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Methodenartikel

Schneiden und Culieren von Schweineherzen unter physiologischen Bedingungen

17.6K Ansichten

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DOI:

10.3791/60913

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20. März 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Department of Medicine, University of Louisville, 2Department of Bioengineering, University of Louisville, 3Diabetes and Obesity Center, Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 5Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester, 6Faculty of Pharmacy, Zagazig University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie herzgewebe unter physiologischen Bedingungen für 6 Tage geschnitten und kultiviert werden kann. Dieses Kultursystem könnte als Plattform für die Prüfung der Wirksamkeit neuartiger Herzinsuffizienz-Therapeutika sowie als zuverlässige Spross enderatonie Tests der akuten Kardiotoxizität in einem 3D-Herzmodell verwendet werden.

Zusammenfassung

Viele neuartige Medikamente scheitern in klinischen Studien an kardiotoxischen Nebenwirkungen, da die derzeit verfügbaren In-vitro-Assays und In-vivo-Tiermodelle die menschlichen Herzverbindlichkeiten schlecht vorhersagen, was eine milliardenschwere Belastung für die pharmazeutische Industrie darstellt. Daher besteht weltweit ein weltweit unerfüllter medizinischer Bedarf an besseren Ansätzen zur Identifizierung der Kardiotoxizität von Arzneimitteln, bevor kostspielige und zeitaufwändige "First in Man"-Studien durchgeführt werden. Derzeit werden nur unreife Herzzellen (menschliche induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten [hiPSC-CMs]) verwendet, um die therapeutische Effizienz und Arzneimitteltoxizität zu testen, da sie die einzigen menschlichen Herzzellen sind, die über einen längeren Zeitraum kultiviert werden können. Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität zu testen. Ein einzelner Zelltyp kann jedoch nicht den Phänotyp des komplexen 3D-Herzgewebes replizieren, das aus mehreren Zelltypen besteht. Wichtig ist, dass die Wirkung von Medikamenten an erwachsenen Kardiomyozyten getestet werden muss, die im Vergleich zu unreifen hiPSC-CMs unterschiedliche Eigenschaften und Toxizitätsreaktionen aufweisen. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten multizellulären System, das das menschliche Herzgewebe imitiert und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards widerspiegelt. Kürzlich haben wir durch die Optimierung der Kulturmedienkomponenten und der Kulturbedingungen, um eine kontinuierliche elektrische Stimulation bei 1,2 Hz und die intermittierende Sauerstoffversorgung des Kulturmediums einzubeziehen, ein neues Kultursystem-Setup entwickelt, das die Lebensfähigkeit bewahrt. und Funktionalität von Menschen- und Schweineherzscheiben für 6 Tage in der Kultur. Im aktuellen Protokoll beschreiben wir als Beispiel die Methode zum Schneiden und Kultivieren von Schweineherzen. Das gleiche Protokoll wird verwendet, um Scheiben von Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen zu kultiieren. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, das die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen schließt.

Einleitung

Drogeninduzierte Kardiotoxizität ist eine Hauptursache für Marktentzug1. Im letzten Jahrzehnt des20. Jahrhunderts wurden acht nicht-kardiovaskuläre Medikamente vom Markt genommen, da sie zu einem plötzlichen Tod aufgrund ventrikulärer Arrhythmienführten 2. Darüber hinaus können mehrere Anti-Krebs-Therapien (während in vielen Fällen wirksam) zu mehreren kardiotoxischen Wirkungen führen, einschließlich Kardiomyopathie und Arrhythmien. Beispielsweise können sowohl traditionelle (z. B. Anthracycline und Strahlung) als auch gezielte (z. B. Trastuzumab) Brustkrebstherapien bei einer Teilmenge von Patienten zu kardiovaskulären Komplikationen führen3. Eine enge Zusammenarbeit zwischen Kardiologen und Onkologen (über das entstehende Feld der "Kardio-Onkologie") hat dazu beigetragen, dass diese Komplikationen überschaubar sind, um sicherzustellen, dass Patienten effektiv behandelt werden können2. Weniger klar sind die kardiovaskulären Wirkungen neuerer Wirkstoffe, einschließlich Her2- und PI3K-Inhibitoren, insbesondere wenn Therapien in Kombination eingesetzt werden. Daher besteht ein wachsender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien für kardiovaskuläre Toxizitäten im Zusammenhang mit aufkommenden Krebstherapien vor klinischen Studien am Menschen. Die mangelnde Verfügbarkeit von Kultursystemen für menschliches Herzgewebe, das für mehr als 24 h funktionell und strukturell tragfähig ist, ist ein begrenzender Faktor für zuverlässige Kardiotoxizitätstests. Daher ist es dringend notwendig, ein zuverlässiges System zur Kultivierung menschlichen Herzgewebes unter physiologischen Bedingungen für die Prüfung der Arzneimitteltoxizität zu entwickeln.

