-solubilisiert; Fungizone)Sigma AldrichA9528
Rinderseriumalbumin (BSA)Sigma9048-46-8
(Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI Wasser
DI-Wasser
DMEM-F12 mit L-Glutamin und HEPESLife-Technologien11330057
Dnase I(20U/mL)BioRad7326828
Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung (dPBS) ohne Ca2+ und Mg2+Gibco13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (gereinigt Anti-Maus-CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Fötales Rinderserum (FBS)Life technologies16000044
10% Ziegenserum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit Ca2+ und Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Puffer PulverSigmaK3753
Mykoplasmen-Prophylaxe (Plasmocin)Invivogenant-mpp
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
10x Lysepuffer für rote BlutkörperchenMiltenyi130-094-183
Einbettmedienmit langsamem Verblassen
Natriumazid
Natriumbicarbonat
TGFβ
Trypanblauer Farbstoff (0,4%)Gibco15250-061
Typ 1 Rattenkollagen
Antikörper
7AAD (Lagerbestand: 1 mg/ml Lösung in DMSO)Molekulare SondenA1310Verdünnung = 1:1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864Verdünnung = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373Verdünnung = 1:200; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370Verdünnung = 1:250; RRID = AB_394816
CD45BD Biosciences553076Verdünnung = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α 1MD Bioprodukte203002Verdünnung = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulierung: 1 μl/Test in DMSO)Tonbo Biosciences13-0870Verdünnung = 1:1000; RRID =
Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488Molekulare SondenA11029Verdünnung = 1:200; RRID = AB_138404
Ziege Anti-Kaninchen-Cy3Southern Biotech4050-02Verdünnung = 1:200; RRID = AB_2795952
Ziege Anti-Kaninchen-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152Verdünnung = 1:200; RRID = AB_2307443
Anti-Ratte Alexa Fluor 488Molekulare SondenA11006Verdünnung = 1:200; RRID = AB_2534074
Anti-Ratte Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247Verdünnung = 1:200; RRID = AB_141778
PeriostinSanta CruzSC67233Verdünnung = 1:100; RRID = AB_2166650
VimentinSigma AldrichV2258Verdünnung = 1:200; RRID = AB_261856
α-Aktin der glatten Muskulatur (αSMA)Sigma AldrichA2547Verdünnung = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblasten-spezifisches Protein 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274Verdünnung = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetische KügelchenMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 Magnetische KügelchenMiltenyi Biotec130-087-418
Anti-Feeder-Zellen-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900Verdünnung = 1:100; RRID = AB_2660619
Anti-APC-PerlenMiltenyi Biotec130-090-855
Ratten-IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034Verdünnung = 1:100; RRID = AB_2661598
Esel Anti-Ratte Alexa Fluor405Abcamab175670Verdünnung = 1:100
Anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455Verdünnung = 1:11; RRID = AB_2651235
Andere Materialien
0,22 & Mikro; m FilterThermo Scientific723-2520
10 cm2 ZellkulturschaleCorning430167
10 mL PipetteFisherbrand13-678-11E
40 & Mikro; m ZellsiebFisherbrand22363547
5 mL PipetteFisherbrand13-678-11D
50 mL Konisches RöhrchenFalcon352070
6-Well-PlatteCorning3506
Durchflusszytometrie-RöhrchenFalcon352058
Zangenwippe
Einschneidige KlingePAL62-0177
Chirurgische Schere
GFP-αSMA Reporter Mäuse
MACS Separator Magnetfeld
MACS Trennsäule
Deckgläser
Qaigen Rneasy Mini KitQaigen74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation KitAmbionAM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis KitBioRad1708891
48-Well-Platte
30G Nadel
3 Laser-Durchflusszytometrie-Gerät (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 Laser Flow Zytometrie-Gerät (BD FACSAria III)BD Biosciences
Software zur Erfassung von Durchflussdaten (BD FACSDiva Software v8.0a)BD Biosciences
Software zur Analyse von Durchflussdaten (FlowJo Software)BD Biosciences
Calciumchlorid-Citrat-Puffer-Kollagenase-Mischung

Referenzen

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