Der jüngste Schritt hin zur Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) in Kardiotoxizitätstests hat eine partielle Lösung zur Lösung dieses Problems geliefert; jedoch sind die Unreife Natur der hiPSC-CMs und der Verlust der Gewebeintegrität im Vergleich zur mehrzelligen Natur des Herzgewebes wesentliche Einschränkungen dieser Technologie4. Eine aktuelle Studie hat diese Einschränkung teilweise überwunden, indem herzgewebe von hiPSC-CMs auf Hydrogelen hergestellt und sie im Laufe der Zeit einer allmählichen Zunahme der elektrischen Stimulation ausgesetzt wurden5. Ihre elektromechanischen Eigenschaften erreichten jedoch nicht die Reife, die im erwachsenen menschlichen Myokard beobachtet wurde. Darüber hinaus ist das Herzgewebe strukturell komplizierter, da es aus verschiedenen Zelltypen besteht, darunter Endothelzellen, Neuronen und verschiedene Arten von stromalen Fibroblasten, die mit einer sehr spezifischen Mischung von extrazellulären Matrixproteinen verbunden sind6. Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozyten-Zellpopulation7,8,9 im erwachsenen Säugetierherz ist ein großes Hindernis bei der Modellierung von Herzgewebe mit einzelnen Zelltypen. Diese großen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden, um kultur des intakten Herzgewebes für optimale Studien mit physiologischen und pathologischen Bedingungen des Herzens zu ermöglichen5.

Das Kultivieren menschlicher Herzscheiben ist ein vielversprechendes Modell für intaktes menschliches Myokard. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten 3D-Multizellularsystem, das dem menschlichen Herzgewebe ähnelt und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards zuverlässig widerspiegeln könnte. Jedoch, seine Verwendung wurde stark durch die kurze Zeit der Lebensfähigkeit in der Kultur begrenzt, die nicht über 24 h mit den robustesten Protokollen bis 2018berichtet 10,11,12. Diese Einschränkung war auf mehrere Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Verwendung von Luft-Flüssig-Schnittstelle, um die Scheiben zu kulturieren, und die Verwendung eines einfachen Kulturmediums, das die hohen energetischen Anforderungen des Herzgewebes nicht unterstützt. Wir haben vor kurzem ein Unterwasserkultursystem entwickelt, das in der Lage ist, kontinuierliche elektrische Stimulation zu bieten und die Kulturmedienkomponenten optimiert, um Herzgewebescheiben lebensfähig für bis zu 6 Tage13zu halten. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, um die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen zu schließen. Im aktuellen Artikel beschreiben wir das Protokoll zum Schneiden und Kultivieren der Herzscheiben am Beispiel eines Schweineherzens. Das gleiche Verfahren wird auf Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen angewendet. Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Technologie auf andere Laboratorien in der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu verbreiten.

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Protokoll

Alle tierischen Verfahren entsprachen den institutionellen Leitlinien der University of Louisville und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung für das Schneiden (ein Tag vor dem Schneiden)

  1. Vorbereitung des vibrierenden Mikrotomes
    1. Legen Sie die Keramikklinge in ihren Halter, indem Sie diese Schritte befolgen: Nachdem Sie die Klinge sorgfältig ausgepackt haben, legen Sie die scharfe Kante zuerst in den Schlitz des Klingenwerkzeugs. Passen Sie dann die Klinge in den Halter, indem Sie die beiden Schrauben an den Armen des Halters lösen und schieben Sie die Klinge unter jede Scheibe und schieben Sie sie fest nach hinten gegen die hinteren Anschläge. Ziehen Sie die Schrauben fest, um die Klinge zu befestigen.
      HINWEIS: Die Schrauben sollten nicht überzeinert werden.
    2. Kalibrieren Sie das Blatt mit dem Kalibrierprotokoll und den Werkzeugen gemäß dem Herstellerprotokoll.
      HINWEIS: Um die Ausrichtung der Klinge mit der Verfahrachse zu erleichtern und die Verformungen der Z-Achse zu minimieren, verwendet das vibrierende Mikrotom ein demontierbares Kalibriergerät. Wenn das Kalibriergerät an das Gerät angeschlossen wird, wird seine Anwesenheit automatisch erkannt, und das vibrierende Mikrotom übernimmt die Kontrolle über die Anpassung der Amplitude- und Frequenzeinstellungen des Blades auf eine Größe, die am besten die Einstellung des Blade-Ausrichtungsfehlers ermöglicht.
      1. Drücken Slice Sie die Slice-Taste, um den Ausrichtungsprozess zu starten, der die Klinge automatisch bewegt, so dass sich die Schneidkante in optimaler Position relativ zum Kalibriergerät befindet, um eine optimale Ausrichtungsauswertung zu ermöglichen. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Klinge mit dem mitgelieferten Schraubendreher zu justieren, um sicherzustellen, dass die Z-Ausrichtung innerhalb von 1 m liegt.
    3. Autoclave das innen bad und alle Metallteile des vibrierenden Mikrotome.
  2. Autoklavieren Sie die großen Metallschalen (zum Sammeln der Scheiben und Einweichen der elektrischen Stimulationsplattenabdeckungen), alle Glasbehälter, normale Rechteckklingen, Zangen, Scheren, Drucker-Zahnriemen (in 6 mm breite Stücke schneiden), Metallscheiben und 5 L doppelt destilliertes Wasser (ddH2O).
  3. Sterilisieren Sie ein 1 L Glas, ein 500 ml Glas und eine Kunststoffschale für das Herz in situ und in vitro Perfusion mit der kardiopesdiverlösungslösung.
  4. Bereiten Sie 2 L der Slicing Tyrodes Lösung in einem 2 L Becher vor.
    1. Für 1 L der Slicing Tyrode Lösung 3 g/L 2,3-Butandionmonoxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glukose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M Lösung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M Lösung), bis 1 L ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Filtern Sie dann die Lösung mit einem Vakuumfilter-/Speichersystem mit 1.000 ml, 0,22 m und lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
  5. Bereiten Sie 4 L der kardioplegischen Lösung vor.
    1. Für 1 L der kardioplegischen Lösung 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M Lösung), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL Heparin, bis zu 1 L ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Filtern Sie dann die Lösung mit einem Vakuumfilter-/Speichersystem mit 1.000 ml, 0,22 m und lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
      HINWEIS: Fügen Sie 1.000 U/L Heparin in Kardioplegie-Lösung am Tag des Schneidens hinzu (siehe Schritt 2.1).
  6. 500 ml Kulturmedium in der Originalflasche in einem Biosicherheitsschrank frisch zubereiten: Medium 199, 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS)-Ergänzung, 10% fetales Rinderserum (FBS), 5 ng/ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), 10 ng/mL FGF-basic und 2x antimykotisch mischen. Filter sterilisieren durch das 0,22 m, Vakuumfilter/Speichersystem und lagern bei 4 °C über Nacht.
    HINWEIS: PH nicht pH-Wert einstellen, VEGF und FGF vor Gebrauch frisch hinzufügen.
  7. Bereiten Sie 4% Agar-Gel-Platten vor.
    1. Fügen Sie 200 ml sterilisierte ddH2O in einem 500 ml sterilisierten Kolben hinzu. 8 g Agarose wiegen und sanft in den Kolben gießen. 2 min in der Mikrowelle kochen, dann 5 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
    2. 25 ml in je 100 mm Petrischale in einen Biosicherheitsschrank geben (6 Gerichte zubereiten) und 1 h erstarren. Dann die Platten mit Paraffinfolie versiegeln, mit sauberer Verpackung umwickeln und bei 4 °C lagern.
  8. Bereiten Sie 4 L 70% Ethanol vor, indem Sie das 200-prozentige absolute Ethanol in autoklavierten ddH2O verdünnen.
  9. 2x Antimykotik in sterilisiertem ddH2O vorbereiten: 980 ml sterilisiertes ddH2O mit 20 ml Antimykotik um 20 ml unter dem Biosicherheitsschrank mischen.

2. Schweineherz-Perfusion

  1. Fügen Sie 1 ml 1.000 U/ml Heparin zu jedem 1 L kardioplegischer Lösung hinzu. Halten Sie die Lösung auf Eis.
    HINWEIS: Mindestens 3 L werden für die Durchblutung und Erhaltung des Herzens während des Transfers in den Gewebekulturraum benötigt.
  2. Nehmen Sie folgende Gegenstände mit in den Schweine-Opastube: ein großer Eiskübel voller Eis, ein sterilisiertes Metalltablett (auf Eiskübel für Herzperfusion halten), ein sterilisiertes 500 ml Glas, ein 1 L Glas (um das Herz in Kardioplegielösung zurück in den Gewebekulturraum zu übertragen , auf Eis) und eine sterilisierte Plastikschale voller Eis (um kardioplegische Lösung auf Eis zu halten).
  3. Bereiten Sie ein in-situ-Herzperfusionssystem vor, das einen 3-Wege-Stopphahn, eine 60 ml Spritze, einen 18 G-Schmetterlingsnadelkatheter und Verlängerungsschläuche zum kardioplegischen Lösungsreservoir enthält.
  4. Anästhetisieren Sie das Yorkshire-Männchenschwein (2 x 3 Monate alt, 20 bis 25 kg) zuerst mit einer intramuskulären Injektion eines Ketamin-Cocktails (20 mg/kg)/Xylazin (2 mg/kg). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch den Verlust der Kieferspannung. Dann das Schwein in den Operationssaal bringen, intubieren und mechanisch belüften die Lunge wie zuvor beschrieben14.
  5. Anästhesie pflegen mit (1,5 bis 2%) Isofluran.
  6. Legen Sie das Tier auf die rechte Seitenposition und rasieren Sie das Fell aus dem Brustbereich. Reinigen Sie die Haut mit Alkoholpeeling, dann sterilisieren Sie die chirurgische Stelle mit 10% (w /v) Povidon-Jod-Lösung.
  7. Öffnen Sie die Brust durch linken Thorakotomie-Inzision mit einem Skalpell am4. interkostalen Raum, und verwenden Sie einen Brust-Retraktor zwischen den Rippen, um die Brust offen zu halten und das Herz auszusetzen.
    HINWEIS: Verwenden Sie alle sterilisierten Instrumente für dieses Verfahren.
  8. Setzen Sie den Schmetterlingsnadelkatheter in das linke Atrium ein und fixieren Sie die Nadel mit einem Ringschnurverschluss. Nach intravenöser Injektion einer Bolusdosis von Heparin (100 U/kg) beginnen Sie, das Herz in situ mit 500 ml eiskalter kardioplegischer Lösung (zur Verlangsamung der Herzfrequenz) über den linken Vorhofkatheter zu durchdringen.
  9. Das Schwein mit 5% Isofluran tief anästhesieren. Schnell das Herz mit einer chirurgischen Schere aus der Brust herausnehmen. Die Aorta mit einer Aortenkanüle anschnallen und das Herz in vitro mit weiteren 1 L eiskalter kardionlegischer Lösung (100 ml/min) durchdringen, um Vaskulaturblut auszuspülen.
  10. Nach der Herzdurchblutung das Herz in einem 1 L Glas mit eiskalter Kardioplegielösung gefüllt und während des Transfers in den Gewebekulturraum auf Eis halten.

3. Schwein Herz Gewebe Schneiden

  1. Richten Sie das Gewebebad auf dem Vibratom ein, fügen Sie Eis in die Kühljacke des Gewebebades ein, und fügen Sie dann Tyrodes Lösung in das Gewebebad ein. Richten Sie 1 L Kunststoffglas ein, um die Entsorgung von geschmolzenem Eis aus der Gewebebadekühljacke zu sammeln.
  2. Übertragen Sie das Schweineherz unter dem Biosicherheitsschrank in ein Tablett mit 1 L frischer, kardionlegischer Lösung.
  3. Sezieren Sie das Herz, um den linken Ventrikel mit versenkbaren sterilen Skalpellen zu isolieren. Schneiden Sie dann die linke Herzkammer mit Rasierklingen in Blöcke von je 1 x 2 cm3. Verwenden Sie ein Stück zum Schneiden und halten Sie die restlichen Teile in einem 50 ml Rohr in kalt Tyrodes Lösung auf Eis zum Schneiden später, falls erforderlich.
    HINWEIS: Massieren Sie das Gewebe vor dem Schneiden mit den Händen, vor allem, wenn dies der zweite Block ist. Massieren hilft, die richtige Muskelfaserkonfiguration wiederherzustellen und verhindert steife Innerhalb des Herzblocks.
  4. Fügen Sie 1-2 Tropfen Gewebekleber(Materialtabelle) in den Metallprobenhalter und kleben Sie ein Stück des 4% Agar-Blocks mit einer Oberfläche von ca. 1 cm2.
  5. Fügen Sie 1 bis 2 Tropfen Gewebekleber auf den Agar.
  6. Stecken Sie den Herzblock mit der Herz-Epikardie-Seite nach unten auf den Gewebekleber und stellen Sie sicher, dass er so flach wie möglich ist. Dann übertragen Sie den Gewebehalter mit dem Herzblock in seine Position im Schnittbad des Vibratome.
  7. Befestigen Sie das Sauerstoffrohr am Schneidbad und das mit Tyrodes Lösung gefüllte Metalltablett zum Sammeln der Scheiben (sauerstoffhaltiges Tyrodes Bad). Fügen Sie dann 40 m Zellsiebe in das Metallfach, um die Scheiben nach dem Schneiden zu sammeln.
  8. Anpassen der Schneidposition
    1. Passen Sie mit der Vibratom-Bediensoftware und dem Armaturenbrett die Höhe des Blades/der Probe an. Wählen Sie die Höhentaste aus und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Höhe anzupassen. Im Idealfall haben Sie die Klinge in der Nähe der Oberseite des Gewebes, aber unter den Papillarmuskeln und stellen Sie sicher, dass flüssigkeit das Gewebe und die Klinge vor dem Schneiden bedeckt.
    2. Passen Sie an, wo mit dem Schneiden des Gewebes begonnen werden soll, indem Sie die Vorschubtaste auswählen. Drücken Sie die Scheibentaste und erhöhen Sie die Geschwindigkeit mit dem Knopf, um die Klinge in Richtung der Kante des Gewebes zu bewegen. Drücken Sie dann erneut die Scheibe, um anzuhalten, und drücken Sie die Vortaste, um den Vorgang zu deaktivieren.
    3. Passen Sie die Schnittparameter an: Vorgeschwindigkeit = 0,03 mm/s, Vibrationsfrequenz = 80 Hz und horizontale Schwingungsamplitude = 2 mm. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden, indem Sie die Slice-Schaltfläche auswählen.
    4. Lassen Sie das Vibratome in Scheiben schneiden, bis es das Ende des Gewebes erreicht, aber bevor es das hintere Ende des Probenhalters trifft. Drücken Sie an dieser Stelle erneut die Scheibe, um anzuhalten. Drücken Return Sie die Return-Taste, um zur Startposition zurückzukehren.
    5. Wählen Sie die automatische Wiederholung (zweimal darauf klicken), sodass das vibrierende Mikrotome den Schneidvorgang bis zu 99 Mal automatisch wiederholen kann.
  9. Sammeln von Slices
    1. Warten Sie, bis die Scheiben in voller Länge sind und gut erscheinen (nachdem Sie die Papillenmuskelschichten hinter sich lassen), und beginnen Sie dann, die Scheiben zu sammeln.
    2. Sammeln Sie die Scheiben mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff, die mit der kalten Tyrodes-Lösung gefüllt ist, um das Gewebe vorsichtig aus dem Bad zu greifen. Verwenden Sie bei Bedarf Zangen und Federscheren, um die Scheibe vom Herzblock zu trennen, wenn das Gewebe noch befestigt ist.
    3. Übertragen Sie die Scheibe auf ein Zellsieb im sauerstoffhaltigen Tyrodesbad (siehe Schritt 3.7) und verwenden Sie die Flüssigkeit in der Kunststoff-Pasteur-Pipette, um das Gewebe flach auf einem der Zellsiebe liegen zu lassen, und fügen Sie dann eine Metallscheibe auf der Oberseite hinzu, um das Gewebe zu halten.
      HINWEIS: Die Scheiben müssen vor der Verarbeitung mindestens für 1 h in der Tyrodeslösung inkubiert werden (dies ist für das BDM, um das Gewebe zu entspannen).

4. Culturing Heart Slices

  1. Vorbereiten der Slices für die Kultur
    1. Schneiden Sie die Scheibe von den Rändern, um unebene Kanten zu vermeiden. Dann kleben Sie es von beiden Enden auf sterilisierte Polyurethan 6 mm breiten Drucker Zahnriemen mit Metalldrähten mit Gewebekleber eingebettet.
    2. Übertragen Sie die unterstützten Herzscheiben auf 6 Brunnenplatten, die jeweils 6 ml Kulturmedium enthalten.
    3. Legen Sie die Stimulationsplattenabdeckung (Materialtabelle) auf die Oberseite der 6 Brunnenplatte und verbinden Sie die Abdeckung mit dem elektrischen Stimulator der Zellkultur (Materialtabelle). Stellen Sie den Stimulator ein, um die Herzscheiben bei 10 V, 1,2 Hz kontinuierlich ständig zu stimulieren.
      HINWEIS: Nach dem Einstecken der Stimulation beginnen die Herzscheiben zu schlagen, und diese Bewegung wird visuell offensichtlich sein.
    4. Die Platten auf einen Inkubator übertragen und bei 37 °C mit befeuchteter Luft und 5%CO2lagern.
  2. Ändern Sie kulturmedium 3x pro Tag und fügen Sie 6 ml Kulturmedium pro Brunnen während jeder Medienänderung hinzu.
    HINWEIS: Kulturmedium wird vor jedem Medienwechsel 5 min sauerstoffhaltiger Sauerstoff versorgt. Medium muss mindestens 1x pro Tag gewechselt werden; dies ist am Wochenende in Ordnung, wenn nötig. Zwei Tage mit nur 1 Medienwechsel pro Tag ist das Maximum, das getestet wird.
  3. Ändern Sie die Stimulationsplattenabdeckung jeden Tag, um die Freisetzung toxischer Graphitpartikel im Kulturmedium zu verhindern (in der Regel während des Medienwechsels am Mittag).
    1. Entfernen Sie die Stimulationsplattenabdeckung aus der Kulturschale und setzen Sie den weißen Schaumstoffstecker ein, an dem die Abdeckung mit dem Kabel für den elektrischen Stimulator der Zellkultur verbunden ist, um Wasserschäden am Stromkreis zu verhindern.
    2. Legen Sie die Plattenabdeckung in ein Bad aus autoklaviertem Wasser mit 2x Antimykotika. Halten Sie es in diesem Bad (d.h. Spülbad) über Nacht.
    3. Am nächsten Tag die Plattenabdeckung in ein 70% Ethanolbad für 5-15 min bewegen, um sich zu dekontaminieren. Schütteln Sie vor dem Badwechsel so viel Flüssigkeit vom Gerät ab.
    4. Dann die Plattenabdeckung in das dritte und letzte Bad (d.h. sauberes Bad) übertragen, das aus autoklaviertem Wasser und 2x antibakteriell-antimykotisch besteht, um alle verbleibenden Ethanolspuren zu spülen.
    5. Nach dem Spülen der Plattenabdeckung im sauberen Bad, verwenden Sie ein sauberes fusselfreies Tuch (mit Ethanol besprüht), um Restwasser auf den Kunststoffteilen auszutrocknen, dann entfernen Sie das weiße Schaumstück und legen Sie den Plattendeckel vorsichtig wieder auf die Kulturplatte.
      HINWEIS: Berühren Sie nicht die schwarzen Graphitelektroden, die in den Brunnen gelangen, da das Gerät nicht mehr steril ist.
    6. Mit sterilen Zangen, stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der Mitte des Brunnens ist, so dass die Plattenabdeckung das Gewebe nicht berührt. Stellen Sie sicher, dass die gekrümmte Seite der Plattenabdeckung mit der abgewinkelten Seite der Platte übereinstimmt und dass sich die quadratischen Ecken anrichten.
      HINWEIS: Um die Kontamination der Stimulationsplattenabdeckungen zu minimieren, halten Sie sie nach Abschluss des Experiments in sauberen und leeren 6 Brunnenplatten auf.
  4. Führen Sie einen MTT-Assay, Kalziummessungen und kontraktile Funktionsbeurteilungen an frischen Schweineherzscheiben (Tag 0) und nach 6 Tagen in Kultur nach Ou et al.13durch.

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Ergebnisse

Mit einem handelsüblichen elektrischen Zellkultur-Stimulator, der acht 6 Wellplatten gleichzeitig aufnehmen kann, emulierten wir das erwachsene Herzmilieu, indem wir elektrische Stimulation bei der physiologischen Frequenz (1,2 Hz) induzieren, und für die grundlegenden Mediumkomponenten abgeschirmt werden, um die Dauer funktioneller Schweineherzscheiben in Kultur13zu verlängern. Da Schweine- und Menschliche Herzen in Größe und Anatomie15ähnl...

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Diskussion

Hier beschreiben wir das detaillierte Videoprotokoll für unsere kürzlich veröffentlichte Methode für vereinfachten Mittleren Durchsatz (Prozesse bis zu 48 Slices/Gerät), die die Kultur von Schweineherzscheiben für einen Zeitraum ermöglicht, der ausreichend lang ist, um die akute Kardiotoxizität zu testen13. Die vorgeschlagenen Bedingungen imitieren die Umgebung des Herzens, einschließlich der Häufigkeit der elektrischen Stimulation, der Verfügbarkeit von Nährstoffen und der intermittierenden Sauer...

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Offenlegungen

TMAM hält Beteiligung an Tenaya Therapeutics. Die anderen Autoren berichten von keinen Konflikten.

Danksagungen

TMAM wird durch den NIH-Zuschuss P30GM127607 und den Zuschuss der American Heart Association 16SDG29950012 unterstützt. RB wird von P01HL78825 und UM1HL113530 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1.000 ml, 0,22 & Mikro; m, Vakuumfilter/-speichersystemeVWR28199-812
2,3-Butandion-Monoxim (BDM)FisherAC150375000
500 mL, 0,22 µ m, Vakuumfilter/SpeichersystemeVWR28199-788
6-Well-C-Dish-Abdeckung (elektrische-Stimulationsplattenabdeckung)Ion OptixCLD6WFC
6-Well-PlattenFisher08-772-1B
AgaroseBioline USABIO-41025
Antibiotikum-AntimykotikumThermo15-240-062
C-Pace EM ( Ion OptixCEP100
Calciumchlorid (CaCl2)FisherC79-500
Keramikklingen für vibrierende MikrotomeCampden Instruments7550-1-C
Cooley BrustaufrollerMillennium Surgical63-G5623
D-GlukoseFisherD16-1
Einweg-Skalpell #20Biologyproducts.comDS20X
Falcon Zellsiebe, steril, CorningVWR21008-952
Fötales RinderserumThermoA3160502
Graefe PinzetteFisherNC9475675
Heparin-NatriumsalzSigma-AldrichH3149-50KU
HEPESFisherBP310-1
Histoacryl BLUE GewebekleberAmazonhttps://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris FederschereFisherNC9019530
Iris gerade SchereFisher731210
Isofluran, USPPiramalNDC 66794-017-25
ITS Nahrungsergänzungsmittel für flüssige MedienSigma-AldrichI3146-5ML
Ketamin HCl (500 mg/10 ml)West-WardNDC 0143-9508
Magnesiumchlorid (MgCl2)FisherM33-500
Mayo SuperCut chirurgische SchereAROSurgical Instruments CorporationAROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's SaltsThermo11-150-059
SauerstoffreglerPraxair
Sauerstofftanks -Praxair
Plastic Pasteur PipettenFisher13-711-48
Kaliumchlorid (KCl)Fisher
Drucker ZahnriemenAmazonhttps://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Rasiermesser RechteckklingenFisher12-640
Rekombinant Mensch FGF basicR& D Systems233-FB-025/CF
Rekombinantes humanes VEGFF& T D Systems293-VE-010/CF
Einziehbare SkalpelleFisher22-079-716
Natriumbicarbonat (NaHCO3)FisherAC217125000
Natriumchlorid (NaCl)FisherAC327300010
vibrierendes MikrotomCampden Instruments7000 SMZ-2
Xylazin HCl (100 mg/ml)Heartland VeterinärbedarfNADA 139-236
AC193780010

Referenzen

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